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1、第一章第一章第一章 色谱分析概论色谱分析概论色谱分析概论第一节第一节 色谱分析法概述色谱分析法概述 一、色谱法的由来一、色谱法的由来 11906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离见图示 各组分互相分离形成各种不同各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带，叫做颜色的谱带，叫做“色谱色谱”；在这一方法中把玻璃管叫作在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱色谱柱”；碳酸钙叫作碳酸钙叫作“固定相固定相”；纯净的石油醚叫作纯净的石油醚叫作“流动相流动相”。2现在：一种重要的分离、分析技术 分离混合物各组分并加以分析 固定相除了固体，还可以是液体 流动相液体或气体 色谱柱各种材质和尺寸 被分离组分不再仅局

2、限于有色物质二、色谱法定义、实质和目的二、色谱法定义、实质和目的二、色谱法定义、实质和目的 定义：又叫层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样定义：又叫层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。质达到相互分离。实质：分离实质：分离 目的：定性分析或定量分析目的：定性分析或定量分析三、色谱法分类：三、色谱法分类：1按流动相和固

3、定相的状态分类：按流动相和固定相的状态分类：2按固定相的固定方式分：按固定相的固定方式分：3按分离机制分：按分离机制分：一、色谱过程一、色谱过程一、色谱过程一、色谱过程一、色谱过程一、色谱过程 指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程 以吸附色谱为例见图示 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离吸附能力的微小差异微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出 固定相固定相（s）；流动相流动相（m）固定相（stationary phase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。流动相（mobile phase）：与固定相处于平衡状态、

4、带动样品向前移动的另一相。二、基本概念及术语二、基本概念及术语二、基本概念及术语 流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰 从色谱柱流出的溶液（柱流出物）进入检测器连续测定，得到如图所示的色谱图，即柱流出物中溶质浓度随时间变化的曲线，直线部分是没有溶质流出时流动相的背景响应值，称作基线（base line）。在基线平稳后，通常将基线响应值设定为零，再进样分析。溶质开始流出至完全流出所对应的峰型部分称色谱峰（peak），基线与色谱峰组成了一个完整的色谱图。色谱峰高色谱峰高色谱峰最高点与基线之间的距离。以色谱峰最高点与基线之间的距离。以h h表示。表示。峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好

5、。峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好。色谱峰的宽度色谱峰的宽度标准偏差标准偏差 峰高峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。倍处的色谱峰宽的一半。半峰宽半峰宽W1/2峰高一半处色谱峰的宽度峰高一半处色谱峰的宽度 W1/2=2.354 峰底宽峰底宽Wb色谱峰两侧拐点所作切线色谱峰两侧拐点所作切线,与基线交点间的距与基线交点间的距离离 Wb=4 色谱峰面积色谱峰面积 色谱峰与基线间所包围的面积。色谱峰与基线间所包围的面积。1、时间表示的保留值：、时间表示的保留值：保留值保留值保留时间保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时组分从进样到柱后出现浓度极大值时 所需的时间；所需的时间；死时间死时

6、间(tM或或t0)：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；调整保留时间调整保留时间(tR)：tR=tR t0 tR：样品在样品在流流动相和固定相中的动相和固定相中的 停留时间之和；停留时间之和；tR ：样品在固定相中的停留时间；样品在固定相中的停留时间；tM：样品在流动相中的停留时间。样品在流动相中的停留时间。是试样各组分，即溶质在色谱柱是试样各组分，即溶质在色谱柱或色谱体系中保留行为的度量，或色谱体系中保留行为的度量，反映了溶质与色谱固定相作用力反映了溶质与色谱固定相作用力类型和大小，与两者分子结构有类型和大小，与两者分子结构有关，是重要的色谱热

