中药指纹图谱-课件.ppt

1、掌握中药指纹图谱分析及评价掌握中药指纹图谱分析及评价熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求熟悉中药指纹图谱研究程序及技术要求了解中药指纹图谱测定方法了解中药指纹图谱测定方法淫羊藿淫羊藿HPLC图谱图谱 12批次淫羊藿批次淫羊藿HPLC的指纹图谱及其共有模式的指纹图谱及其共有模式 min01020304050mAU0255075100125150175200 DAD1 A,Sig=270,4 Ref=off(YYHZWTPYYHZWTP000028.D)min01020304050mAU0255075100125150175200 DAD1 A,Sig=270,4 Ref=off(YYHZWTPYY

2、HZWTP000025.D)min02.557.51012.51517.52022.5mAU050100150200250300 DAD1 A,Sig=270,4 Ref=off(F:秋芬YYH-HPLC图谱YYH-HC2YYH-HC2000102.D)2.331 2.509 2.718 3.607 4.711 5.452 6.446 7.982 11.116 12.600 13.890淫羊藿苷 淫羊藿对照指纹图谱淫羊藿对照指纹图谱定义定义:中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药特性的的分析手段，得到的能够标示该中药

3、特性的共有峰共有峰的的图谱，是一种新的中药质量控制模式。图谱，是一种新的中药质量控制模式。中药指纹图谱的基本属性：中药指纹图谱的基本属性：整体性和模糊性整体性和模糊性。整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、整体性：强调多个成分（共有指纹峰）的相对稳定的比例、排列顺序及相互的牵制，反映的质量信息是综合的。排列顺序及相互的牵制，反映的质量信息是综合的。模糊性：中药化学成分复杂性模糊性：中药化学成分复杂性+次生代谢产物化学成分不确次生代谢产物化学成分不确 定性，具有无法精密度量的模糊性。定性，具有无法精密度量的模糊性。指纹图谱分析：强调准确的辨认，而不是精密的计算。指纹图谱分析：强调准

4、确的辨认，而不是精密的计算。图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。图谱比较：强调的是相似性，而不是相同。特点：特点：(1)通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药的真伪通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药的真伪。(2)通过指纹图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能通过指纹图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定。有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定。中药指纹图谱的研究成为当前我国中药基础研究的重中药指纹图谱的研究成为当前我国中药基础研究的重要领域与热点，研究侧重于要领域与热点，研究侧重于:中药指纹图谱的理论探讨；中药指纹图谱的理论探讨；测试指纹图谱的规范化试验

5、；测试指纹图谱的规范化试验；构建指纹图谱的方法学研究；构建指纹图谱的方法学研究；指纹图谱信息化和知识化研究；指纹图谱信息化和知识化研究；指纹图谱在提高中药质控指标方面的研究；指纹图谱在提高中药质控指标方面的研究；指纹图谱指导中药材规范化生产方面的研究；指纹图谱指导中药材规范化生产方面的研究；指纹图谱在开发中药资源方面的研究；指纹图谱在开发中药资源方面的研究；指纹图谱用于研制中药新药等方面的研究。指纹图谱用于研制中药新药等方面的研究。(一一)指纹图谱的产生指纹图谱的产生 指纹指纹(fingerprint)概念起源于法医学，依据每个人的指概念起源于法医学，依据每个人的指纹结构上细微处的绝对差别可以

6、鉴识区分不同的人。法医纹结构上细微处的绝对差别可以鉴识区分不同的人。法医学的学的指纹分析强调的是个体的绝对唯一性指纹分析强调的是个体的绝对唯一性(absolute uniqueness)。近代指纹分析的概念结合生物技术的发展延伸到近代指纹分析的概念结合生物技术的发展延伸到指纹图谱分析，而且应用范围从犯罪学扩大到医学和生命指纹图谱分析，而且应用范围从犯罪学扩大到医学和生命科学的领域。科学的领域。生物样品的指纹图谱分析强调个体的生物样品的指纹图谱分析强调个体的唯一性，侧重于整个物种的唯一性。唯一性，侧重于整个物种的唯一性。中药指纹图谱分析借用法医学中药指纹图谱分析借用法医学“指纹鉴定指纹鉴定”的概

