细菌学检验-14-螺旋体课件.ppt

1、（Spirochaete）u定义定义：是一类细长，柔软，：是一类细长，柔软，螺旋状，运动活泼螺旋状，运动活泼的的原核细胞型微生物。原核细胞型微生物。u结构结构：与细菌相似，如有细胞壁、原始核，以二：与细菌相似，如有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感等，但分裂方式繁殖，对抗生素敏感等，但无鞭毛无鞭毛。u分布分布：存在于水、土壤、腐败有机物；寄生于动：存在于水、土壤、腐败有机物；寄生于动植物、正常人口腔、正常阴道偶见。植物、正常人口腔、正常阴道偶见。u致病性螺旋体致病性螺旋体：主要有：主要有钩端螺旋体属、疏螺旋体钩端螺旋体属、疏螺旋体属、密螺旋体属属、密螺旋体属等等3 3个属。个属。A

2、 A密螺旋体属密螺旋体属B B钩端螺旋体属钩端螺旋体属C C疏螺旋体属疏螺旋体属u螺旋细密和规则螺旋细密和规则(有几十个有几十个)，一端，一端/两端弯两端弯曲使菌体呈曲使菌体呈钩状钩状故名钩端螺旋体。故名钩端螺旋体。u问号钩端螺旋体：致病性。问号钩端螺旋体：致病性。u双曲钩端螺旋体：非致病性。双曲钩端螺旋体：非致病性。(一一)形态染色形态染色uG，但不易着色。常用，但不易着色。常用Fontana镀银染色镀银染色法，法，被染成被染成棕褐色棕褐色。u暗视野显微镜下可见暗视野显微镜下可见活泼运动、折光性强活泼运动、折光性强而成而成白色的钩端螺旋体。白色的钩端螺旋体。u轴丝轴丝紧紧缠绕在原生质圆柱体表

3、面呈螺旋状，紧紧缠绕在原生质圆柱体表面呈螺旋状，使钩端螺旋体活泼地沿长轴旋转运动。使钩端螺旋体活泼地沿长轴旋转运动。钩端螺旋体钩端螺旋体u营养要求较高，常用含营养要求较高，常用含1010兔血清的兔血清的柯索夫（柯索夫（KorthofKorthof）培养基）培养基（兔血清（兔血清除促进钩端螺旋体生长外，尚有中和除促进钩端螺旋体生长外，尚有中和代谢产物毒性的作用）。代谢产物毒性的作用）。u最适生长最适生长温度为温度为28283030，最适，最适pHpH为为7 7.2.27 7.6.6。u人工培养基中生长缓慢人工培养基中生长缓慢。在液体培养。在液体培养基中，分裂一次需基中，分裂一次需8 8lOhlO

4、h，培养一周培养一周左右，呈现为左右，呈现为半透明云雾状生长半透明云雾状生长（液（液面面1 1cmcm的部位最丰富的部位最丰富），但菌数仅相），但菌数仅相当于普通细菌的当于普通细菌的1 1/101/100/101/100。(1)(1)抗原分类抗原分类l属属特异性蛋白抗原特异性蛋白抗原只存在于钩体属中只存在于钩体属中l群群特异性抗原特异性抗原脂多糖脂多糖l型型特异性抗原特异性抗原多糖蛋白复合物多糖蛋白复合物l根据抗原性不同问号钩体分根据抗原性不同问号钩体分2525个血清群、个血清群、273273个血个血清型。我国已发现致病性钩体至少清型。我国已发现致病性钩体至少1919群，群，7474型。型。我

5、我国目前使用的问号钩端螺旋体参考株有国目前使用的问号钩端螺旋体参考株有1414群群1515型。型。(2)(2)DNADNA分类：问号状钩体分分类：问号状钩体分7 7个基因种个基因种u血清学分群和分型血清学分群和分型应用应用显微镜凝集试验显微镜凝集试验和和凝集素吸收凝集素吸收试验，问号状钩试验，问号状钩端螺旋体可分为端螺旋体可分为2525个血清群、个血清群、273 273 个血清型，其中个血清型，其中我国至少存在我国至少存在1919个血清群、个血清群、7474个血清型。我国目前个血清型。我国目前使用的问号钩端螺旋体参考株有使用的问号钩端螺旋体参考株有1414群群1515型。型。u对对热热抵抗力弱

