念珠菌李若瑜课件.ppt

1、 四川大学华西医院第四川大学华西医院第16期国家级继续医学教育项目期国家级继续医学教育项目皮肤真菌病基础和临床研究进展讲习班皮肤真菌病基础和临床研究进展讲习班念珠菌感染概况念珠菌感染概况不同部位念珠菌感染的高危因素不同部位念珠菌感染的高危因素白血病或长期粒细胞缺乏白血病或长期粒细胞缺乏接受皮质激素治疗接受皮质激素治疗移植移植HIV感染感染头颈部照射头颈部照射JCM,2010,48(4):13661377念珠菌感染流行病学念珠菌感染流行病学 非白念珠菌感染比例升高非白念珠菌感染比例升高全球念珠菌监测数据：分析全球念珠菌监测数据：分析1997年年-2007年间全世界年间全世界142个医学中心个医学

2、中心收集的来自患者各部位的收集的来自患者各部位的256,882株念珠菌株念珠菌%Int.J Antimicrobial Agents 2009;34:205209亚洲部分地区念珠菌分布状况亚洲部分地区念珠菌分布状况132C.glabrata42.3%C.parapsilosis21.1%C.tropicalis26.1%非白念念珠菌血症非白念念珠菌血症Edmond et al.Clin Infect Dis 1999;29:239-44.ARTEMIS研究总体结果研究总体结果2001-2009年中国5家医院的念珠菌菌种分布(%)念珠菌病诊断与治疗原则念珠菌病诊断与治疗原则组织病理组织病理直接镜

3、检（直接镜检（LPCB）假菌丝和芽孢假菌丝和芽孢金标准血培养技术的改进金标准血培养技术的改进 敏感度：敏感度：50%解离离心系统（解离离心系统（The lysis centrifugation system）(Wampole Laboratories,USA)培养基成分：含树脂（培养基成分：含树脂（resins）自动血培养系统：自动血培养系统：(BacT/ALERT or BACTEC 9240）利用生物标记诊断利用生物标记诊断 抗原抗原/抗体：免疫学方法抗体：免疫学方法 细胞壁成分：凝集反应细胞壁成分：凝集反应 代谢产物：高效液相色谱代谢产物：高效液相色谱 DNA or RNA：分子生物学方

4、法：分子生物学方法G testG test 可检测多种真菌感染念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等不能用于检测隐球菌和接合菌感染 阳性结果代表存在侵袭性真菌感染 真菌对数生长期释放量最大,可被体内葡聚糖酶降解(glucanase)推荐动态监测，每周检测2次G testG test诊断念珠菌血症诊断念珠菌血症 敏感度为敏感度为62%-100%，特异度为，特异度为64%-88%不同种念珠菌感染对葡聚糖检测无明显影响不同种念珠菌感染对葡聚糖检测无明显影响 白念珠菌白念珠菌,光滑念珠菌光滑念珠菌,热带念珠菌热带念珠菌,克柔念珠菌克柔念珠菌,季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌季也蒙念珠菌

5、和葡萄牙念珠菌 近平滑念珠菌近平滑念珠菌BG水平较低水平较低 BG检测敏感度明显高于检测敏感度明显高于Mannan检测检测 79.6%vs 42%阳性早于血培养阳性和临床症状出现阳性早于血培养阳性和临床症状出现Clin.Infect.Dis.2005.41:654659.Clin.Infect.Dis.2005.41:654659.J.Clin.Microbiol.2005.43:59575962J.Clin.Microbiol.2005.43:59575962J.Clin.Microbiol.2008.46:10091013J.Clin.Microbiol.2008.46:100910132

6、009 IDSA2009 IDSA指南指南确诊念珠菌病的治疗推荐：念珠菌血症确诊念珠菌病的治疗推荐：念珠菌血症念珠菌病类型 首选用药 替代用药 备注念珠菌血症念珠菌血症非中性粒细胞减少非中性粒细胞减少患者患者氟康唑(A-I)负荷剂量负荷剂量 800 mg(12 mg/kg)，随后，随后每日每日400 mg(6 mg/kg)棘白菌素类如卡泊芬净(A-I)负荷剂量负荷剂量70 mg，随后随后50 mg/d脂质体剂型两性酶素脂质体剂型两性酶素B(LFAmB)35 mg/kg/d 两性酶素两性酶素B脱氧胆酸脱氧胆酸(AmB-d)0.51.0 mg/kg/d伏立康唑伏立康唑400 mg(6 mg/kg)