7、念，但的概念，但又不同于常规意义的又不同于常规意义的“指纹指纹”含义。根据中药化学成分的含义。根据中药化学成分的复杂性（或模糊性）和有效成分的整体性，在现阶段还不复杂性（或模糊性）和有效成分的整体性，在现阶段还不可能将中药复杂化学成分搞清楚的情况下，运用多学科交可能将中药复杂化学成分搞清楚的情况下，运用多学科交叉综合技术手段，进行计算机辅助分析检测和评价，叉综合技术手段，进行计算机辅助分析检测和评价，寻找寻找同一药材群体化学成分的相似性，即物种群体内的唯一性。同一药材群体化学成分的相似性，即物种群体内的唯一性。通过建立中药指纹图谱，可以全面反映中药所含内在化学通过建立中药指纹图谱，可以全面反映

8、中药所含内在化学成分的种类和数量，进而反映中药的质量。成分的种类和数量，进而反映中药的质量。中药指纹图谱是以各种波谱、色谱等技术为依中药指纹图谱是以各种波谱、色谱等技术为依托，是一种综合的、可量化的鉴别中药的手段，是托，是一种综合的、可量化的鉴别中药的手段，是当前评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制当前评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。模式之一。建立的中药指纹图谱应满足专属性、重现性建立的中药指纹图谱应满足专属性、重现性和实用性的技术要求。和实用性的技术要求。1.指纹图谱的发展阶段：指纹图谱的发展阶段：初级阶段初级阶段:是确立指纹图谱的建立方法及相似是确立指纹图谱的建立方法

9、及相似度判定。度判定。研究重点主要是测定方法的建立，研究重点主要是测定方法的建立，方法稳定性和适用性考察，化学有效部分基方法稳定性和适用性考察，化学有效部分基础研究，图谱多指标控制等，力求基本说清础研究，图谱多指标控制等，力求基本说清中药化学基础及质量控制参数，将中药质量中药化学基础及质量控制参数，将中药质量控制提到整体量化的高度。控制提到整体量化的高度。高级阶段高级阶段:即指纹图谱特征和药效相关性研即指纹图谱特征和药效相关性研 究，指纹图谱的生物等效性研究。究，指纹图谱的生物等效性研究。中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗中药指纹图谱的研究向多学科的相互渗透、从单指标向多指标（多维多息）的综合

10、透、从单指标向多指标（多维多息）的综合发展，最终建立体现谱效关系的指纹图谱，发展，最终建立体现谱效关系的指纹图谱，确保中药安全、有效和可控。确保中药安全、有效和可控。国内，目前还处在初级阶段。国内，目前还处在初级阶段。1.1.针对中药注射剂这一相对简单的体系，进行大量研究和深针对中药注射剂这一相对简单的体系，进行大量研究和深入探讨。入探讨。2.2.利用指纹图谱手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质利用指纹图谱手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质量，以达到控制工艺操作和原药材的目的，利用指纹图谱量，以达到控制工艺操作和原药材的目的，利用指纹图谱追寻工艺操作中的问题和实现对原药材追寻工艺操作中的

11、问题和实现对原药材GAPGAP的质量要求。的质量要求。3.3.通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作，可控，稳定，显性和量化的目的，提指纹图谱的可操作，可控，稳定，显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平。高整个中药注射剂的质量控制水平。4.4.逐步建立其它类中药制剂，中药复方制剂的指纹图谱。逐步建立其它类中药制剂，中药复方制剂的指纹图谱。在国外，指纹图谱在植物药产品工业指南在国外，指纹图谱在植物药产品工业指

12、南（2000年草案稿）、草药评价指南（年草案稿）、草药评价指南（1996年）以及年）以及英国草药典（英国草药典（1986）、印度草药典（）、印度草药典（1998）、美国草药典）、美国草药典（1999-2001，Monographs）中均将其列入。目的是解决）中均将其列入。目的是解决多数草药有效成分不明，市场商品无法有效鉴别真伪和控多数草药有效成分不明，市场商品无法有效鉴别真伪和控制质量的问题。制质量的问题。要求草药制剂生产商提供半成品的指纹图要求草药制剂生产商提供半成品的指纹图谱以保证品种的真实性和产品的指纹图谱以证明其批间产谱以保证品种的真实性和产品的指纹图谱以证明其批间产品质量的一致和稳定

13、。品质量的一致和稳定。指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。指纹图谱可按应用对象、测定手段进行不同的分类。按应用对象分类：按应用对象分类：中药材中药材(原料药材原料药材)指纹图谱指纹图谱中药原料药中药原料药(包括饮片、配伍颗粒包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱指纹图谱中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱中药中间体（工艺生产过程中间产物）指纹图谱中药制剂指纹图谱中药制剂指纹图谱按测定方法分类按测定方法分类:中药化学指纹图谱中药化学指纹图谱 指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立指纹图谱系指采用色谱、光谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。中药化的用以表征中药化