6、，抵抗力弱，60、1min即死亡。即死亡。u0.2来苏、来苏、l：2000升汞、升汞、1石炭石炭酸酸经经1030min被杀灭。被杀灭。u对对青霉素青霉素敏感。敏感。u钩端螺旋体在夏秋季酸碱度中性的钩端螺旋体在夏秋季酸碱度中性的湿土或水湿土或水中可存活中可存活20天以上天以上，甚至数月之久，这在本，甚至数月之久，这在本菌的传播上有重要意义。菌的传播上有重要意义。引起人畜共患病，引起人畜共患病，鼠类和猪鼠类和猪是储存宿主。是储存宿主。u传染源和储存宿主：鼠类、猪等。传染源和储存宿主：鼠类、猪等。u动物感染动物感染-多不发病多不发病-在在肾脏肾脏长期繁殖长期繁殖-尿尿-排排出出-污染土壤和水源污染土

7、壤和水源(疫水、疫土疫水、疫土)。u传播途径：传播途径：接触接触疫水、疫土经口、皮肤粘膜感染。疫水、疫土经口、皮肤粘膜感染。u致病物质：致病物质：u溶血素溶血素 溶血；细胞毒因子；内毒素样物质溶血；细胞毒因子；内毒素样物质u所致疾病：引起所致疾病：引起钩端螺旋体病。钩端螺旋体病。u钩体可穿透钩体可穿透完整完整皮肤粘膜侵入机体，并引起钩体皮肤粘膜侵入机体，并引起钩体血症血症，产生如内毒素等物质，出现发热、头痛、，产生如内毒素等物质，出现发热、头痛、肌痛、眼结膜充血等肌痛、眼结膜充血等中毒症状中毒症状，患者有，患者有全身毛细全身毛细血管损伤血管损伤和微循环障碍，并引起和微循环障碍，并引起CNSCN

8、S、心、肺、肝心、肺、肝肾功能损害肾功能损害。u感染后感染后2 2周周螺旋体可随尿液排出。螺旋体可随尿液排出。u临床类型：由于血清型、毒力数量不同以及临床类型：由于血清型、毒力数量不同以及免疫水平差异，有以下类型免疫水平差异，有以下类型流感伤寒型；流感伤寒型；黄疽出血型；黄疽出血型；肺出血型；肺出血型；脑膜脑炎型；脑膜脑炎型；肾功能衰竭型；肾功能衰竭型；胃肠炎型等类型。胃肠炎型等类型。l临床类型：临床类型：黄疸出血型黄疸出血型 又称又称外尔病外尔病(Wells discase)Wells discase)败血症、出血、黄疸与肝肾损害等。败血症、出血、黄疸与肝肾损害等。流感伤寒型流感伤寒型 又称

9、又称沼泽热沼泽热(marsh fever)marsh fever)如流感或伤寒，较轻，内脏损害较少。如流感或伤寒，较轻，内脏损害较少。l出血出血是钩体病最常见的临床表现。是钩体病最常见的临床表现。l免免 疫疫 性性 l对对同一血清型同一血清型有有牢固牢固免疫力，免疫力，l主要为体液免疫。主要为体液免疫。特异性抗体特异性抗体(1 12 2w):w):调理，吞噬增强调理，吞噬增强 血流中血流中:被清除被清除 肾脏内肾脏内:不易被清除不易被清除 -尿中排菌尿中排菌:数周、数月、数年数周、数月、数年u标本采集标本采集u直接检查直接检查u暗视野显微镜暗视野显微镜:活菌活菌u镀银染色镀银染色:死菌死菌u分

10、离培养：分离培养：KorthofKorthof培养基培养培养基培养u动物试验：豚鼠动物试验：豚鼠u血清学试验：查抗体血清学试验：查抗体u钩端螺旋体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。钩端螺旋体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。u标本采集包括标本采集包括血液（发病血液（发病1 1周）、尿（周）、尿（2 2周）和脑脊液（脑膜周）和脑脊液（脑膜刺激症）刺激症），发病，发病早期早期(1(1周内周内)血液的阳性率血液的阳性率高，高，1 1周后周后尿和脑尿和脑脊液脊液等的阳性率高。等的阳性率高。u感染感染6 61010天取血可检出抗体，在病程第天取血可检出抗体，在病程第3 3或或4 4周

11、达最高水平，周达最高水平，此后抗体水平逐渐下降，血清学诊断则需在病程早期及恢复此后抗体水平逐渐下降，血清学诊断则需在病程早期及恢复期分别采集血清，作期分别采集血清，作双份血清试验双份血清试验。1取急性期病人血以取急性期病人血以4000rmin离心离心45-60min，取取1滴沉淀物置玻片上，加盖滴沉淀物置玻片上，加盖 玻片后作玻片后作暗视野检查暗视野检查。也可用。也可用Fontana 镀银染色法镀银染色法染色后观察。染色后观察。2核酸检测核酸检测 采用同位素或生物素、地高辛采用同位素或生物素、地高辛 标记的特异标记的特异DNA探针法，检出标本中钩探针法，检出标本中钩 端螺旋体的核酸，较培养法快

