-第十四章细胞增殖调控与癌细胞课件.ppt

1、 一二三 五 p34cdc2激酶的发现及其与激酶的发现及其与MPF的关系的关系周期蛋白周期蛋白 CDK和和CDK抑制因子抑制因子 四 六其他因素在细胞周期调控中的作用其他因素在细胞周期调控中的作用12科学家通过三个实验找到科学家通过三个实验找到并证实了并证实了MPFMPFMPF的功能的功能时间时间研究者研究者步步骤骤19701970RaoRao和和JohnsoJohnso将将HeLaHeLa细胞同步于不同阶段，然后将细胞同步于不同阶段，然后将M M期细胞与其他间期细胞融合期细胞与其他间期细胞融合实验一实验一M M期细胞可以诱导期细胞可以诱导PCCPCC结果结果在在M M期细胞中可能存在一种诱导

2、染色体凝集的期细胞中可能存在一种诱导染色体凝集的因子，称为细胞有丝分裂促进因子因子，称为细胞有丝分裂促进因子。结论结论HeLa细胞细胞G1期期S期期G2期期仙台病毒介导仙台病毒介导早熟染早熟染色体凝缩色体凝缩（PCC）同步化同步化M期细胞期细胞A：G1期期DNA未复制，超前染色体为单线性；未复制，超前染色体为单线性；B：S期期DNA正在复制，超前染色体为点状，很多复制起始点；正在复制，超前染色体为点状，很多复制起始点；C：G2期期DNA复制完毕，超前染色体为双线性。复制完毕，超前染色体为双线性。时时 间间步步 骤骤1971MasuiMasui和和MarkertMarkert实验二实验二孕酮诱导

3、成熟的卵母细胞的细胞质孕酮诱导成熟的卵母细胞的细胞质能诱导其他卵母细胞的成熟能诱导其他卵母细胞的成熟结结 果果在成熟的卵母细胞中，必定有一种物质，能诱导卵在成熟的卵母细胞中，必定有一种物质，能诱导卵母细胞成熟，这种物质称为成熟促进因子（母细胞成熟，这种物质称为成熟促进因子（MPFMPF）结结 论论用解剖的方法分离非洲爪蟾第用解剖的方法分离非洲爪蟾第IVIV期卵母细胞，期卵母细胞，孕酮诱导成熟后进行细胞质移植实验孕酮诱导成熟后进行细胞质移植实验研究者研究者卵细胞细卵细胞细胞质移植胞质移植实验实验成熟卵母细胞中成熟卵母细胞中的物质能诱导卵的物质能诱导卵母细胞成熟母细胞成熟以爪蟾卵为材料，纯化以爪蟾

4、卵为材料，纯化MPFMPF工作工作时间时间 步骤步骤19881988Maller et alMaller et al实验三实验三MPFMPF组成组成：p32p32和和p45p45两种蛋白。两种蛋白。p32p32和和p45p45结合后，结合后，表现出表现出蛋白激酶活性蛋白激酶活性，能使多种蛋白质底物磷酸化，能使多种蛋白质底物磷酸化结果结果MPFMPF（又称细胞促分裂因子或（又称细胞促分裂因子或M M期促进因子），是由期促进因子），是由细胞周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶组成的复细胞周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶组成的复合物，能启动细胞进入合物，能启动细胞进入M M期。期。结论结论研究者研究者二

5、、二、p p34cdc2激酶的发现及其与激酶的发现及其与MPFMPF的关系的关系12酵母中酵母中cdc基因的发现基因的发现cdc激酶与激酶与MPF的关系的关系以以裂殖酵母裂殖酵母为实验材料，构建温度敏感型突为实验材料，构建温度敏感型突变株，分析突变株基因改变情况变株，分析突变株基因改变情况时间 步骤19701970NurseNurse等等实验一实验一找到找到cdccdc基因，如基因，如cdc2cdc2,表达蛋白为表达蛋白为34kDa,称为称为p34cdc2结果结果第一个第一个被分离出来的被分离出来的cdc基因基因，表达蛋白为，表达蛋白为34kDa，称为，称为p34cdc2。特点：特点：突变后突