14、学成分的特征的指纹图谱。中药化学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的意学指纹图谱对控制中药质量具有更直接、更重要的意义。义。色谱指纹图谱：色谱指纹图谱：TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等等光谱指纹图谱：光谱指纹图谱：UV、IR、FP、NMR、MS等等中药生物指纹图谱中药生物指纹图谱包括：中药材包括：中药材DNA指纹图谱指纹图谱 中药基因组学指纹图谱中药基因组学指纹图谱 中药蛋白组学指纹图谱中药蛋白组学指纹图谱中药材中药材DNA指纹图谱主要是测定各种中药材的指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗传性由于每个物种基因的唯一性和遗传性，中

15、药材，中药材DNA指纹图谱指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材对中药材GAP基地建设、中药材种植规范基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。质资源和药材道地性研究极为有用。中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因用中药作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称为为生物活性指纹图谱。生物活性指纹图谱。中

16、药蛋白组学指纹图谱是指纹图谱研究的最高级中药蛋白组学指纹图谱是指纹图谱研究的最高级阶段，可确定中药的主要活性物质。阶段，可确定中药的主要活性物质。一、色谱法一、色谱法 色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，色谱技术具有极强的分离能力和极大的适应性，中药指纹图谱首推色谱法中药指纹图谱首推色谱法，其常用的方法有：，其常用的方法有：TLC、GC、HPLC、HPCE、SFC等。等。TLC独具的优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，较柱独具的优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，较柱色谱多了色彩这一可比色谱多了色彩这一可比“参数参数”，并可进一步配合色谱扫，并可进一步配合色谱扫描或数码处理得到不同层

17、次轮廓图谱和相应的积分数据。描或数码处理得到不同层次轮廓图谱和相应的积分数据。用固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描得到扫描图谱，用固定波长对薄层展开的各斑点进行扫描得到扫描图谱，比目测的薄层图谱更为客观准确，还可计算各峰的峰面积比目测的薄层图谱更为客观准确，还可计算各峰的峰面积与标准峰的比作量化指标，具有指纹意义与标准峰的比作量化指标，具有指纹意义。现代薄层色谱技术：如高效薄层色谱（现代薄层色谱技术：如高效薄层色谱（HPTLC）、）、TLC-GC、TLC-IR 2.气相色谱气相色谱(GC)：外界影响因素较少，稳定性较好，检测设备可选性外界影响因素较少，稳定性较好，检测设备可选性较大。适用于含挥

18、发性成分中药的指纹图谱的研究和较大。适用于含挥发性成分中药的指纹图谱的研究和应用。应用。新技术：如毛细管气相色谱（新技术：如毛细管气相色谱（CGC）、气相色谱）、气相色谱质质谱联用（谱联用（GC-MS）、气相色谱）、气相色谱傅里叶变换红外光傅里叶变换红外光谱联用（谱联用（GC-FTIR）等，其中最引人注目是裂解气）等，其中最引人注目是裂解气相色谱（相色谱（用于不能直接使用用于不能直接使用GC分析的样品分析的样品）。）。3.高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)：稳定性和重现性好、流动相选择性广、检测器稳定性和重现性好、流动相选择性广、检测器种类多、色谱柱可反复使用等特点，样品适种类多、色谱柱可反

19、复使用等特点，样品适用范围广。目前已成为构建中药指纹图谱最用范围广。目前已成为构建中药指纹图谱最主要和常用的方法。主要和常用的方法。新的高效通用检测器的发展，如二极管阵列检新的高效通用检测器的发展，如二极管阵列检测器（测器（DAD）、蒸发光散射检测器（）、蒸发光散射检测器（ELSD）、电）、电喷雾电离喷雾电离-质谱（质谱（ESI-MS）、质谱）、质谱-质谱（质谱（MS-MS）等设备的引入，使得等设备的引入，使得HPLC适用性与分辨率显著提适用性与分辨率显著提高，从而使复杂样品的分析成为可能，还可对主要高，从而使复杂样品的分析成为可能，还可对主要色谱峰进行归属。色谱峰进行归属。注射用双黄连指纹图