12、速、敏感。端螺旋体的核酸，较培养法快速、敏感。若先用若先用PCR技术先行扩增，再用探针确技术先行扩增，再用探针确 定，则敏感度更加提高。定，则敏感度更加提高。u取钩端螺旋体血症期的病人血液取钩端螺旋体血症期的病人血液2ml或发病或发病后 第后 第 2 周 的 无 菌 弱 碱 性周 的 无 菌 弱 碱 性 尿 沉 渣尿 沉 渣 接 种 于接 种 于Korthof培养基中，培养基中，28孵育，因系孵育，因系需氧生需氧生长，故靠近培养液面呈半透明雾状混浊长，故靠近培养液面呈半透明雾状混浊。u取培养物作暗视野检查，观察有无螺旋体取培养物作暗视野检查，观察有无螺旋体生长。连续观察生长。连续观察30d，如

13、无生长方判为阴性如无生长方判为阴性u动物是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用于动物是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用于有杂菌污染的标本。有杂菌污染的标本。u方法是将标本接种于方法是将标本接种于幼龄豚鼠或金地鼠腹腔幼龄豚鼠或金地鼠腹腔。接。接种种35d后，可用暗视野显微镜检查腹腔液；亦可后，可用暗视野显微镜检查腹腔液；亦可在接种后在接种后36d取心血检查并作分离培养。动物死取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。1 1）、）、显微镜凝集试验显微镜凝集

14、试验是常用的方法。是常用的方法。(1)(1)抗原制备：取标准菌株抗原制备：取标准菌株4 47 7天的培养物，每天的培养物，每 视野视野50506060条活钩端螺旋体。条活钩端螺旋体。(2)方法与结果：取病人血清以方法与结果：取病人血清以56，30min灭活后灭活后稀释，每个稀释度稀释，每个稀释度01ml 血清中加入血清中加入等量活菌抗等量活菌抗原原，302h后后，取取1滴覆盖玻片，暗视野显微镜下滴覆盖玻片，暗视野显微镜下若若有抗体存在有抗体存在，则钩体凝集成团，数减少，菌体，则钩体凝集成团，数减少，菌体溶解。溶解。结果判定：结果判定：50以上菌体凝集或溶解为以上菌体凝集或溶解为“2+”为为血血

15、清效价清效价。达。达1：300以上才以上才有诊断意义或效价增高有诊断意义或效价增高4倍以上，则可确诊本病。倍以上，则可确诊本病。还可作钩体的还可作钩体的定群、定型定群、定型试验。试验。显微镜凝集试验显微镜凝集试验u用用ELISA法和法和IgM斑点斑点-ELISA法等间接检测钩法等间接检测钩体病人血清中特异性抗体，用于该病的快速诊体病人血清中特异性抗体，用于该病的快速诊断。断。包被抗原包被抗原用钩端螺旋体培养物经超声波破碎，用钩端螺旋体培养物经超声波破碎，15000rmin离心离心20min，用于包被的抗原浓度用于包被的抗原浓度以以20gml为好。被检血清为好。被检血清OD值为阴性对照的值为阴性

16、对照的2倍，即为阳性。倍，即为阳性。预防预防:防鼠、灭鼠防鼠、灭鼠 家畜管理家畜管理 保护水源保护水源 预防接种预防接种:死疫苗死疫苗治疗治疗:青霉素、安比西林、庆大霉素、青霉素、安比西林、庆大霉素、强力霉素等强力霉素等 u螺旋细密、规则两端尖，数目多；包括致病螺旋细密、规则两端尖，数目多；包括致病性和非致病性两大类。性和非致病性两大类。u致病密螺旋体有致病密螺旋体有苍白和品他密螺旋体苍白和品他密螺旋体两个种。两个种。u苍白密螺旋体又分苍白密螺旋体又分3 3个亚种：个亚种：苍白亚种、地方苍白亚种、地方亚种和极细亚种亚种和极细亚种，它们分别引起，它们分别引起梅毒梅毒、是性、是性传播疾病。传播疾病

17、。地方性梅毒地方性梅毒通过污染餐具传染，通过污染餐具传染，雅司病雅司病经直接接触患者皮肤受损部位而传染，经直接接触患者皮肤受损部位而传染，二者的临床症状与梅毒相似，但二者的临床症状与梅毒相似，但不是不是性传播性传播疾病。疾病。u品他密螺旋体引起人类品他病。品他密螺旋体引起人类品他病。u引起梅毒。人是惟一传染源。引起梅毒。人是惟一传染源。u先天性梅毒：通过先天性梅毒：通过胎盘胎盘由母体传染胎儿，由母体传染胎儿，u获得性梅毒：经获得性梅毒：经性接触性接触传播。也可经传播。也可经输血输血引引起。起。u获得性梅毒，临床上分为三期：获得性梅毒，临床上分为三期：u期：期：感染后感染后3 3周左右局部出现周