7、力学参数和关，是重要的色谱热力学参数和色谱定性的依据。相同的物质在色谱定性的依据。相同的物质在同样的色谱条件下，色谱峰的保同样的色谱条件下，色谱峰的保留值是固定的。所以可以进行定留值是固定的。所以可以进行定性。性。保留值保留值2、体积表示的保留值：、体积表示的保留值：保留体积（保留体积（VR）：指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过 的流动相的体积的流动相的体积 VR =tRF0 （F0为柱出口处的载气流量，单位：为柱出口处的载气流量，单位：mL min 1。）死体积（死体积（V0）：）：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间

8、体积称为死体积。由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间体积称为死体积。包括柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色包括柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和空间的总和。V0=tM F0 调整保留体积调整保留体积(VR)：V R=VR V0 它们都与移动相流量无关。它们都与移动相流量无关。色谱流出曲线提供的信息色谱流出曲线提供的信息 峰的个数峰的个数组组 份的最少个数份的最少个数 保留值保留值(或位置）或位置）定性分析定性分析 峰面积或峰高峰面积或峰高 定量分析定量分析 保留值及其区域宽度保留值及其区域宽度评价色谱

9、柱分离效能评价色谱柱分离效能 两峰间的距离两峰间的距离评价固定相评价固定相(和流动相和流动相)选择是否合适选择是否合适l分配系数分配系数(K)和容量因子和容量因子（k）色谱过程是相平衡过程，相平衡过程的主要参数为分配系数（色谱过程是相平衡过程，相平衡过程的主要参数为分配系数（K）及容量因子（及容量因子（k）。）。色谱过程中，在流动相与固定相中的溶质分子处于动态平衡。平衡色谱过程中，在流动相与固定相中的溶质分子处于动态平衡。平衡时组分在固定相（时组分在固定相（s）与流动相（）与流动相（m）中的浓度（）中的浓度（C）之比为分配系）之比为分配系数（数（partition coefficient），常

10、表示为），常表示为K。试样中的各组分具有不同的试样中的各组分具有不同的 K 值是值是分离的基础分离的基础；一定温度下，一定温度下，K 越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；K 越小，出峰越快；越小，出峰越快；K主要取决于组分和两相的性质及温度，与主要取决于组分和两相的性质及温度，与两相的体积无关两相的体积无关；选择适宜的固定相可改善分离效果；选择适宜的固定相可改善分离效果；温度越高，温度越高，K 越小。越小。容量因子容量因子 k(capacity factor)在在一定温度一定温度下，组分在两相间分配达到下，组分在两相间分配达到平衡平衡时的时的质量比质量比。也称也称容量因子、容量比。容量因子、容量比

11、。msmmk 组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量容量因子容量因子 k 与分配系数与分配系数 K 的关系的关系 Vm为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；Vs为固定相体积，对不同类型色谱柱，为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同：的含义不同：气气-液色谱柱：液色谱柱：Vs为固定液体积；为固定液体积；气气-固色谱柱：固色谱柱：Vs为吸附剂表面容量；为吸附剂表面容量；容量因子越大，保留时间越长。容量因子越大，保留时间越长。=msmm分配系数和容量因子之间的区别与联系分配系数分配系数K 与柱中固定相和流动相的体积无关，与柱中固定相和流动相

12、的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。而变化。容量因子随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相容量因子随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。及固定相的体积有关。分配系数和容量因子都是和组分及固定相的热力学分配系数和容量因子都是和组分及固定相的热力学性质有关的常数，都是衡量色谱柱对组分保留能力性质有关的常数，都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数。数值越大，保留时间越长。的参数。数值越大，保留时间越长。分配系数可由实验测得。分配系数可由实验测得。分离因子分离因子（选择性系数）：l分离因子和分离度分离因子和分离度色谱中

13、描述相邻组分分离状态的指标一般用分离因子或分离度表示。分离因子被定义为两种物质调整保留值之比，又称为分配系数比或选择性系数，以表示。两个物质分离的前提：1，即1。分离度（分离度（RS）两个相邻色谱峰的分离度Rs（resolution）定义为两峰保留时间差与两峰峰底宽平均值之商。sRs 越大，表明两组分分离效果越好。Rs 1时，两峰总有部分重叠。Rs=1,两峰能明显分离。Rs=1.5，分离程度可达99.7%，认为色谱峰已完全分开。分离度可以用来作为衡量色谱峰分离效能的指标。t t tR R R与与与K K K的关系的关系的关系Rtt0R 的分数为试样分子在流动相中设R的分数为试样分子在固定相中设