20、谱注射用双黄连指纹图谱相关性相关性 4.高效毛细管电泳（高效毛细管电泳（HPCE）适用于大部分化学成分，特别是生物大分子肽适用于大部分化学成分，特别是生物大分子肽和蛋白的分离，和蛋白的分离，能实现大小分子能实现大小分子(如蛋白质和如蛋白质和氨基酸氨基酸)同时分析同时分析，得到的指纹图谱能更多的，得到的指纹图谱能更多的反映中药的成分特性，如动物类中药的指纹反映中药的成分特性，如动物类中药的指纹图谱研究。图谱研究。中药指纹图谱研究中最常用的两种模式：毛中药指纹图谱研究中最常用的两种模式：毛细管凝胶电泳细管凝胶电泳(CGE)、胶束电动毛细管色谱、胶束电动毛细管色谱(MECC)。重现性可通过采用淌度比

21、法、对照品校正法、重现性可通过采用淌度比法、对照品校正法、保留指数法等加以提高。保留指数法等加以提高。光谱法是指用一定波长的光照射或扫描中光谱法是指用一定波长的光照射或扫描中药样品，取得特定的图谱和数据。其主要方药样品，取得特定的图谱和数据。其主要方法有：法有：UV、IR、FS、NMR、MS、AAS等。等。1.紫外紫外-可见光谱法（可见光谱法（UV-VIS）指纹图谱的构建指纹图谱的构建：是多种成分特征吸收光谱叠加而成：是多种成分特征吸收光谱叠加而成的复合谱。在一定条件下，中药多成分的复杂组合的复合谱。在一定条件下，中药多成分的复杂组合也有一定规律性，从而在紫外叠加光谱上显示出一也有一定规律性，

22、从而在紫外叠加光谱上显示出一定的特异性和稳定性。定的特异性和稳定性。光谱特征分析光谱特征分析：最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰、：最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰、吸收系数、吸收度比值、吸收峰的数目、峰形、峰吸收系数、吸收度比值、吸收峰的数目、峰形、峰高等。高等。如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。导数光谱法提高分辨率。2.红外光谱（红外光谱（IR）指纹图谱的构建指纹图谱的构建：是多种成分在红外光区域内：是多种成分在红外光区域内(4000400cm-1)总体官能团吸收的叠加。总体官能团吸收的叠加。图谱分析图谱分析：主

23、要着眼于所测得的红外光谱的轮廓特征（全谱图：主要着眼于所测得的红外光谱的轮廓特征（全谱图形）的比较，不用将各主要吸收峰归宿，只要在所扫描的波形）的比较，不用将各主要吸收峰归宿，只要在所扫描的波数范围内比较吸收峰的波数、同一波数吸收峰的形状和强度、数范围内比较吸收峰的波数、同一波数吸收峰的形状和强度、“指纹区指纹区”面貌等方面的差异即可。面貌等方面的差异即可。新技术新技术：如傅里叶变换红外光谱（：如傅里叶变换红外光谱（FTIR）、二维相关红外光）、二维相关红外光谱（谱（2D FTIR）、近红外光谱（）、近红外光谱（NIR）、傅里叶变换拉曼光）、傅里叶变换拉曼光谱（谱（FT-Raman）等。）等。

24、3.核磁共振波谱法（核磁共振波谱法（NMR）在规范的提取分离条件下，植物类中药的在规范的提取分离条件下，植物类中药的1H-NMR图图谱与植物品种间存在着严格的对应关系。可通过对谱与植物品种间存在着严格的对应关系。可通过对1H-NMR指纹图上显示特征共振信号指纹图上显示特征共振信号(如化学位移、如化学位移、峰面积、耦合关系等峰面积、耦合关系等)的分析，来建立中药的的分析，来建立中药的1H-NMR指纹图谱。指纹图谱。4.质谱法（质谱法（MS）质谱是按照带电粒子（即离子）的质量对电荷的比值质谱是按照带电粒子（即离子）的质量对电荷的比值（m/z）和其相对丰度大小依次排列形成的图谱。）和其相对丰度大小依

25、次排列形成的图谱。中药特征提取物置质谱仪中进行电子轰击裂解为不同中药特征提取物置质谱仪中进行电子轰击裂解为不同的碎片，获得提取物中化学成分的的碎片，获得提取物中化学成分的MS图，不同中图，不同中药所含化学成分的种类及组成比例的不同，所得质药所含化学成分的种类及组成比例的不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步裂解的碎片离子峰谱图显示的分子离子峰及进一步裂解的碎片离子峰（m/z）亦不一致，故质谱具指纹性较强的特征，）亦不一致，故质谱具指纹性较强的特征，可用于中药指纹图谱的测定。可用于中药指纹图谱的测定。中药复方制剂成分复杂采用联用技术建立中药复方制剂成分复杂采用联用技术建立多维多息多维多息特征谱

