细胞生物学实验技术(三)课件.ppt

1、第四节第四节 细胞实验技术细胞实验技术一、细胞核染色 细胞核染色用途细胞核染色用途 计数 支原体检测 分裂指数检测 主要是作为一种参照，免疫组化检测蛋白质、核基质或者细胞质骨架等细胞核染色细胞核染色 实验室常用的核染色剂有三种实验室常用的核染色剂有三种 PI:碘化丙啶碘化丙啶（propidium iodide）,不能通过活细胞膜不能通过活细胞膜，所以活细胞不能被染色，发红色荧光红色荧光 Hochst33342和和Hochst33258 两种能穿过细胞膜能穿过细胞膜，发蓝色荧光，可以染色活细胞和固定的细胞 Hochst33342有更强的亲脂性，更容易穿过细胞膜 支原体检测通常用Hochst332

2、58 DAPI:dihydrochloride 可穿透细胞膜的蓝色蓝色荧光染料DAPI染色的细胞核PI染色Hochst染色的细胞用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,PI染色(激光共聚焦显微镜照片)生物论坛,细胞营养液常常仍清亮但变黄细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓细胞生长变缓，部分细胞发，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。支原体污染表现 细胞核染色用途细胞核染色用途 计数 支原体检测 分裂指数检测 主要是作为一种参照，免疫组化检测蛋白质、核基质或者细胞质骨架等二、免疫组织化学技术二、免疫组织化学技术 免疫组

3、织化学技术 是应用免疫学基本原理免疫学基本原理抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性定性和定位定位的组织化学技术。按照标记物的种类可分为：免疫荧光法、免疫酶法，免疫铁蛋白法 免疫金法 放射免疫自影法等。用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,PI染色(激光共聚焦显微镜照片)生物论坛,原 理 免疫荧光法可分为以下三种免疫荧光法可分为以下三种 1直接法直接法 2间接法间接法 3双重免疫荧光法双重免疫荧光法 1直接法直接法 用荧光素荧光素标记的特异性抗体特异性抗体直接与相应的抗原抗原结合，以检查出相应的抗原成分。2间接法间接法 先用一级抗体（特异性抗体）与相应的抗原结合，

4、再用荧光素标记的二级抗体（间接荧光抗体）与一级抗体相结合，形成抗原抗原一特异性抗体特异性抗体一间接荧光抗体间接荧光抗体的复合物。在此复合物上带有比直接法更多的荧光抗体，所以，此法较直接法灵敏。3双重免疫荧光法双重免疫荧光法 同一样品需要检测两种抗原时，可利用不同颜色的荧光素分别标记。抗体（antibody）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中 对于相同的物种，抗体的结构即相似又有不同。抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长的重链（H链）；2条较短的轻链

5、（L链）。轻链有和两种，重链有、和五种。整个抗体分子可分为恒定区恒定区和可变区可变区两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。序列。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区高变区。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2 3个。高高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片

6、（antigen-binding fragment,Fab）。Y的柄部称结晶片段（crystalline fragment,FC），糖结合在FC 上。标记的二抗是抗某个物种球蛋白抗体，有种的特异性种的特异性，如抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，二抗是普适抗体普适抗体，用于该物种所有一抗。间接法间接法一抗和二抗的选择：通常选择异源抗体异源抗体，比如，检测的是小鼠检测的是小鼠一抗一抗：大鼠，兔，羊（一抗是特异的抗体）二抗二抗：X抗大鼠、X抗兔、X抗羊（普适抗体）小鼠小鼠OCT4蛋白蛋白-OCT4一抗（大鼠）一抗（大鼠）-兔抗大鼠二抗大鼠二抗小鼠小鼠Nanog蛋白蛋白-Nanog一抗（大鼠

7、一抗（大鼠）-羊抗大鼠二抗大鼠二抗胚胎干细胞Oct-4 staining免疫双标二抗的免疫双标二抗的封闭血清封闭血清选择和二抗的选择和二抗的种属来源种属来源选择选择 组织：小鼠一抗：A（大鼠抗小鼠），B（兔抗小鼠）二抗：A（羊抗大鼠），B（羊抗兔）这种是最常见的，也是最简单易行的。此时做荧光双标较理想，如二抗A选择羊抗小鼠的Cy2(绿光),二抗B选择羊抗兔的Cy3（红光）。一般来说，此种情况下，两个一抗可以一起孵育，两个二抗也可以一起孵育。封闭液就选择针对二抗的羊血清。一般是用10%normal goat serum 30min 37度。这种情况 选 羊的 或者驴血清 都可以。1.免疫双标做得