6、变后芽殖酵母细胞停留在芽殖酵母细胞停留在G2/M期期 结论结论研究者研究者以以芽殖酵母芽殖酵母为实验材料，构建温度敏感为实验材料，构建温度敏感型突变株，分析突变株基因改变情况型突变株，分析突变株基因改变情况时间时间步骤步骤19601960HartwellHartwell实验二实验二找到找到cdccdc基因，如基因，如cdc28cdc28,表达蛋白为表达蛋白为34kDa,称为称为p34cdc28结果结果第二个第二个被分离出来的被分离出来的cdc基因；基因；突变突变后细胞停留在后细胞停留在G1/S或或G2/M期期。结论结论研究者研究者cdc28:第二个被分离出来的第二个被分离出来的cdc基因，表达

7、蛋白为基因，表达蛋白为p34cdc28特点：突变后芽殖酵母细胞停留在特点：突变后芽殖酵母细胞停留在G1/S或或G2/M期期cdc2:第一个被分离出来的第一个被分离出来的cdc基因，表达蛋白为基因，表达蛋白为p34cdc2特点：突变后裂殖酵母细胞停留在特点：突变后裂殖酵母细胞停留在G2/M期期 共同特点共同特点：1.大小相等，是同源物，并且与大小相等，是同源物，并且与MPF中的中的P32是是同源物同源物2本身都不具激酶活性，只有与特定蛋白结合后本身都不具激酶活性，只有与特定蛋白结合后（p56cdc13）才有激酶活性才有激酶活性以以海胆卵海胆卵为对象，为对象，对细胞周期的蛋白表达水平进行深入研究对

8、细胞周期的蛋白表达水平进行深入研究时间步骤1983以以Tim Hunt为代表，由为代表，由Evans于于1983年报道年报道实验三发现发现2种特殊蛋白质，随细胞周期变化而变化，一般种特殊蛋白质，随细胞周期变化而变化，一般在间期积累，分裂期消失，命名为在间期积累，分裂期消失，命名为周期蛋白（周期蛋白（Cyclin A,Cyclin B）结果周期蛋白是进入周期蛋白是进入M期所必须期所必须，从酵母到人类各种生物，从酵母到人类各种生物中均存在，可能参与中均存在，可能参与MPF的调控的调控结论证明了证明了周期蛋白周期蛋白B是是MPF的另一个成分的另一个成分与Maller实验室合作研究者研究者MPF=p3

9、4cdc2(p34cdc28)+p56cdc13(cyclinB)Leland H.Hartwell R.Timothy(Tim)Hunt Sir Paul M.Nurse 2001年年10月月8日美国人日美国人LelandHartwell、英国人、英国人PaulNurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。获诺贝尔生理医学奖。cdc28周期蛋白周期蛋白cdc2三、细胞周期蛋白三、细胞周期蛋白 特点：特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为个氨基酸的保守序列，称为

10、周期蛋白框周期蛋白框，介，介导与导与CDK结合。结合。作用：作用：激活和引导激活和引导CDK作用于不同底物。作用于不同底物。已知已知30余种，分为余种，分为4类：类：G1型、型、G1/S型、型、S型、型、M型。型。PEST序列与序列与G1期周期蛋白更新有关期周期蛋白更新有关9aa:RXXLGXIXNM 期周期周期蛋白期蛋白40aa:Lys富富集，参与泛素集，参与泛素介导降解介导降解G1 期期周期蛋周期蛋白白介导周期蛋白与介导周期蛋白与CDK结合结合周期蛋白框：周期蛋白框：介导与不同介导与不同CDK结合结合破坏框：破坏框：将泛素（遍在蛋白）连接到破坏框上将泛素（遍在蛋白）连接到破坏框上 G1期周

11、期蛋白：期周期蛋白：只在只在G1期表达，只在期表达，只在G1期和期和S期转化过程中执行调节功能。期转化过程中执行调节功能。种类：种类：cyclin C、D、E、Cln1、Cln2、Cln3 举例：举例：在生长因子的刺激下，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸磷酸化，释放转录因子化，释放转录因子E2F，促进许多基因的转录，促进许多基因的转录，如编码如编码cyclinE、A和和CDK1的基因。的基因。M期周期蛋白：期周期蛋白：在间期表达和积累，到在间期表达和积累，到M期时才期时才表现出调节功能。表现出调节功能