26、，特征谱，可较好地解决如何体现中药复方制剂的整体性和复杂性的可较好地解决如何体现中药复方制剂的整体性和复杂性的问题。问题。所谓多维，所谓多维，即采用多种分析仪器联用的方式来测定指纹图谱，即采用多种分析仪器联用的方式来测定指纹图谱，各谱图间相互补充，可对复杂供试品有更清晰完整的认识。各谱图间相互补充，可对复杂供试品有更清晰完整的认识。常用的是常用的是HPLC或或CEDADMS-MS)，所得的多维指纹，所得的多维指纹图谱包括色谱峰图，图谱包括色谱峰图，UV图；一级质谱图图；一级质谱图(各个成分的质量各个成分的质量)和二极质谱图和二极质谱图(某成分的特征碎片某成分的特征碎片)。（可得到更多的化学（可

27、得到更多的化学结构信息）结构信息）所谓多息，所谓多息，即指中药复方制剂的特征谱，包括化学和药效两方即指中药复方制剂的特征谱，包括化学和药效两方面的信息。面的信息。药效信息药效信息即化学成分和药效相关性，是通过确定中药复方制剂即化学成分和药效相关性，是通过确定中药复方制剂中的各有效部位中的各有效部位(药效实验肯定的化学部分药效实验肯定的化学部分)和其所含的有效和其所含的有效成分成分(各种化合物各种化合物)间量的比例，间量的比例，从这些比例变化来推算药物从这些比例变化来推算药物的量效关系。的量效关系。多维多息特征谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制多维多息特征谱的建立既能较系统、较完整地解决

28、中药复方制剂面临的保证药效和质量的问题，又为中药研究中缺乏标准剂面临的保证药效和质量的问题，又为中药研究中缺乏标准物质的问题提供了一种新的解决途径。物质的问题提供了一种新的解决途径。一、指纹图谱的要求（三性要求）一、指纹图谱的要求（三性要求）中药指纹图谱应满足中药指纹图谱应满足特征性特征性(专属性专属性或唯一性或唯一性)、重现性重现性和和可操作性可操作性的要求。的要求。首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。首先具备专属性或唯一性。能够表达某品种特征的性质。在满足在满足专属性前提下专属性前提下要有较好的重现性，指同一品种的同要有较好的重现性，指同一品种的同一样品，同一操作条件下，结果

29、的重现性要好，即不同实一样品，同一操作条件下，结果的重现性要好，即不同实验室和不同操作者得到的色谱整体特征应有较高的相似度验室和不同操作者得到的色谱整体特征应有较高的相似度(0.9以上以上)。具有可操作性。指针对不同用途，选用不同分析方法来达具有可操作性。指针对不同用途，选用不同分析方法来达到不同的要求，选择的方法和试验条件应便于推广和便于到不同的要求，选择的方法和试验条件应便于推广和便于操作，要有普遍适用性。操作，要有普遍适用性。当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，当一张指纹图谱不足以表现其全部特征，可用可用几张指纹图谱几张指纹图谱来表现某种中药来表现某种中药(药材或复方药材或复方)的各个不

30、同侧面的特征，从而构成其全貌。对的各个不同侧面的特征，从而构成其全貌。对每一张图谱都应有其特征性。每一张图谱都应有其特征性。min5101520253035mAU0501001502002503001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min10203040506070mAU-500501001502001 2 3 4 6 8 5 7 9 10 12 14 165 17 18 11 13 15(A)(B)min5101520253035mAU0501001502002503001 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min10203040506070mAU-500501001502001

31、 2 3 4 6 8 5 7 9 10 12 14 165 17 18 11 13 15(A)(B)指纹图谱指纹图谱II(203nm)指纹图谱指纹图谱I(280nm)丹参滴丸多元丹参滴丸多元HPLC指纹图谱指纹图谱中药未中药未知检品知检品 图谱测试、分析品质评价方法检验评价标准评价标准计算机信息处理图谱评价不同品种来源、产地、采不同品种来源、产地、采收期或加工炮制的中药收期或加工炮制的中药药效学试验药效学试验中药指纹图谱中药指纹图谱确定图谱参数选择测试条件方法建立及考察1010批次以上批次以上中药样品中药样品固定品种来源、产地、采固定品种来源、产地、采收期和加工炮制的中药收期和加工炮制的中药