7、，2次次/d，共两剂；随后，共两剂；随后200 mg(3mg/kg)，2次次/d(A-I)对于近期有过唑类暴露史的对于近期有过唑类暴露史的中重度患者选择棘白菌素类中重度患者选择棘白菌素类;初始选择棘白菌素类治疗后初始选择棘白菌素类治疗后可转换为氟康唑可转换为氟康唑;尽可能把掉所有导管尽可能把掉所有导管.念珠菌血症治疗疗程念珠菌血症治疗疗程,等首等首次血培养阴性次血培养阴性,和临床症状和临床症状消失后再用消失后再用14天天所有病人推荐眼部检查所有病人推荐眼部检查念珠菌血症念珠菌血症中性粒细胞减少患中性粒细胞减少患者者棘白菌素类如卡泊芬净：负荷剂量负荷剂量70 mg，随，随后后50 mg/d(A-

8、II)脂质体剂型两性霉素B(LFAmB)：35mg/kg/d(A-II)氟康唑氟康唑(B-III)负荷剂量负荷剂量800 mg(12 mg/kg)随后随后400 mg(6 mg/kg/d)伏立康唑伏立康唑(B-III)400mg(6 mg/kg)，2次次/d，共共2剂剂随后随后200 mg(3mg/kg)，2次次/d大部分患者优先考虑棘白菌素类大部分患者优先考虑棘白菌素类或或LFAmB;氟康唑用于病情不严重或者近期氟康唑用于病情不严重或者近期没有唑类暴露史的患者没有唑类暴露史的患者;伏立康唑推荐在需要额外覆盖曲伏立康唑推荐在需要额外覆盖曲霉时霉时;建议拔掉导管但有争议建议拔掉导管但有争议.Cl

9、inical Infectious Diseases 2009;48:0000002009 IDSA2009 IDSA指南指南 可疑念珠菌病的治疗推荐：经验性治疗可疑念珠菌病的治疗推荐：经验性治疗指南指南经验性抗真菌治疗推荐经验性抗真菌治疗推荐首选用药首选用药替代用药替代用药念珠菌病管理指南念珠菌病管理指南可疑念珠菌病的经验性抗真菌治疗可疑念珠菌病的经验性抗真菌治疗 非中性粒细胞减少患者非中性粒细胞减少患者氟康唑：负荷剂量氟康唑：负荷剂量800mg(12 mg/kg),随后每日随后每日400mg(6mg/kg)(B-III)棘白菌素类如卡泊芬净：负荷剂量棘白菌素类如卡泊芬净：负荷剂量70 mg

10、，随后，随后50 mg/d(B-III)如果患者对其他抗真菌药不耐受或无法获如果患者对其他抗真菌药不耐受或无法获得其他抗真菌药，下列是替代选择：得其他抗真菌药，下列是替代选择：AmB-d(0.51.0 mg/kg/d)或或 LFAmB(35 mg/kg/d)(B-III)中性粒细胞减少患者中性粒细胞减少患者LFAmB：35 mg/kg/d(A-I)卡泊芬净：负荷剂量卡泊芬净：负荷剂量70 mg，随后，随后50mg/d(A-I)伏立康唑：伏立康唑：6mg/kg，静脉，静脉2次次/d，共，共两剂；随后两剂；随后3mg/kg，2次次/d(B-I)氟康唑：负荷剂量氟康唑：负荷剂量800mg(12mg/

11、kg),随后随后每日每日400mg(6mg/kg)(B-I)伊曲康唑：每日伊曲康唑：每日200mg(3mg/kg)，2次次/dAmB-d：有效的替代选择，但是毒性危险：有效的替代选择，但是毒性危险高于高于 LFAmB(A-I)Clinical Infectious Diseases 2009;48:000000*对于接受三唑类预防治疗的患者不应使用三唑类进行经验治疗(B-II)酵母及酵母样真菌鉴定酵母及酵母样真菌鉴定 酵母（酵母（yeast）是糊状或膜样发育形态菌群的总称）是糊状或膜样发育形态菌群的总称 菌落平滑湿润，乳酪状或薄膜样，无气生菌丝菌落平滑湿润，乳酪状或薄膜样，无气生菌丝 单细胞性