12、。种类：种类：cyclinA、cyclinB 举例：举例：cyclinA、cyclinB与与CDK1结合，结合，CDK1引引起染色体凝缩、核膜解体等。起染色体凝缩、核膜解体等。不同的不同的周期蛋白周期蛋白与不同的与不同的CDK结合，结合，调节不同的调节不同的CDK激酶的活性。激酶的活性。CDK（cyclin-dependent kinase）（1）CDK的种类的种类 （2）CDK的分子结构的分子结构 CDK抑制因子抑制因子四、四、CDK和和CDK抑制因子抑制因子 通过通过PCR技术构建人类、非洲爪蟾、果蝇技术构建人类、非洲爪蟾、果蝇cDNA文库，并文库，并对其筛选。对其筛选。分离到分离到10多

13、个多个cdc2同类基因，不同物种的同类基因，不同物种的cdc2基因编基因编码的蛋白质都含有一段相似序列码的蛋白质都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白结合，并且都能和周期蛋白结合，将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性。它们被统称为将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性。它们被统称为周周期蛋白依赖性蛋白激酶期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase)，简称，简称CDK。已经发现已经发现CDK1-CDK13等等CDK激酶。激酶。1、CDK（1 1）与不同类型的周期蛋白相结合的）与不同类型的周期蛋白相结合的CDKCDK激酶复合体激酶复合体脊椎动物脊椎动物芽殖酵母芽殖酵母Cyc

14、linCDKCyclinCDKG1-CDKCyclin D*CDK4、6Cln 3CDK1(CDC28)G1/S-CDKCyclin ECDK2Cln 1、2 CDK1(CDC28)S-CDKCyclin ACDK2Clb 5、6 CDK1(CDC28)M-CDKCyclin BCDK1(CDC2)Clb 1-4CDK1(CDC28)*包括包括D1-3，各亚型，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。(2)不同类型的不同类型的CDK/cyclin复合物及其参与的细胞周期调控复合物及其参与的细胞周期调控可能与周期蛋白结合有关可

15、能与周期蛋白结合有关（2）CDK的分子结构的分子结构不同物种的不同物种的cdc2基因编码的蛋白质都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白结合，基因编码的蛋白质都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白结合，将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性，被统称为将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性，被统称为CDK。CDK抑制因子抑制因子（CDKI）：对细胞周期起负调控作用，分为：）：对细胞周期起负调控作用，分为：INK4家族家族:p16为典型代表，主要抑制为典型代表，主要抑制CDK4和和CDK6活性。活性。Cip/Kip家族家族：p21为典型代表，主要对为典型代表，主要对G1期期CDK（CDK2、CDK3、C

16、DK4和和CDK6）起抑制作用。还能与）起抑制作用。还能与DNA聚合聚合酶酶的辅助因子的辅助因子PCNA结合，直接抑制结合，直接抑制DNA的合成。的合成。2、CDKI五、细胞周期运转调控五、细胞周期运转调控细胞周期中的检验点细胞周期中的检验点G1/S检验点检验点：检查检查DNA是否损伤？是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？细胞体积是否足够大？S期检验点：期检验点：DNA复制是否完成？复制是否完成？G2/M检验点：检验点：检查检查DNA是否损伤？是否损伤？细胞体积是否足够大？细胞体积是否足够大？中中-后期检验点后期检验点（纺锤体组装检验点）（纺锤体组装检验点）c

17、ellcycleregulation1、CDK1激酶激酶 Cdc2蛋白蛋白：在细胞周期中，含量相对稳定。：在细胞周期中，含量相对稳定。周期蛋白周期蛋白B：G1期晚期开始合成，期晚期开始合成，G2期达最大期达最大值。值。周期蛋白周期蛋白B含量达到一定程度，含量达到一定程度，CDK1激酶活激酶活性始现，到性始现，到G2晚期，晚期，CDK1激酶活性最大。激酶活性最大。（一）G2/M期转化与期转化与CDK1激酶的关键性调控作用激酶的关键性调控作用（一）G2/M期转化与期转化与CDK1激酶的关键性调控作用激酶的关键性调控作用cyclinB在在CDK1激酶活性调节中的作用激酶活性调节中的作用 CDK1激酶

18、激酶使某些蛋白质磷酸化，改变其下游的使某些蛋白质磷酸化，改变其下游的某些蛋白质的结构和启动其功能，实现调控细胞某些蛋白质的结构和启动其功能，实现调控细胞周期。例如：周期。例如：组蛋白组蛋白H1磷酸化：导致磷酸化：导致染色体的凝集染色体的凝集；核纤层蛋白核纤层蛋白A、B、C磷酸化：导致磷酸化：导致核纤层解体、核纤层解体、核膜消失核膜消失；核仁蛋白核仁蛋白磷酸化：导致磷酸化：导致核仁解体核仁解体。2、CDK1激酶活性的调控 先决条件先决条件：周期蛋白与：周期蛋白与CDK结合结合 修饰修饰：对一些：对一些重要位点进行磷酸化修饰重要位点进行磷酸化修饰，对对CDK激酶活性起重要调节作用。激酶活性起重要调