32、代表性均一性预处理供试品溶液供试品溶液预处理图谱信息图谱信息图谱分析相关性样品收集：样品收集：要求有一定的数量，以保证供试品的要求有一定的数量，以保证供试品的代表性和代表性和均一性均一性方法建立方法建立：指选取适当的方法建立指纹图谱并进行考察：指选取适当的方法建立指纹图谱并进行考察数据分析：数据分析：对研究过程中所获得数据进行处理，找出对研究过程中所获得数据进行处理，找出共性共性和不同点，和不同点，确定评价指标确定评价指标样品评价：样品评价：指按所确定指标对样品进行品质评价指按所确定指标对样品进行品质评价方法检验方法检验：是指在方法确立后的一段长时间内对更多未知：是指在方法确立后的一段长时间内

33、对更多未知样品进行检验，进一步考察方法的可行性和实用性。样品进行检验，进一步考察方法的可行性和实用性。（一）样品收集（一）样品收集 样品收集是研究指纹图谱最初也是最关键样品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，收集的样品要的步骤，收集的样品要有足够的代表性有足够的代表性。要求。要求收集收集10批次以上批次以上的样品。的样品。样品数越多越好，使样品数越多越好，使得到的指纹图谱更具生物统计学意义。得到的指纹图谱更具生物统计学意义。注意：注意：收集药材样品收集药材样品“批次批次”，其含义与工业产品，其含义与工业产品“批次批次”的含义是完全不同的，的含义是完全不同的，它是指相互独立的样品，即不能它是

34、指相互独立的样品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干批将同一地点或同一渠道同一时间获得的样品分成若干批次样品次样品。不同产地或同一产地不同等级规格的样品，均可视作不不同产地或同一产地不同等级规格的样品，均可视作不同批次。同批次。同一产地的样品，存在不同的种植园和地块之差异，也同一产地的样品，存在不同的种植园和地块之差异，也均可视作不同批次。均可视作不同批次。1样品收集的基本要求样品收集的基本要求（1）药材样品首先要经品种鉴定，中药材及其）药材样品首先要经品种鉴定，中药材及其饮片或炮制品，应符合国家药典、部颁标准、饮片或炮制品，应符合国家药典、部颁标准、地方标准或饮片炮制规范的

35、规定。样品应选用地方标准或饮片炮制规范的规定。样品应选用正品优质道地中药材，或选用规范化栽培基地正品优质道地中药材，或选用规范化栽培基地生产的中药材。生产的中药材。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）(2)动、植物药材样品均应固定品种、药用部位、产地、采收动、植物药材样品均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药材样品应固定产地和炮制、期、产地加工和炮制方法，矿物药材样品应固定产地和炮制、加工方法。对于多品种来源或多药用部位的中药材，应固定加工方法。对于多品种来源或多药用部位的中药材，应固定单一品种或单一药用部位，同时要进行不同

36、品种来源或不同单一品种或单一药用部位，同时要进行不同品种来源或不同药用部位的代表性样品指纹图谱分析比较，找出各品种或各药用部位的代表性样品指纹图谱分析比较，找出各品种或各药用部位之间指纹图谱的共性和特性，药用部位之间指纹图谱的共性和特性，采用其共性指纹标定采用其共性指纹标定该种药材的质量，特征指纹标定药材的品种或药用部位和该该种药材的质量，特征指纹标定药材的品种或药用部位和该品种或药用部位药材的质量。品种或药用部位药材的质量。通常固定一个产地或一个采收通常固定一个产地或一个采收季节，如固定多个产地或多个采收季节，必须考察不同产地季节，如固定多个产地或多个采收季节，必须考察不同产地或不同采收季节

37、的代表性样品指纹图谱的一致性。或不同采收季节的代表性样品指纹图谱的一致性。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）(3)样品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：样品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括：药材名称：药材名称：药材名及其基源（原植、动物的科名、中文名、药材名及其基源（原植、动物的科名、中文名、拉丁学名及药用部位，或矿物的类、族、矿石名及主要成拉丁学名及药用部位，或矿物的类、族、矿石名及主要成分）分）样品来源：样品来源：真实记录样品来自何处，传统产地收集或是资真实记录样品来自何处，传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来