14、R1mSmmSSVVKVCVCRR1mSVVKR11)1(R柱中流动相的流速:0u柱中分离组分的流速:RuRRRtttLtLuu0000uRuR式1式2tR与与K的关系式：的关系式：容量因子的计算公式：容量因子的计算公式：容量因子的计算公式：容量因子的计算公式：容量因子的计算公式：容量因子的计算公式：k是组分的调整保留时间与死时间之比讨论：讨论：色谱条件一定时，tR主要取决K的大小（色谱法基本的定性参数）RtK色谱过程方程式：色谱过程方程式：注：应选择合适分离条件使得难分离的组分K不等)1(0msBBRVVKtt)1(0msAARVVKtt结论：色谱分离前提各组分分配系数不等练习题练习题练习题

15、练习题练习题练习题一个气相色谱柱，由固定液的凃量及固定液在柱温下的密度计算得Vs=14.1mL，载气流速为43.75mL/min。分离一个含A、B、C组分的样品，测得组分保留时间组分A为1.41min、组分B为2.67min、组分C为4.18min、空气为0.24min。试计算：（1）死体积；（2）各组分的调整保留时间和分配系数；（3）相邻两组分的选择性系数。2023-5-13色谱理论需要解决的问题色谱理论需要解决的问题色谱理论需要解决的问题色谱理论需要解决的问题色谱理论需要解决的问题色谱理论需要解决的问题u 色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题；影响分离及柱效的因素与提高

16、柱效的途径；柱效与分离度的评价指标及其关系。两种色谱理论：塔板理论和速率理论。第三节第三节 色谱分离的基本理论色谱分离的基本理论一、塔板理论（一、塔板理论（Martin and Synge 1941）塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则 H=L/n 式中n为理论塔板数。理论塔板数（n）可根据色谱图上所测得的保留时间（tR）和峰底宽（w）或半峰宽（wh/2）按下式推算：或L 色谱柱长；色谱柱长；H 理论塔板高度；理论塔板高度；n 理论塔板数。理论塔板数。由表可知：分配系数由表可知：分配系数大的组分大的组分

17、A，在转移，在转移三次后，它的浓度最三次后，它的浓度最高峰集中在一号塔板高峰集中在一号塔板上（上（0.148+0.296；而分配系数小的而分配系数小的B的的浓度最高峰则在第二浓度最高峰则在第二号塔板上（号塔板上（0.296+0.148）。上述只）。上述只分析了四次塔板，转分析了四次塔板，转移了三次的结果。事移了三次的结果。事实上，一个色谱柱的实上，一个色谱柱的塔板数为塔板数为103106。因此微小的分配系数因此微小的分配系数差别，即能获得很好差别，即能获得很好的分离效果。的分离效果。塔 板 理 论 Van Deemter 从动力学理论，研究了促使色谱峰扩张和影响板高的因素 吸收了塔板理论的有效

18、成果H 从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素二、速率理论二、速率理论 1956年荷兰学者年荷兰学者van Deemter等在研究气液色谱时，提出了等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论色谱过程动力学理论速率理论速率理论。1、速率方程（也称范速率方程（也称范 弟姆特方程式）：弟姆特方程式）：(1 1 1).涡流扩散项涡流扩散项涡流扩散项（多径扩散项）（多径扩散项）（多径扩散项）：A A A 产生原因：产生原因：载气携样品进柱，由于固定相填充不均匀，使一个组分的分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱，引起峰扩张。影响因素：影响因素：固体颗粒越小，填充越实，A项越小 填充不规则因子填充颗粒直径

