基因组文库、cDNA文库的构建和筛选课件.ppt

1、 基因组文库、cDNA文库的构建和筛选基因文库是来自于某种生物的不同DNA序列的集合 基因组文库用于构建文库的DNA来源于基因组DNA cDNA用于构建文库的DNA是mRNA群体的拷贝（cDNA），则该文库称之为cDNA文库。cDNA文库不包括不能转录的核基因序列 具有代表性的基因文库应该在最大限度上覆盖所有的原初序列。文库大小 以最大可能可获得某一特定序列的基因文库所必须包含的重组体数的计算方式如下：Nln(1-p)/ln(1-f)P给定的概率，f插入片段大小占总基因组大小的比例 如果给定概率为0.99，插入片段为20kb的情况下，对人类基因组（3*109bp）来说，所需重组体的数目为6.9

2、*105；而对于大肠杆菌而言，仅需要1100个重组体。因此，插入大小仅有510kp的质粒就可以很好地构建原核生物的基因组文库，因为只需要几千个重组体就够了。而对于较大的基因组，较大的插入片段可以使所需的重组体数量减少，这也正是开发黏粒以及YAC载体的原因。基因组DNA 为了构建具有代表性的基因文库，必须将纯化后的基因组DNA进行随机切割，产生适合克隆进所用载体的大小合适的片段 真核生物基因组DNA的提取 提取细胞核为了防止器官（叶绿体、线粒体）DNA的污染 蛋白酶降解及分相抽提去除蛋白质、脂类以及其他的大分子杂质 原核细胞基因组DNA的提取 直接抽提DNA 经提取的基因组DNA是由染色体断裂而

3、成的数百kb大小的长片段构成 长片段的进一步切割。纯化的基因组DNA需要用物理剪切或限制性酶解切割成载体适用的片段（1525Kb或更大）。物理剪切利用振荡、超声等物理方法剪切可以非常随机地进一步将长片段切割成小片段，片段末端通常都是平末端 限制性酶解位点非随机分布。常用的酶是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与 BamHI酶解载体产生的末端相同基因组DNA片段的限制性内切酶酶解 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非随机片段，为了获得1525kb的或更大的基因组DNA片段（适用于噬菌体或黏粒载体的片段），需要进行部分酶解，即通过合理使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶切片段的大小 合适的酶

4、切片段可由琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度纯化回收基因组DNA文库的构建流程提取切割整合转化质粒载体蓝白筛选YAC载体置换型载体 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb，故而该载体主要用来构建基因组文库。如 置换载体（EMBL3等）EMBL3：载体大小为 43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、9kb 和 14kb。从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，

5、重组体将变成 red-gam-，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多克隆位点。载体 质粒载体用于基因组较小的生物，如大肠杆菌，用质粒载体来构建基因组文库，只需5000个克隆就可以达到高于99的覆盖率 构建较大的基因组文库 *噬菌体最大可插入片段，23kb 黏粒45kb 细菌人工染色体（BAC）350kb 酵母人工染色体(YAC)1000kb20060427cDNA文库 mRNA分离、纯化与分离 cDNA的合成 cDNA末端的处理 与载体的连接mRNA分离、纯化与分离 通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA

6、 由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白 由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会富集某些特异序列。所以有一个起始材料的选择问题。mRNA的提取 全长mRNA具有一个polyA的3末端，可以被用于mRNA的分离；可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA 纯化 用结合有寡聚（dT）的磁珠加到细胞裂解液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。检测mRNA 翻译，检测翻译产物：用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液或兔网织红细胞裂解液）来检测mRNA的完整性，也可用凝胶电泳直接检测，用杂交法分离 mRNA

7、。示差筛选（Differential Screening）扣除文库(subtractive library)扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行的办法是构建富含目的基因序列的cDNA文库。应用扣除杂交筛选法便可达到此种目的。扣除杂交

8、（Subtractive Hybridization）扣除杂交法已成功构建了非洲爪蟾原肠期，鼠T淋巴细胞及大鼠前脑等特异性cDNA文库。cDNA的合成 用反转录酶通过向引物（一般为寡聚dT）的3 末端添加dNTP来合成 cDNA的第一条链。用末端转移酶对 cDNA的第一条链的3 末端加尾很容易合成全长的第二链。也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合成第二链。cDNA末端的处理 由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的 方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端cDNA末端的处理 先用单链特异性核酸酶切掉凸出的3/端，