12、真菌单细胞性真菌,无性繁殖多数为芽生，少数为裂殖无性繁殖多数为芽生，少数为裂殖 有性繁殖不产生子实体有性繁殖不产生子实体酵母菌分类位置酵母菌分类位置Bai FY，CBS-Nanjing Course酵母的生活史酵母的生活史实验室鉴定基本流程实验室鉴定基本流程临床临床标本标本PDA,SDA28度培养度培养不能生长不能生长鼻孢子菌、肺孢子菌、鼻孢子菌、肺孢子菌、马拉色菌（厚皮除外）马拉色菌（厚皮除外）芽孢和芽孢和/或假菌丝或假菌丝关节孢子关节孢子念珠菌、隐球菌、念珠菌、隐球菌、红酵母等红酵母等毛孢子、地霉等毛孢子、地霉等有隔菌丝有隔菌丝无隔菌丝无隔菌丝担子菌、子囊担子菌、子囊菌菌接合菌等接合菌等酵

13、母菌分类依据酵母菌分类依据种鉴定依据种鉴定依据念念 珠珠 菌菌 属属 特特 性性 常见病原性念珠菌常见病原性念珠菌 白念珠菌（白念珠菌（Candida albicansCandida albicans）热带念珠菌（热带念珠菌（C.tropicalisC.tropicalis）克柔念珠菌（克柔念珠菌（C.kruseiC.krusei）近平滑念珠菌（近平滑念珠菌（C.parapsilosisC.parapsilosis)光滑念珠菌光滑念珠菌 （C.glabrataC.glabrata)乳酒念珠菌（乳酒念珠菌（C.kefyrC.kefyr）季也蒙念珠菌（季也蒙念珠菌（C.guilliermondii

14、C.guilliermondii）少见病原性念珠菌少见病原性念珠菌 链状念珠菌（链状念珠菌（C.catenulataC.catenulata）西弗念珠菌（西弗念珠菌（C.ciferriiC.ciferrii）海默郎尼念珠菌（海默郎尼念珠菌（C.haemuloniiC.haemulonii）解脂念珠菌（解脂念珠菌（C.lipolyticaC.lipolytica）葡萄牙念珠菌（葡萄牙念珠菌（C.lusitaniaeC.lusitaniae）挪威念珠菌（挪威念珠菌（C.norvegensisC.norvegensis）铁红念珠菌（铁红念珠菌（C.pulcherrimaC.pulcherrima）皱

15、落念珠菌（皱落念珠菌（C.rugosaC.rugosa）产朊念珠菌（产朊念珠菌（C.utilisC.utilis）维丝念珠菌（维丝念珠菌（C.viswanathiiC.viswanathii）涎沫念珠菌（涎沫念珠菌（C.zeylanoidesC.zeylanoides）原理原理：白念珠菌在：白念珠菌在有营养的液体环境有营养的液体环境中中35培养，可从培养，可从酵母细胞生出芽管。酵母细胞生出芽管。结果结果：白念珠菌可：白念珠菌可在在2h内生成芽管，内生成芽管，热带念珠菌和其他热带念珠菌和其他念珠菌则否。念珠菌则否。酵母菌鉴定酵母菌鉴定生理生化方法生理生化方法 CHROMagar Candida(

16、48hr)API 20C AUX(48-72hr)RapID Yeast Plus System(4-5hr)自动生化系统自动生化系统 ID 32C strip system(24-48hr)Vitek Yeast Biochemical Card system Vitek 2 ID-YST card system(24hr)Quantum II Biolog YT MicroPlate system(Biolog,USA)原理：几种常见念珠菌独特的酶底物与显原理：几种常见念珠菌独特的酶底物与显色基团化学结合色基团化学结合 既可用于检测，又可根据菌落颜色用于鉴既可用于检测，又可根据菌落颜色用于

17、鉴定定95%以上的以上的白念珠菌白念珠菌（绿、翠绿）、（绿、翠绿）、热热带念珠菌带念珠菌（蓝）、（蓝）、克柔念珠菌克柔念珠菌（粉红，模（粉红，模糊有微毛），糊有微毛），85%的的光滑念珠菌光滑念珠菌（紫），（紫），其它念珠菌呈白色。其它念珠菌呈白色。3037培养培养48h后观察结果。后观察结果。Vitek 2 ID-YST card systemGerm tube 4 hC.albicansC.dubliniensis2-4 daysincubation24 h48 h48 hIn vitro susceptibility testing经典方法经典方法7 days2-4 天24 h48 h培