18、左右局部出现无痛性硬下疳无痛性硬下疳。多。多见于外生殖器；感染性极强。见于外生殖器；感染性极强。u期：期：发生于硬下疳出现后发生于硬下疳出现后2828周。全身皮肤、粘周。全身皮肤、粘膜常有膜常有梅毒疹，全身淋巴结肿大梅毒疹，全身淋巴结肿大；u期：期：发生感染发生感染2 2年后，病变可年后，病变可损害全身组织和器损害全身组织和器官官。基本损害为慢性肉芽肿，病损内螺旋体少但破。基本损害为慢性肉芽肿，病损内螺旋体少但破坏性大。坏性大。期梅毒期梅毒:梅毒疹梅毒疹期梅毒的溃疡、坏死期梅毒的溃疡、坏死l先天性梅毒又称胎传梅毒。先天性梅毒又称胎传梅毒。引起胎儿全身性感染，多发于妊娠引起胎儿全身性感染，多发于

19、妊娠4 4个月个月之后。之后。导致流产或死胎；导致流产或死胎；呈现马鞍鼻、先天性耳聋等特殊体征。呈现马鞍鼻、先天性耳聋等特殊体征。先天性梅毒先天性梅毒锯齿形牙锯齿形牙1形态与染色形态与染色 有有814个致密规则小螺旋个致密规则小螺旋，两端尖两端尖直运动活泼直运动活泼，G-，但不易着染。但不易着染。Fontana镀银染成棕褐色。在光镜下易于查见。镀银染成棕褐色。在光镜下易于查见。在暗视野显微镜下，可观察标本形态和运动方式。在暗视野显微镜下，可观察标本形态和运动方式。密螺旋体苍白亚种 暗视野 40002.电镜下观察，有细胞壁和细胞膜。细胞壁外有电镜下观察，有细胞壁和细胞膜。细胞壁外有包膜，包膜，细

20、胞膜细胞膜内为含细胞质和核质的螺旋形内为含细胞质和核质的螺旋形原原生质圆柱体生质圆柱体。绕着。绕着34根周浆鞭毛或内鞭毛根周浆鞭毛或内鞭毛，与运动有关。与运动有关。3.不能不能在无活细胞的在无活细胞的人工培养基人工培养基中中生长繁殖生长繁殖。将。将 Nichols有毒株有毒株接种家兔的睾丸接种家兔的睾丸,缓慢增殖缓慢增殖,将其将其转种含多种氨基酸的兔睾丸组织中转种含多种氨基酸的兔睾丸组织中,可失去致病可失去致病力力,称称Reiter株。株。4.抵抗力极弱。对温度和干燥特别敏感，抵抗力极弱。对温度和干燥特别敏感，4 3天天死亡。保存死亡。保存4 3天血液天血液就无传染梅毒的危险。就无传染梅毒的危

21、险。1.直接显微镜检查直接显微镜检查 初期梅毒，取下疳分泌物；二期梅毒取梅毒初期梅毒，取下疳分泌物；二期梅毒取梅毒疹、病灶渗出物或局部淋巴结穿刺液，将上疹、病灶渗出物或局部淋巴结穿刺液，将上述检材置于玻片上用暗视野显微镜检查，如述检材置于玻片上用暗视野显微镜检查，如见有呈现运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、见有呈现运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等的螺旋体即有诊断意义。旋转、前后移行等的螺旋体即有诊断意义。u用用PCR技术直接检测技术直接检测:u临床标本中梅毒螺旋体的特异性临床标本中梅毒螺旋体的特异性DNA片片段，用于检测的引物和探针是编码外膜蛋段，用于检测的引物和探针是编码外膜蛋白白

22、47kD的基因，的基因，u其扩增产物经斑点印迹，或电泳以其扩增产物经斑点印迹，或电泳以Southern 印迹法鉴定。印迹法鉴定。(1)(1)非密螺旋体抗原试验（非特异性抗体检测）非密螺旋体抗原试验（非特异性抗体检测）多用多用牛心肌的心脂质（牛心肌的心脂质（作为抗原，测定病人作为抗原，测定病人 血清中的血清中的反应素（抗脂质抗体）反应素（抗脂质抗体）。初期梅毒病初期梅毒病 灶出现后灶出现后1-21-2周时，阳性率为周时，阳性率为53 53 8383，二期梅毒二期梅毒的阳性率可达的阳性率可达100100，晚，晚 期梅毒的阳性率期梅毒的阳性率5858-85-85，胎传梅毒的阳性，胎传梅毒的阳性 率为