19、dp n 柱效 n 柱效注：注：颗粒太小，柱压过高且不易填充均匀 填充柱60100目 空心毛细管柱（0.10.5mm），A=0，n理较高back柱子规格：30m 0.32mm 0.25m 速率理论速率理论(2 2 2).纵向扩散项（分子扩散项）：纵向扩散项（分子扩散项）：纵向扩散项（分子扩散项）：B/uB/uB/u扩散，即浓度趋向均一的现象。扩散速度的快慢，用扩散系数衡量。由于样品组份被载气带入色谱柱后，以“塞子”的形式存在色谱柱的很小一段空间中，在“塞子”前后（纵向），存在浓度差，形成浓度梯度，导致运动着的分子产生纵向扩散。）弯曲因子（111空心毛细管柱填充柱速率理论速率理论 注注：为降低纵

20、向扩散,宜选用分子量较大的载气、控制较高线速度和较低的柱温影响因素：影响因素：速率理论速率理论（3 3 3）传质阻力项：传质阻力项：传质阻力项：CuCuCu产生原因：物质由于在两相间的浓度不均而发生迁移的过程，称产生原因：物质由于在两相间的浓度不均而发生迁移的过程，称为传质过程，影响这个过程的进行速度的阻力，叫传质阻力。为传质过程，影响这个过程的进行速度的阻力，叫传质阻力。流动相传质过程：是指试样在气相和气液界面上的传质（气液色谱）。流动相传质阻抗相：由于传质阻力的存在，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡。所以，有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走，出现超前的现象，造成谱峰展宽。固

21、定相传质过程：是指试样在液相和气液界面上的传质（气液色谱）。固定相传质阻抗相：由于传质阻力的存在，增加了组份在液体中的停留时间，晚回到气相中去。因此这些组份的分子落后于原在气相中随同载气流动的分子，使峰扩张。速率理论速率理论2023-5-13气液色谱气液色谱传质阻力包括气相传质阻力传质阻力包括气相传质阻力 Cg和液相传质阻力和液相传质阻力 CL，即：即：C=Cg+CLgpgDdkkC22)1(01.0LfLDdkkC22)1(32k 容量因子；容量因子；Dg 、DL 扩散系数；扩散系数；dp 填充物的平均直径；填充物的平均直径；df 液膜厚度。液膜厚度。减小减小dp 和和df，增加，增加Dg和

22、和 DL，减小流速，减小流速u，可以降低传质阻力，可以降低传质阻力 C u。速率理论速率理论Cu 传质阻力项传质阻力项对于空心毛细管色谱对于空心毛细管色谱Cg很小，可以忽略。很小，可以忽略。2023-5-13色谱塔板高度方程：色谱塔板高度方程：气液色谱气液色谱：uCuBAHuDdkkDdkkuDdHLfgpgp2222)1(32)1(01.022这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意 义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜

23、厚度等对柱效的影响。对柱效的影响。速率理论速率理论2.2.2.流速与柱效的关系流速与柱效的关系流速与柱效的关系uBAHCuu/项可忽略，最佳uCAHBuu项可忽略，最佳高，峰越尖锐，柱效，一定，三个常数注：nHu用塔板高度用塔板高度H对载气流速对载气流速u做图为做图为二次曲线，曲线最低点所对应的二次曲线，曲线最低点所对应的板高最小（板高最小（H最小最小），柱效最高，），柱效最高，此时的流速成为最佳流速。此时的流速成为最佳流速。速率理论速率理论2023-5-13速 率 理 论最佳流速最佳流速 流速流速 u 对对分子扩散项分子扩散项和和传质阻传质阻力项力项的影响是相反的，因此存在的影响是相反的，因