8、好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应 2.封闭液的选择 封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液 1/1000的明胶免疫荧光基本实验步骤：免疫荧光基本实验步骤：（1）细胞准备。细胞准备。在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，（2）固定固定。通常用多聚甲醛多聚甲醛固定细胞。固定的目的杀死细胞，并保持细胞完整杀死细胞，并保持细胞完整的结构的结构，

9、多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团通过自由氨基酸基团形成分子间桥连形成分子间桥连，从而产生一种相互连接的网络结构网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构保持细胞的结构。（3）通透通透。通透通常选用TritonX100。通透剂一般都是去垢剂，它能溶解脂能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性质，以增加抗体对细胞膜的通透性。，通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤35 min.（4）封闭。封闭。封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，通常使用BSA（牛血清白蛋白）（5）一抗结合一抗结合。室温孵育1h或者4过夜。（6）二抗结合二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育（7）封片及检

10、测封片及检测。滴加封片剂（防淬灭剂）一滴，封片，荧光显微镜检查。常用的荧光素常用的荧光素 异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素（fluorecein isothiocyante，FITC），分子量为389，最大吸收光谱为490495，最大发射光谱为520530urn，呈绿色荧光绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。四甲基异氰酸罗达明四甲基异氰酸罗达明（tetrametrylrhodarnine isothiocyante，TRITC）是罗达明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光谱550urn，最大发射光谱620urn,呈橙红色橙红色荧光，与FITC发射的绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。免疫荧

11、光法优缺点免疫荧光法优缺点 优点优点：具有抗原抗体反应的特异性特异性，染色技术的快速快速性性，在细胞或组织上定位的准确性准确性，以及荧光效应的灵敏性灵敏性等优势。缺点缺点：由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。Oct-4 staining用抗-tubulin抗体染色显示微管(绿色);细胞核:红色,PI染色(激光共聚焦显微镜照片)生物论坛,四、细胞爬片 1先用自来水冲洗，2再泡酸24小时，3自来水洗掉残留酸后，双蒸水洗3遍，4再用100酒精泡过夜5 37度烘箱烘干，6烘干后

12、的玻片放培养皿中高压消毒灭菌即可用了。操作时要一片一片来，不然很容易粘在一起取不下来。如果想促进细胞贴壁，可以用鼠尾胶原或者多聚赖氨酸处理。如果经费充裕，可以考虑买fisher的产品。1/1000的明胶三、细胞核型分析 目的 基因物理定位 遗传疾病诊断 亲缘关系判定 细胞是否异常核型模式图五、细胞核型分析 操作 中期细胞的获得：培养的细胞或者组织中分离的细胞（秋水仙素）低渗：Kcl 固定：甲醇：冰乙酸（3：1）滴片 染色：Gimsa 镜检 分析或计数六、细胞活力测定及计数方法六、细胞活力测定及计数方法 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升

13、细胞数表示计数结果以每毫升细胞数表示。总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力细胞活力，由组织中分离细胞组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。利用染料会渗入死细胞染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue(台盼蓝)染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。现在也有PI和Hochst，PI不能透过活细胞膜，但是Hochst可以。染色死细胞细胞计数 方法 血细胞计数板 流式细胞仪细胞密度（个/m

14、l）（4个大格细胞总数/4）10（10的4次方）每个大正方形之体积为1.0 x 10 ml 操作：操作：1.把细胞制成合适浓度的悬液，充分混匀后立即观察。2.把洗干净并且干燥的计数板和盖玻片放好，盖玻片放在计数板上。3.取细胞悬液，滴在盖玻片边缘，让悬液渗进去注意：注意：1，压线的细胞记上不记下、记左不记右2，抱团的细胞记成一个3，抱团的细胞超过10%需重新打散后再记4-4细胞计数板获得的细胞数目的结果是大概的值，要想绝对计数需要使用流式细胞仪流式细胞仪。流式细胞仪（流式细胞仪（flow cytometer）流式细胞仪是对悬浮状态的细胞逐个计数并记录其有关参数的细胞分析仪器,因其测量速度快,在

15、很短时间内可以分析大量细胞,并能测出多个参数,在临床上有广泛的应用流式细胞仪能测量细胞的五个参数五个参数：前向角散射光（FSC）、侧向角散射光(SSC)、绿色荧光、黄色荧光、和红色荧光。FSC和SSC是细胞对激发光的散射信号,分别反映了细胞的大小大小和细胞细胞的粒度。细胞越大,胞内颗粒越多,则FSC和SSC越强.原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。