23、率为8080-100-100。u 所用所用VDRLVDRL抗原抗原(003心拟脂、心拟脂、021卵磷脂、卵磷脂、09胆固醇，用无水乙醇配制胆固醇，用无水乙醇配制)03ml加入装有加入装有03ml缓冲盐水的小瓶内缓冲盐水的小瓶内(1015ml容积容积)，加塞混，加塞混匀。再加匀。再加24ml缓冲盐水即为抗原悬液，缓冲盐水即为抗原悬液，u待检血清经待检血清经56 30min灭活灭活，滴加于玻片的漆圈内，滴加于玻片的漆圈内加等量抗原液，摇转玻片加等量抗原液，摇转玻片5min充分混匀反应后观察充分混匀反应后观察结果。结果。u有大片絮状凝聚物为有大片絮状凝聚物为(3+)，中等凝聚物为，中等凝聚物为(2+

24、)，细小，细小凝聚物为凝聚物为(+)，液体混浊为，液体混浊为()。u用用活性炭颗粒吸附活性炭颗粒吸附VDRLVDRL抗原抗原。与。与反应素反应素结合结合形成形成黑色凝集块黑色凝集块，可肉眼观察结果。，可肉眼观察结果。u取取待检血清待检血清加于环状卡圆圈内，加加于环状卡圆圈内，加VDRLVDRL抗原抗原致敏活性炭致敏活性炭1 1滴滴，旋转摇匀，旋转摇匀8 8minmin，观察结果。观察结果。在白色底板出现明显黑色凝集颗粒为阳性，在白色底板出现明显黑色凝集颗粒为阳性，试验结果用肉眼很容易判断，不需显微镜，试验结果用肉眼很容易判断，不需显微镜，也易于推广。也易于推广。l以上两实验用于梅毒的初筛实验以

25、上两实验用于梅毒的初筛实验u用密螺旋体抗原用密螺旋体抗原检测病人血清中特异性检测病人血清中特异性抗体抗体，由于梅毒螺旋体、雅司螺旋体等，由于梅毒螺旋体、雅司螺旋体等抗原性相似，所以用血清学试验不可能抗原性相似，所以用血清学试验不可能区别这些密螺旋体及其所致疾病。区别这些密螺旋体及其所致疾病。u先用吸收剂去除病人先用吸收剂去除病人血清非特异性抗体血清非特异性抗体，提，提高特异性高特异性，稀释成不同稀释度稀释成不同稀释度，加于预先涂加于预先涂有梅毒螺旋体抗原的玻片上，置湿盒内，有梅毒螺旋体抗原的玻片上，置湿盒内，37 孵育孵育30min，洗片后再用洗片后再用荧光素标记的羊荧光素标记的羊抗人丙球蛋白

26、抗体抗人丙球蛋白抗体，在荧光显微镜下观察。，在荧光显微镜下观察。阳性者可见发荧光的梅毒螺旋体。阳性者可见发荧光的梅毒螺旋体。FTA-ABS试验具试验具高度特异性和敏感性高度特异性和敏感性，在第一期梅毒，在第一期梅毒的头几天就可测出特异性抗体。的头几天就可测出特异性抗体。l用用 NicholNichol株株梅毒螺旋体作抗原，用梅毒螺旋体作抗原，用四甲基异四甲基异硫氰酸若丹明结合硫氰酸若丹明结合的抗人球蛋白抗血清及的抗人球蛋白抗血清及异异硫氰酸荧光素硫氰酸荧光素(FITC)FITC)结合结合的抗梅毒螺旋体球的抗梅毒螺旋体球蛋白蛋白双重染色，用间接免疫荧光技术检测血双重染色，用间接免疫荧光技术检测血

27、清中的抗清中的抗TPlgGTPlgG抗体。抗体。uFTA-ABS-DS法无论对早期梅毒或晚期梅毒法无论对早期梅毒或晚期梅毒都有很高的敏感性和特异性，且阳性出现时都有很高的敏感性和特异性，且阳性出现时间早。间早。u一期梅毒阳性率达一期梅毒阳性率达90，晚期梅毒的阳性率，晚期梅毒的阳性率为为95。对确诊病人的敏感性和特异性分别。对确诊病人的敏感性和特异性分别为为917和和92o，但技术要求较高，且但技术要求较高，且较费时费钱，因此多用于实验室试验。较费时费钱，因此多用于实验室试验。u用用抗原致敏红细胞抗原致敏红细胞作间接血凝试验是检测抗体作间接血凝试验是检测抗体最简易的方法，最简易的方法，u所用抗