9、再用 Klenow酶补平后加上接头。为避免限制性内切核酸酶切割cDNA内部，在添加接头前先用EcoR甲基化酶甲基化。最后用T4DNA连接酶连接。cDNA末端的处理 末端转移酶可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部末端转移酶末端转移酶与载体的连接 载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体自连接。T4DNA连接酶连接载体与cDNA。噬菌体gt11是构建表达文库的最适载体 质粒载体：cDNA相对较短。噬菌体载体：构建表达cDNA文库与载体的连接筛选流程筛选 从基因文库的大量克隆中鉴定出某个含有目的基因的特定克隆的过程，称为筛选 筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探针可以与其互补序列结合从而

10、检测出含目的基因的克隆。将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性标志探针溶液中保温，检出相应克隆。通常构建核酸探针，要求了解其基因序列或表达产物（蛋白质）的信息探针的制作方法 用聚合酶链式反应（PCR）制作探针 从目的基因的表达产物（蛋白质）的序列信息，可以派生出其可能的DNA序列混合物，根据该序列信息，可以采用PCR技术构建核酸探针 PCR探针 寡聚核苷酸探针：合成仪平板杂交筛选 克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的

11、探针，然后可由放射性自显影鉴定。（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。原位杂交筛选（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。寡聚核苷酸探针抗体探针 表达筛选 通过抗体筛选来检测cDNA编码的蛋白质质粒蛋白A外源蛋白BcDNA表达为与半乳糖苷酶相嵌合的目的基因的融合蛋白，用抗血清来筛选目的cDNA编码的融合蛋白。筛选流程与噬菌斑杂交程序相似。杂交扣留和释放 cDNA与mRNA杂交后可抑制某些mRNA的翻译(杂交扣留翻译).杂交的mRNA被纯化后进行翻译(杂交释放翻译)可鉴定cDNA克隆编码的蛋白染色体步移(Chromosome

12、walking)从文库中分离相邻基因组克隆来克隆目的基因即为染色体步移.染 色 体 步 移 是 先 用 与 疾 病 基 因 最 接 近 的 标 记 DNA 做 为 探 针 从 基 因 库 找 出 一 个 能 够 与 它 杂 交 的 DNA 片 段。这 个 片 段 应 当 包 含 标 记 DNA 的 序 列。假 使 这 片 段 够 长 的 话，它 也 有 可 能 包 含 所 要 的 疾 病 基 因，问 题 就 此 解 决。不 过，基 因 库 内 的 DNA 片 段 长 度 有 限。如 果 疾 病 基 因 与 标 记 DNA 的 距 离 比 载 体 携 带 的 DNA 片 段 还 长，用 标 记

13、DNA 筛 选 出 的 DNA 片 段 必 定 没 有 包 含 疾 病 基 因。1980 年 代，研 究 人 员 迫 切 地 寻 找 CFTR 及 HD 基 因 时 尚 无 YAC 可 用。疾 病 基 因 与 标 记 DNA 的 距 离 远 比 载 体 所 携 带 的 DNA 片 段 还 长。他 们 想 出 了 染 色 体 步 移 的 方 法。虽 然 标 记 DNA 所 制 成 的 探 针 无 法 找 到 包 含 疾 病 基 因 的 片 段，但 所 找 到 的 片 段(即 与 探 针 杂 交 的 片 段)有 一 部 分 可 能 比 标 记 DNA 更 接 近 疾 病 基 因。在 他 们 制 作 的 基 因 库 里，DNA 片 段 之 间 有 部 分 重 叠。因 此 可 以 用 新 找 到 的 片 段 做 为 探 针 寻 找 与 它 重 叠 的 片 段。如 此 重 复 许 多 次 后，应 该 可 以 找 到 包 含 疾 病 基 因 的 片 段。需要利用不同的酶建立两个不同的基因文库，比如EcoR I和BamHI。从文库A中将已知的基因钓出来，然后用来与文库B杂交，可以获得一个或多个克隆，这也说明两个文库是重叠的。然后再用获得的一个克隆杂交文库A，也可能获得一个到多个文库，包括最初筛选到的文库。重复多次杂交，建立一个部分的内切酶图谱，直到找到所要寻找的基因。染色体步移定位目的基因