24、此存在最最佳流速佳流速 u，可使，可使 H 达到达到最小最小，柱效柱效最高最高。BCAH2最佳2023-5-133、速率理论的特点：速率理论的特点：（1）涡流扩散、分子扩散及传质阻力使分子在气液两相间的不涡流扩散、分子扩散及传质阻力使分子在气液两相间的不 能迅速达到分配平衡是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。能迅速达到分配平衡是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。（2）阐明了固定相粒度、柱温、载气种类、液膜厚度和流速对柱阐明了固定相粒度、柱温、载气种类、液膜厚度和流速对柱 效及分离的影响，为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。效及分离的影响，为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。（3）各种因

25、素相互制约，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。各种因素相互制约，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。速 率 理 论三、影响分离度的因素s)1(kttMR2)(16WtnR12)1()2(21kkRRttr推导色谱分离基本方程的基本关系式：推导色谱分离基本方程的基本关系式：)1(1)1(kttMR)1(2)2(kttMR两个相近的色谱峰1和2，假定两峰峰底宽近似相等，W1W2，n1 n2。212211221)1()2()(21)1()1(21WkktWWktktWWttRMMMRRs）（）（2)(16WtnRnktntWMR)1(442)2(2)1(4)()1(4)(212212kkknktkkn

26、tRMMs11414)1()(4222122222212kknkkkkknkkkkknRs称为柱效项；称为柱选择项；容量因子项。讨论：讨论：若若K1=K2，则，则=1，柱选择项为，柱选择项为0，R=0，无法分离。，无法分离。色谱分离关系式:=K2K1=k2k1-1-1Rs=RsRs n n1/21/2增加柱长L可改进分离度；但L过长，保留时间延长，分析时间延长，色谱峰扩展。达到一定分离度条件下应使用短一些的色谱柱。减小塔板高度：使用性能优良的色谱柱，并选择优化的分离条件。分离度与柱效（分离度与柱效（n）的关系（柱效因子）的关系（柱效因子）k值增大，有利于分离，但k10时，对Rs的增加不明显，也

27、会显著增加分析时间。k的最佳范围：1 10。分离度与容量因子（分离度与容量因子（k）的关系）的关系k0.51.03.05.08.0103050k/(k+1)0.330.500.750.830.890.910.970.98k值对k/(k+1)的影响方法：方法：1）改变柱温）改变柱温（温度（温度，k）2）改变相比（死体积越小越好）改变相比（死体积越小越好）分离度与选择性（分离度与选择性（）的关系）的关系越大，柱选择性越好，分离效果越好。如果越大，柱选择性越好，分离效果越好。如果两个相邻峰的选择因子足够大，则即使色谱两个相邻峰的选择因子足够大，则即使色谱柱的理论塔板数较小，也可以实现分离。柱的理论塔

28、板数较小，也可以实现分离。1、若、若K1=K2，则，则=1，柱选择项为，柱选择项为0，R=0，无法分离。，无法分离。2、当、当1.1时，实际需要的有效理论塔板数很大。时，实际需要的有效理论塔板数很大。222)()/()/(RRRRttttnn有效22)1()1()1(kktktktnnMMM有效)1(kttMR用有效理论塔板数表示的色谱分离方程：用有效理论塔板数表示的色谱分离方程：11422kknRs14effnRs 例题：设有一对物质，其r2,1=1.15,要求在Heff=0.1cm的某填充柱上得到完全分离，试计算至少需要多长的色谱柱？m.L2102112 解：要实现完全分离，R1.5,故所

29、需有效理论塔板数为：在一定条件下，两个组分的保留时间分别为在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和和12.8s，塔板数为，塔板数为3600块，柱长块，柱长1m。计算分离度。计算分离度。要达到完全分离，即要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。，所需要的柱长。8533.036008.12448133.036002.12442211 ntWntWRbRb分离度分离度：72.08133.08533.0)2.128.12(2 RmLRRL34.4172.05.1212122 作业：实验设计作业：实验设计作业：实验设计作业：实验设计作业：实验设计作业：实验设计 建立水溶液中农药甲氰菊酯的检测方法建立水溶液中农药甲氰菊酯的检测方法 吡虫啉可湿粉剂中吡虫啉含量的测定吡虫啉可湿粉剂中吡虫啉含量的测定