28、原是用所用抗原是用梅毒螺旋体梅毒螺旋体(Nichols株株)提取物去提取物去致敏致敏经醛化处理的绵羊红细胞，病人的血清先经醛化处理的绵羊红细胞，病人的血清先与非致病性与非致病性Reiter细胞结合。血清若含有抗体细胞结合。血清若含有抗体则与这些细胞反应形成平铺孔底的凝集；用非则与这些细胞反应形成平铺孔底的凝集；用非致敏红细胞作对照，以除外非特异性凝集。致敏红细胞作对照，以除外非特异性凝集。u用用Nichols株为抗原株为抗原，以超声波击碎。，以超声波击碎。u此法可用于各期梅毒诊断，灵敏度为此法可用于各期梅毒诊断，灵敏度为96，对感，对感染血清灵敏度为染血清灵敏度为95。与荧光抗体双吸收法。与荧

29、光抗体双吸收法(FTA-ABS-DS)比较，两法符合率为比较，两法符合率为96。uELISA试剂具有价廉、保存时间久且稳定试剂具有价廉、保存时间久且稳定(4个月个月)等优点，是等优点，是目前梅毒血清学诊断试验的首选方法。目前梅毒血清学诊断试验的首选方法。u将梅毒螺旋体抗原用将梅毒螺旋体抗原用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，再将凝胶中的后，再将凝胶中的抗原经电转移至硝抗原经电转移至硝酸纤维薄膜酸纤维薄膜上，将膜切成上，将膜切成15mm宽小条。宽小条。u试验时加病人血清试验时加病人血清20 l(1：100稀释稀释)，置摇床上室，置摇床上室温过夜，次日用洗涤液洗温

30、过夜，次日用洗涤液洗3次后，加辣根过氧化物次后，加辣根过氧化物酶标记的抗人酶标记的抗人IgG抗血清抗血清(1：500稀释稀释)，室温作用，室温作用1小时后，加底物显色小时后，加底物显色5min后用蒸馏水冲洗，终止后用蒸馏水冲洗，终止反应。反应。u出现蓝色区带为阳性。出现蓝色区带为阳性。lWHO推荐用推荐用VDRL、RPR法对血清进行法对血清进行过筛试验过筛试验，出现阳性者用，出现阳性者用FTA-ABS、FTA-ABS-DS、MHA-TP、ELISA和免和免疫印迹试验等方法做疫印迹试验等方法做确认试验确认试验。u先天梅毒很难诊断，可用先天梅毒很难诊断，可用RPR半定量试半定量试验每月检测验每月检

31、测1次，连续次，连续6个月，检测反应个月，检测反应素效价，或用素效价，或用VDRL定量试验查抗体效定量试验查抗体效价变化。如价变化。如效价增高或稳定在高水平，效价增高或稳定在高水平，表明是先天梅毒表明是先天梅毒。如抗体是来自母体。如抗体是来自母体 lgG，通常在通常在23月内消失。月内消失。u有苍白密螺旋体地方亚种、极细亚种以及有苍白密螺旋体地方亚种、极细亚种以及品他密螺旋体，分别引起地方性梅毒、雅品他密螺旋体，分别引起地方性梅毒、雅司和品他病。大多发生于经济较落后地区司和品他病。大多发生于经济较落后地区的儿童。的儿童。u微生物学检查，可从皮肤标本直接在暗视微生物学检查，可从皮肤标本直接在暗视

32、野显微镜下观察有无密螺旋体。也可用血野显微镜下观察有无密螺旋体。也可用血清学试验检测血清中有无相应抗体。清学试验检测血清中有无相应抗体。u由于与梅毒病原体形态、抗原结构，由于与梅毒病原体形态、抗原结构，DNADNA同同源性基本相同，无法区别。因此，查到密源性基本相同，无法区别。因此，查到密螺旋体及血清试验阳性只能诊断为密螺旋螺旋体及血清试验阳性只能诊断为密螺旋体感染，还必须结合临床表现确定。体感染，还必须结合临床表现确定。u有有3 31010个个稀疏而不规则稀疏而不规则的螺旋，运动活泼。的螺旋，运动活泼。u对人致病的主要有对人致病的主要有伯氏伯氏疏螺旋体、疏螺旋体、回归热回归热螺旋体、螺旋体、