38、自源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买等，以便于生产原料的采购选择买、市场购买或委托购买等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯。和测试数据的可追溯。收集时间及收集人：收集时间及收集人：样品收集时间及收集人姓名。样品收集时间及收集人姓名。货源情况调查：货源情况调查：货源是否充足和稳定等。货源是否充足和稳定等。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）基源鉴定及鉴定人：基源鉴定及鉴定人：产地或产地或GAP基地收集的药基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。如缺原植物，由熟练材结合植物形态鉴定品种。如

39、缺原植物，由熟练的专业人员凭性状或显微特征鉴别。商品混乱的的专业人员凭性状或显微特征鉴别。商品混乱的品种产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药品种产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药典收载品种中的一种。复方制剂中的君药及处方典收载品种中的一种。复方制剂中的君药及处方量大的药材必需重点注意品种的鉴定，以避免今量大的药材必需重点注意品种的鉴定，以避免今后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）质量评估：质量评估：为了便于对色谱的正确分析，减少试验结果的为了便于对色谱的正确分析，减

40、少试验结果的判断误差，首先药材需符合药典或部颁标准规定，并详细记判断误差，首先药材需符合药典或部颁标准规定，并详细记录。所有药材样品均须编号，必要时附药材外形照片。录。所有药材样品均须编号，必要时附药材外形照片。样品的留样、贮藏和标签：样品的留样、贮藏和标签：由于指纹图谱研究周期较长，由于指纹图谱研究周期较长，样品必须在干燥、低温、避光处贮藏，标签必须有编号，收样品必须在干燥、低温、避光处贮藏，标签必须有编号，收集样品的编号应与贮藏样品、试验样品的编号一致。留样数集样品的编号应与贮藏样品、试验样品的编号一致。留样数量应不少于试验实际用量的量应不少于试验实际用量的3倍。以保证试验结果有异议时倍。

41、以保证试验结果有异议时的可追溯。的可追溯。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）（二）供试品溶液制备（二）供试品溶液制备 根据中药中所含化学成分的理化性质和根据中药中所含化学成分的理化性质和检测方法的要求，选择适宜的制备方法。检测方法的要求，选择适宜的制备方法。制制备方法必须确保中药中的主要化学成分或有备方法必须确保中药中的主要化学成分或有效成分在指纹图谱中得以体现。效成分在指纹图谱中得以体现。1.原药材、饮片或提取物供试品溶液的制备原药材、饮片或提取物供试品溶液的制备建立原药材指纹图谱的主要目的建立原药材指纹图谱的主要目的:考察原药材本身的质量情况；

42、考察原药材本身的质量情况；以原药材的指纹图谱为参比，提取物及制以原药材的指纹图谱为参比，提取物及制剂的指纹图谱与之比较，以考察制剂与原药剂的指纹图谱与之比较，以考察制剂与原药材的相关性。材的相关性。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）2.半成品半成品(中间体中间体)供试品溶液的制备供试品溶液的制备 根据提取物或中间体中所含化学成分根据提取物或中间体中所含化学成分的理化性质和检测方法的要求，参考制剂的理化性质和检测方法的要求，参考制剂和相关产品制备工艺，选择适宜的方法进和相关产品制备工艺，选择适宜的方法进行制备。行制备。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求

43、（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）3.各类制剂和相关产品供试品溶液的制备各类制剂和相关产品供试品溶液的制备 建立中药成品指纹图谱的目的是控制建立中药成品指纹图谱的目的是控制最终产品中的成分，使批与批之间能保持最终产品中的成分，使批与批之间能保持稳定和一致，确保成品的质量。稳定和一致，确保成品的质量。可采用直接使用、稀释或者溶剂提取可采用直接使用、稀释或者溶剂提取的方式制备相应的供试品溶液。的方式制备相应的供试品溶液。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）(三三)对照品对照品(参照物参照物)溶液制备溶液制备 建立指纹图谱应设立参照物或参照峰

44、。建立指纹图谱应设立参照物或参照峰。对照品作为参照物：常为供试品中主要成分对照品作为参照物：常为供试品中主要成分 内标物作为参照物内标物作为参照物 稳定的指纹峰稳定的指纹峰制备：根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。制备：根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。(四四)指纹图谱试验研究指纹图谱试验研究 指纹图谱试验方法和试验条件的优选，是通指纹图谱试验方法和试验条件的优选，是通过比较试验，从中选取相对简单易行的方法和条件，过比较试验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和可操作性的要求，并