19、节作用。CDK1激酶活性的综合调控激酶活性的综合调控（教材（教材p305）（二）（二）M期周期蛋白与分裂中期向后期转化期周期蛋白与分裂中期向后期转化 细胞周期运转到分裂中期后，细胞周期运转到分裂中期后，M期期周期蛋白周期蛋白B/A 与与CDK1分离，在分离，在APC介导下，通过泛素化途介导下，通过泛素化途径而降解。径而降解。CDK1激酶活性丧失，蛋白质（激酶活性丧失，蛋白质（CDK1激酶磷激酶磷酸化的）去磷酸化，细胞周期由中期向后期转化。酸化的）去磷酸化，细胞周期由中期向后期转化。在分裂中期，当在分裂中期，当MPF活性达到最高时，激活活性达到最高时，激活后期促进复合后期促进复合物物APC，将泛

20、素连接在，将泛素连接在cyclin B上，上，cyclinB被被蛋白酶体蛋白酶体降解，完成一个细胞周期。降解，完成一个细胞周期。M M期周期蛋白期周期蛋白N N端有一段序列与其降解有关，称端有一段序列与其降解有关，称破坏框破坏框(destruction box)(destruction box)。泛素由泛素由7676个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛

21、素化的蛋白蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。质分解成短肽。APC活性调节：两类活性调节：两类正调控因子：正调控因子：cdc20/Fizzy,cdh1/Fzy等等负调控因子：负调控因子：Emi1,Emi2,Mad2,BubR1等等APC种类：种类：15种，如种，如cdc16,cdc23,cdc27和和BimE等等泛素与周期蛋白的降解：泛素与周期蛋白的降解：多聚泛素化作用多聚泛素化作用(polyubiquitination)泛素活化酶泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme,E1)泛素结合酶泛素结合酶(ubiquitin-conjugatingenz

22、yme,E2)泛素连接酶泛素连接酶(ubiquitinligase,E3)APC的活性调节控制周期蛋白的活性调节控制周期蛋白B的降解的降解当当MPF的活性在有丝分裂中期达到最高峰时的活性在有丝分裂中期达到最高峰时,它被它被CDK所激活，即所激活，即APC磷酸化后被激活；磷酸化后被激活；接着发生周期蛋白接着发生周期蛋白B遍在蛋白多聚化遍在蛋白多聚化,引起周期蛋白引起周期蛋白B的降解；的降解；由于周期蛋白由于周期蛋白B是是MPF的一个必需亚基的一个必需亚基,它的降解势必它的降解势必导致导致MPF的失活；的失活；在在G1期的后期期的后期,APC失活失活,使得周期蛋白使得周期蛋白B的浓度升高的浓度升高

23、,同同时提高时提高MPF的活性的活性,以便进入下一个有丝分裂期。以便进入下一个有丝分裂期。（三）（三）G1/S期转化与期转化与G1期周期蛋白依赖性期周期蛋白依赖性CDK G1期，在生长因子的刺激下，期，在生长因子的刺激下，cyclinD表达，并与表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如结合，使下游的蛋白质如Rb蛋白（成视网膜细胞瘤蛋蛋白（成视网膜细胞瘤蛋白）白）磷酸化而失活，释放出磷酸化而失活，释放出转录因子转录因子E2F，促进许多基因的，促进许多基因的转录，如编码转录，如编码cyclinE、A和和CDK1的基因。的基因。在在G1-S期，期，cyclinE与与CDK2结合，促进细胞进

24、由结合，促进细胞进由G1期向期向S期期转化，并转化，并直接参与中心体复制与调控直接参与中心体复制与调控。TGF抑制抑制cyclinE-CDK2的活性使细胞抑制在的活性使细胞抑制在G1期。期。CyclinE的抗体的抗体能使细胞能使细胞停滞于停滞于G1期。期。CDK2催化催化p107磷酸化，释放磷酸化，释放E2F。在在S期，期，cyclinA与与CDK2结合为结合为S期的主要激酶，期的主要激酶，参与参与DNA复复制制，使使复制因子复制因子RF-A磷酸化而活性增强。磷酸化而活性增强。G1期周期蛋白降解通过期周期蛋白降解通过SCF（Skp-cullin-F-boxprotein）泛素化途径）泛素化途径