33、奋森奋森螺旋体等。螺旋体等。u是是莱姆病莱姆病的主要病原体，的主要病原体，19771977年在美国年在美国莱姆镇发现，从莱姆镇发现，从硬蜱硬蜱及患者体内分离出及患者体内分离出伯氏疏螺旋休。伯氏疏螺旋休。u19851985年我国在黑龙江省林区首次发现莱年我国在黑龙江省林区首次发现莱姆病，姆病，19881988年从病人血液中分离出病原年从病人血液中分离出病原体，迄今已有十多个省和自治区证实有体，迄今已有十多个省和自治区证实有莱姆病存在。莱姆病存在。u传播媒介是传播媒介是硬蜱硬蜱，伯氏疏螺旋体可在蜱的中，伯氏疏螺旋体可在蜱的中肠生繁殖，叮咬时使宿主感染。肠生繁殖，叮咬时使宿主感染。u经经330d潜伏

34、期，在叮咬部位可出现潜伏期，在叮咬部位可出现慢性移慢性移行性红斑行性红斑。经。经2-3周，皮损消退，留有斑痕周，皮损消退，留有斑痕与色素沉着。与色素沉着。u早期症状有头痛发热、肌痛等。早期症状有头痛发热、肌痛等。80未经未经治疗的可发展至慢性关节炎、慢性神经系统治疗的可发展至慢性关节炎、慢性神经系统异常，严重者可同时出现皮肤、神经、关节、异常，严重者可同时出现皮肤、神经、关节、心等多脏器损害。心等多脏器损害。Lyme disease游走性红斑游走性红斑1疏螺旋体，两端稍尖。疏螺旋体，两端稍尖。运动活泼，运动活泼，在培养在培养 基中，不规则地缠绕一起，呈卷圈状。基中，不规则地缠绕一起，呈卷圈状。

35、周周 浆鞭毛浆鞭毛数不等。与运动有关。数不等。与运动有关。-易着色。易着色。Giemsa或或Wright染色均佳。染色均佳。2抗原成分抗原成分 主要的有主要的有鞭毛蛋白鞭毛蛋白(40k)、外膜、外膜 蛋白蛋白A(OspA)、B(OspB)和和C(OspC)，60kD 抗原。抗原。40kD鞭毛蛋白既是免疫原，也是致鞭毛蛋白既是免疫原，也是致 病原之一。病原之一。3.营养要求高，培养基需含有营养要求高，培养基需含有长链饱和与不长链饱和与不 饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和血清蛋白饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和血清蛋白等。等。微需氧微需氧，510C02促进生长。适宜温促进生长。适宜温度为度为35。生长慢生

36、长慢，1代需代需18h，需培养需培养13周观察到生长情况。周观察到生长情况。伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体1 1标本采集标本采集 早期取病损皮肤组织、淋巴结抽早期取病损皮肤组织、淋巴结抽 出液、血液。出液、血液。2.2.直接用暗视野显微镜，观察关节滑膜液、脑直接用暗视野显微镜，观察关节滑膜液、脑 脊液、尿液等标本中螺旋体的形态和运动，脊液、尿液等标本中螺旋体的形态和运动，因数量太少，故在实验室因数量太少，故在实验室诊断中价值不大诊断中价值不大。用于蜱内脏组织检查用于蜱内脏组织检查,检出率较高。检出率较高。用用PCR技术检查技术检查DNA:u方法快速、敏感性高，方法快速、敏感性高，u用已知引物，以标本

37、中螺旋体质粒用已知引物，以标本中螺旋体质粒 DNA片段为模片段为模板，扩增后形成板，扩增后形成309bp的的DNA分子分子(是编码是编码OspA的的基因片段基因片段)，经琼脂糖电泳证实。，经琼脂糖电泳证实。u此此DNA分子在所有伯氏疏螺旋体菌株中均可被检分子在所有伯氏疏螺旋体菌株中均可被检出，而其他菌种则为阴性。出，而其他菌种则为阴性。u标本接种在标本接种在BSK复合培养基复合培养基中，中，33孵孵育。育。BSK培养基是含有牛血清白蛋白培养基是含有牛血清白蛋白(BSA)和热灭活兔血清等营养丰富的液体和热灭活兔血清等营养丰富的液体培养基，通常从培养基，通常从感染的脾中分离感染的脾中分离螺旋体螺旋

38、体较易，而从损伤皮肤中分离较难。较易，而从损伤皮肤中分离较难。u因分裂因分裂1代需代需12h以上，需培养以上，需培养2-3周可观周可观察生长情况。察生长情况。u间接免疫荧光法间接免疫荧光法(IFA)：u将螺旋体在将螺旋体在BSK中培养中培养5-7天，离心天，离心8200rpm 30min收集收集螺螺旋体旋体，稀释至，稀释至200个螺旋体高倍镜视野。个螺旋体高倍镜视野。u取取20l悬液于玻片上，干燥后用丙酮固定悬液于玻片上，干燥后用丙酮固定5min。待检血清待检血清以以PBS倍比稀释，加于玻片倍比稀释，加于玻片1015l稀释血清稀释血清，u湿盒内湿盒内37孵育孵育 30min，洗后加洗后加荧光素