45、须经过谱的专属性、重现性和可操作性的要求，并须经过方法学验证。方法学验证。首选色谱方法，其中首选色谱方法，其中HPLC法适用范围广，对法适用范围广，对含生物碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素含生物碱、蒽醌、黄酮、有机酸、酚类、木脂素等成分的中药均可采用。等成分的中药均可采用。提取条件、色谱条件需进行优化，使供试品提取条件、色谱条件需进行优化，使供试品中所含成分尽可能地被提取并获得分离，即中所含成分尽可能地被提取并获得分离，即分得分得的色谱峰越多越好的色谱峰越多越好，使中药的内在特性都显现出，使中药的内在特性都显现出来，为中药指纹图谱评价及其品质鉴定提供足够来，为中药指纹图谱评价及其品质鉴定提

46、供足够的信息。的信息。(五五)样品测试及方法学验证样品测试及方法学验证 中药材样品按优化的提取分离方法制备供试品溶中药材样品按优化的提取分离方法制备供试品溶液，在优化的色谱条件下进样测试液，在优化的色谱条件下进样测试。为了验证测试结果的可靠性，为了验证测试结果的可靠性，仪器精密度、供仪器精密度、供试品稳定性、实验方法重复性试品稳定性、实验方法重复性必须经过严格的方必须经过严格的方法学法学 验证。验证。1.精密度试验：精密度试验：主要考察仪器的精密度。取同一供试品溶液，主要考察仪器的精密度。取同一供试品溶液，连连续进样续进样5次以上次以上进行检测，进行检测，各共有峰峰面积比值的各共有峰峰面积比值

47、的RSD3，各共有峰的相对保留时间应在各共有峰的相对保留时间应在平均相平均相对保留时间对保留时间1min内内。或用或用“中药指纹图谱相中药指纹图谱相似度计算软件似度计算软件”计算，计算，相似度应大于相似度应大于0.9。2.稳定性试验：稳定性试验：主要考察供试品的稳定性。取主要考察供试品的稳定性。取同一供试品溶液，分别在不同时同一供试品溶液，分别在不同时间（间（0、1、2、4、8、12、24、36、48h）检测，）检测，考察色谱峰的考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一相对保留时间、峰面积比值的一致性，确定检测时间。致性，确定检测时间。或用或用“中中药指纹图谱相似度计算软件药指纹图谱相似度计算

48、软件”计计算，算，相似度应大于相似度应大于0.9。3.重复性试验：重复性试验：主要考察实验方法的重复性。取同一批号的样主要考察实验方法的重复性。取同一批号的样品品5份以上份以上，分别按照选定的提取分离方法制备供，分别按照选定的提取分离方法制备供试品溶液，并在选定的色谱条件下进行检测，试品溶液，并在选定的色谱条件下进行检测，各各共有峰峰面积比值的共有峰峰面积比值的RSD3，各共有峰的相对各共有峰的相对保留时间应在保留时间应在平均相对保留时间平均相对保留时间1min以内以内。或。或用用“中药指纹图谱相似度计算软件中药指纹图谱相似度计算软件”计算，计算，相似相似度应大于度应大于0.9。指纹图谱的记录

49、时间：采用指纹图谱的记录时间：采用HPLC或或GC法法一般为一般为60min。但。但实验中，应记录实验中，应记录2小时的色谱图，考察小时的色谱图，考察1小时以后的色谱峰小时以后的色谱峰情况，以确定记录时间。情况，以确定记录时间。根据足够样品数（根据足够样品数（10批次以上）测试结果所给批次以上）测试结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（保留时间）出的峰数、峰值（积分值）和峰位（保留时间）等相关参数，确定共有指纹峰（相对保留时间、等相关参数，确定共有指纹峰（相对保留时间、峰面积比值），选取特征指纹峰群（色谱峰组峰面积比值），选取特征指纹峰群（色谱峰组合），制定指纹图谱。采用阿拉伯数字标示共有合

50、），制定指纹图谱。采用阿拉伯数字标示共有峰，峰，用用“S”标示参照物峰。标示参照物峰。中药材指纹图谱要对不同产地、不同等级规格中药材指纹图谱要对不同产地、不同等级规格或不同采收季节等的代表性样品进行分析比较，或不同采收季节等的代表性样品进行分析比较，从中从中归纳出中药材共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为归纳出中药材共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为特征指纹峰。特征指纹峰。对于多来源的中药材，必须考察品种间对于多来源的中药材，必须考察品种间的特异性。的特异性。再将药材、半成品、成品之间的图谱进行比较。再将药材、半成品、成品之间的图谱进行比较。指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性，从指纹图谱的辨认