25、实现。实现。G1期周期蛋白不含破坏框序列，而含期周期蛋白不含破坏框序列，而含PEST序列，序列，对对G1期周期蛋白降解起促进作用。期周期蛋白降解起促进作用。参与复制的调控因子，如参与复制的调控因子，如p21,p27和和p57等通过泛素等通过泛素化途径降解。化途径降解。SCF具有具有E3泛素连接酶的功能，泛素连接酶的功能，由由Skp1,Cul1和和Rbx1三种亚基构成。三种亚基构成。SCF的底物特异性由的底物特异性由F-box蛋白决定。蛋白决定。APC和和SCF在细胞周期中的活性及其底物在细胞周期中的活性及其底物SCF泛素化依赖蛋白降解途径泛素化依赖蛋白降解途径DNA复制活动调控复制活动调控 复

26、制起始点识别复合物：复制起始点识别复合物：6个亚基，个亚基，ORC1-6 cdc6和和cdc45也是复制所必需的也是复制所必需的“DNA复制执照因子学说复制执照因子学说”：存在于细胞质中，随：存在于细胞质中，随细胞分裂进行，细胞分裂进行，“执照执照”信号与减弱直到消失。信号与减弱直到消失。DNA复制执照因子的本质为复制执照因子的本质为Mcm蛋白，分为蛋白，分为6种种（四）（四）S/G2/M期转换与期转换与DNA复制检验点复制检验点 包括包括S期内部检验点期内部检验点和和DNA复制检验点。复制检验点。S期内部检验点期内部检验点通过通过染色体结构维持蛋白染色体结构维持蛋白SMC1磷酸化实现（磷酸化

27、实现（ATM-MDC1-MRNC等中介物的等中介物的系列催化过种实现），或通过系列催化过种实现），或通过ATM/ATR介导介导的的cdc25A磷酸酶磷酸酶过磷酸化而降解。过磷酸化而降解。复制检验点复制检验点由由ATR/CHK1激活实现。激活实现。ATR/CHK1介导介导cdc25A降解，抑制降解，抑制cyclinE/A-CDK2通路。通路。vDNAdamagecheckpoint:Cell-cycleprogressionisblockedbyDNAdamageandp53How DNA damage arrests the cell cycle in G1.有两个这样的限制点有两个这样的限制

28、点:1.一个在晚一个在晚G1期期:阻止进入期阻止进入期;2.一个在晚一个在晚G2期期:阻止进入期阻止进入期;P53:基因调控蛋白基因调控蛋白.DNA破坏通过破坏通过间接机制激活间接机制激活p53。Mdm2作为作为ubiquitinligase起作用，起作用，导致导致p53用于蛋白酶体用于蛋白酶体（proteasomes）引发的降解）引发的降解.P53磷磷酸化降低了对酸化降低了对Mdm2的连接的连接.P21(CKIprotein)结合到结合到G1/S-Cdk和和S-Cdk，抑制其活性，因而，抑制其活性，因而阻断阻断了期进入期了期进入期.生长因子是与细胞增殖有关的信号物质，已知几生长因子是与细胞增

29、殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖。十种，多数能促进细胞增殖。作用方式：旁分泌。作用方式：旁分泌。信号通路：信号通路：ras、cAMP、磷脂酰肌醇途径。、磷脂酰肌醇途径。如通过如通过rasras途径，激活途径，激活MAPKMAPK，MAPKMAPK进入细胞核进入细胞核内，激活内，激活c-mycc-myc，mycmyc作为转录因子促进作为转录因子促进cyclin cyclin D D、SCFSCF、E2FE2F等等G1-SG1-S有关的基因表达，细胞进有关的基因表达，细胞进入入G1G1期。期。Currentmodelforregulationoftheeukaryoticcellcycle总结总结1.简述简述p34cdc2/cyclin B 蛋白激酶的发现过程。蛋白激酶的发现过程。2.细胞周期中有哪些主要检验点？细胞周期中有哪些主要检验点？3.举例说明举例说明CDK激酶在细胞周期中是如何执行调节功激酶在细胞周期中是如何执行调节功能的。能的。思考题思考题