39、标记抗人荧光素标记抗人IgG。uIFA操作简便实用，但类风湿性关节炎和其他螺旋体病可出操作简便实用，但类风湿性关节炎和其他螺旋体病可出现假阳性反应。现假阳性反应。u常用的实验动物有小白鼠，金地鼠和兔常用的实验动物有小白鼠，金地鼠和兔等。以螺旋体悬液感染，可出现与人类等。以螺旋体悬液感染，可出现与人类相似的皮损症状，血培养亦阳性，抗体相似的皮损症状，血培养亦阳性，抗体效价显著升高，可作为效价显著升高，可作为良好的动物模型良好的动物模型，常用常用新西兰白兔新西兰白兔。u动物试验虽是一种经典的方法，但较繁动物试验虽是一种经典的方法，但较繁琐，有生物危害。琐，有生物危害。u是引起人类回归热的病原体。是

40、引起人类回归热的病原体。u根据回归热传播媒介不同，分为两类根据回归热传播媒介不同，分为两类:一为一为虱虱传回归热传回归热，或称，或称流行性回归热流行性回归热，其病原体为，其病原体为回归热疏螺旋体。另一为回归热疏螺旋体。另一为蜱传回归热蜱传回归热，又称，又称地方性回归热地方性回归热。u我国流行的回归热主要是虱传型。我国流行的回归热主要是虱传型。u流行性回归热主要通过流行性回归热主要通过人体虱人体虱在人类中在人类中传播。当虱吸吮病人血液后，螺旋体从传播。当虱吸吮病人血液后，螺旋体从中肠进入血淋巴大量繁殖，不进入唾液中肠进入血淋巴大量繁殖，不进入唾液或卵巢。人被虱叮咬后，因抓痒将虱粪或卵巢。人被虱叮

41、咬后，因抓痒将虱粪压碎，经皮肤创伤进入人体。压碎，经皮肤创伤进入人体。u侵侵入入人体后，先在内脏繁殖，经一周左右人体后，先在内脏繁殖，经一周左右的潜伏期，大量流的潜伏期，大量流入入血液，引起血液，引起菌血症菌血症型型发热、肝、脾肿大，出现黄疽；持续一周发热、肝、脾肿大，出现黄疽；持续一周左右，骤然退热，血中螺旋体消失，隔一左右，骤然退热，血中螺旋体消失，隔一周或数日又发热，血中出现螺旋体。如此周或数日又发热，血中出现螺旋体。如此反复发作与缓解可达反复发作与缓解可达3 31010次次，故称回归热，故称回归热 u取发热期外周血取发热期外周血1 1滴，加盖玻片用暗视野显微滴，加盖玻片用暗视野显微镜观

42、察，镜观察，螺旋体运动活泼；为红细胞直径的螺旋体运动活泼；为红细胞直径的2-42-4倍，螺旋稀疏不规则，呈波状。倍，螺旋稀疏不规则，呈波状。u如发热期未能查到螺旋体，取抗凝血如发热期未能查到螺旋体，取抗凝血0 01 1mlml接种乳鼠腹腔，每日取尾静脉血接种乳鼠腹腔，每日取尾静脉血镜检，镜检，1 13 3天可查到大量疏螺旋体。天可查到大量疏螺旋体。抗抗原易自发变异原易自发变异，使其血清学诊断十分困，使其血清学诊断十分困难。难。u有有38个不规则疏螺旋个不规则疏螺旋，形态与回归热螺旋，形态与回归热螺旋体类似。体类似。G-，运动活泼。专性厌氧，常与梭运动活泼。专性厌氧，常与梭杆菌寄生于牙龈部。杆菌寄生于牙龈部。u一般不致病，只有当人体抵抗力显著降低时，一般不致病，只有当人体抵抗力显著降低时，两种菌繁殖，协同引起奋森咽峡炎、牙龈炎、两种菌繁殖，协同引起奋森咽峡炎、牙龈炎、口颊坏疽、溃疡性口腔炎等。口颊坏疽、溃疡性口腔炎等。u用棉拭子从病灶处取材，涂片染色镜检，可用棉拭子从病灶处取材，涂片染色镜检，可见见G-螺旋体与螺旋体与G-梭杆菌共存。梭杆菌共存。1.重点掌握致病性螺旋体的分类，及代表性螺旋体和所致疾病？2.掌握钩体标本采集、染色方法、动力观测方法、可人工培养及显微凝集实验的原理方法及判断3.掌握梅毒螺旋体传播方式、所致疾病、常用初筛实验和确认实验