18、养 解离离心解离离心83%较血培养更早期较血培养更早期J Clin Microbiol 1984;19:126-8.鉴别培养基鉴别培养基酵母菌鉴定基本流程酵母菌鉴定基本流程 酵母纯培养酵母纯培养 玉米粉吐温琼脂培养基玉米粉吐温琼脂培养基(25)假菌丝（假菌丝（+）假菌丝（假菌丝（-）厚壁孢子（厚壁孢子（+）厚壁孢子（厚壁孢子（-）尿素酶试验（尿素酶试验（+）尿素酶试验（尿素酶试验（-）白念珠菌白念珠菌 光滑念珠菌光滑念珠菌 关节孢子（关节孢子（+）关节孢子（关节孢子（-）酵母属酵母属 芽孢（芽孢（+）菌落无胡萝卜色菌落无胡萝卜色 菌落呈胡萝卜色菌落呈胡萝卜色 芽孢（芽孢（+）芽孢（芽孢（-）念

19、珠菌属念珠菌属 红酵母属红酵母属 毛孢子菌属毛孢子菌属 地霉属地霉属 咖啡酸试验咖啡酸试验 有棕色色素有棕色色素 无棕色色素无棕色色素 新生隐球菌新生隐球菌 隐球菌属隐球菌属 PCR PCR 检测和鉴定检测和鉴定多引物多引物多样本制备多样本制备高敏感度高敏感度:1-100 cells/mlpan-fungal PCR敏感度：敏感度：100%(多个标本多个标本)与治疗一致与治疗一致J Clin Microbiol 1997;35:1353-60SPEED培养后鉴定培养后鉴定分子鉴定分子鉴定 PCR-EIA RLB,AFLP,SSCP,RAPD 基因芯片基因芯片 PNA-FISH(fluoresc

20、ein-labeled peptide nucleic acid fluorescent in-situ hybridization)26S rRNA,Candida albicans,C.glabrata sensitivity:100%,specificity:100%JCM,2002,40:2182-2186核糖体基因SSU5.8SITS2LSUITS1D1/D2 IGS2IGS15S-General presence(involved in cell replication).-Not protein-coding,no evolutionary pressure.-Multicopy

21、.-No gene family.-(Very)variable and(very)conserved domains.rRNA(rDNA)gene-Small Subunit(SSU)rDNA(18S)-Large Subunit(LSU)rDNA(26S,28S)-Internal Transcribed Spacer(ITS)-Intergenic Spacer(IGS)常选用的基因常选用的基因lHybridization Buffer with PNA probel90 min.at 55HybridizationlWash solutionl30 min.at 551WashlMou

22、nting mediuml2 min.at RTMounting2 min.at RTExaminationPNA-FISH procedureHybridizationCandida albicans-fluoresent(in situ)hybridization(FISH)with SSU rDNA probeZhu et al.AAA.San Francisco,9-12th September 2004Chip and probe:Candida spp.Aspergillus spp.Clinical samples:10-20 cfu/ml body fluid PCR elec

23、trophoresis:75.6%DNA microarray:87.9%Gene chip-DNA Microarray Clinical sampleA.DNA extractionB.PCR&labelingC.SMART oligo array D.HybridizationE.Detection F.DiagnosisSMART principle6666 获取谱图数据分析样品处理样品处理上机检测上机检测未知病原菌未知病原菌微生物鉴定流程微生物鉴定流程挑取菌落挑取菌落67鉴定方法用时成本（元/个）操作复杂程度通量传统方法表型鉴定法7-14天200操作复杂，需专业人员低16rDNA鉴定

24、法1-2天80操作复杂，需专业人员低DNA-DNA杂交法1-2天1000操作复杂，需专业人员5个/天脂肪酸组分分析法1-2小时1000需专业人员10个/天MALDI-TOF MS 技术3-5分钟4操作简单，自动化处理400个/天MALDI-TOF MS技术：耗时短、成本低、通量高技术：耗时短、成本低、通量高“Proteomic phenotyping is revolutionizing diagnostic mycology as fully reflecting species/morph varieties but often overcoming taxonomic hindrance.”Chierico FD et al.J of Proteomics 2012;75:3314-30.此课件下载可自行编辑修改，供参考！此课件下载可自行编辑修改，供参考！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！部分内容来源于网络，如有侵权请与我联系删除！