抗生素敏感实验课件.ppt

1、第三十四章抗微生物药物和敏感性试验抗微生物药物和敏感性试验陈文昭第一节 临床常用抗菌药物临床常用抗菌药物w抗菌药物（抗菌药物（antibacterial agents）:具有杀具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。w抗生素：细菌、真菌、放线菌等的代谢产物抗生素：细菌、真菌、放线菌等的代谢产物化学合成药物：经化学改造的半合成抗生素化学合成药物：经化学改造的半合成抗生素和化学合成药物和化学合成药物抗菌药物：抗菌药物：v 对病原微生物具有较高的对病原微生物具有较高的 “选择性毒性作用选择性毒性作用”v 对患者不造成损害对患者不造成损害抗菌药物的作用机制a.a.

2、干扰细菌细胞壁的合成干扰细菌细胞壁的合成b.b.损伤细菌细胞膜损伤细菌细胞膜c.c.影响细菌蛋白质的合成影响细菌蛋白质的合成d.d.抑制细菌核酸的合成抑制细菌核酸的合成e.e.抑制细菌叶酸的代谢抑制细菌叶酸的代谢f.f.抑制结核环脂酸的合成抑制结核环脂酸的合成一、青霉素类抗生素w天然青霉素：青霉素G 青霉素V 不产青霉素酶的G+球菌和G-球菌 w耐青霉素酶青霉素：苯唑西林 氯唑西林 奈夫西林 氟氯西林 产青霉素酶的G+菌和G-球菌w氨基组青霉素：氨苄西林 阿莫西林等 青霉素G敏感的细菌，大部分大肠、奇变、流感等G-菌。w羧基组青霉素：替卡西林 羧苄西林等 氨苄西林无效的G-菌，产-内酰胺酶的肠

3、杆菌和假单胞菌有作用w脲基组青霉素：美洛西林 阿洛西林 派拉西林等 75克雷伯菌、铜绿假单胞菌有抑制作用，肠杆菌、厌氧菌有好作用、对肠球菌和链球菌强于羧基组w广谱青霉素：作用机制w 青霉素类抗生素作用于细胞壁合成后阶段的酶 阻断肽聚糖合成的最后阶段肽聚糖链的组装和三维结构的构建。该阶段由下面几种酶催化完成：转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶 不同-内酰胺类抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用二、头孢菌素类抗生素w第一代头孢菌素：头孢噻吩、头孢唑啉等 对G+菌有较强作用 w第二代头孢菌素：头孢呋辛、头孢克洛等 对产-内酰胺酶的G-杆菌有作用w第三代头孢菌素：头孢噻肟、头孢他啶等 对产-内酰胺酶

4、的G-杆菌有较强的作用w第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗等 对肠杆菌科细菌和铜绿假单孢菌作用强作用机制w 头孢菌素类抗生素和青霉素结合蛋白结合,抑制细菌细胞壁合成。PBP位于质膜，不同的头孢菌素与不同的PBP结合，发生不同的效应，使菌形成丝状体或球体，最终溶解死亡。三、其他-内酰胺类抗生素w单环-内酰胺类抗生素：氨曲南 对G-杆菌作用强w头霉素类：头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑 对G+菌和产ESBLS有较好作用w氧头孢烯类：拉氧头孢-氧头孢烯类衍生物 对产-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用，对产酶的金葡菌也有一定作用w碳青霉烯类抗生素：亚胺培南、美洛培南等 对G-杆菌（除嗜麦芽窄食单胞菌外）有很

5、强的活性三、其他-内酰胺类抗生素-内酰胺酶抑制剂内酰胺酶抑制剂-与与-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性克拉维酸 可从链霉菌培养液中分离得到舒巴坦 半合成的酶抑制剂他唑巴坦 半合成的酶抑制剂青霉素+-内酰胺酶抑制剂 四、氨基糖苷类抗生素w链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素 w庆大霉素、福提霉素w阿米卡星、奈替米星、地贝卡星w革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性；革兰阴性球菌效果差；革兰阳性球菌有一定活性w大观霉素、丙大观霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原体敏感作用机制w 氨基糖苷类抗生素和细菌核糖体30S小亚基发生不可逆的结合，抑制MRNA的转录和蛋白合成；造成遗传密码子的错读，产

6、生无意义的蛋白质；吸附在菌体表面，造成细胞膜的损伤，导致膜的渗漏，胞内的K+、腺嘌呤等物质外漏。喹诺酮类抗生素w第一代喹诺酮类抗生素：奈啶酸等 大肠杆菌有作用w第二代喹诺酮类抗生素：环丙沙星、氧氟沙 星、诺氟沙星等 对G+菌和G-菌均有作用w第三代喹诺酮类抗生素（超广谱类抗生素）：左氧氟沙星、司帕沙星等 对G+菌（如MRS、PRSP、肠球菌）作用强于二代4-8倍作用机制w 作用于DNA旋转酶,干扰细菌DNA的修复和重组六、大环内酯类抗生素w常用的有：红霉素、麦迪霉素等 主要用于G+菌，对苛养菌及厌养菌有作用，对衣原体、支原体、立克次体、螺旋体等有抑制作用w新一代大环内酯类抗生素：阿齐霉素、罗红

7、霉素、克拉霉素、地红霉素等 较红霉素有更强的抗菌活性作用机制w 大环内酯类抗生素可逆结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上,抑制肽酰基转移酶,影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素w四环素类抗生素 广谱抗生素 米诺环素 多西环素等 四环素类抗生素主要与细菌30S核糖体亚单位结合，阻滞氨酰基转移RNA与信使RNA核蛋白体的受位位点的结合，阻滞肽链延伸，抑制蛋白质合成。七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素w氯霉素类抗生素 易进入脑组织 氯霉素 甲砜霉素 氯霉素主要作用于细菌70S核糖体的50S亚基，使肽链延长受阻而抑制蛋白质合成。七、四环素、氯霉素和

8、林可酰胺类抗生素w林可酰胺类抗生素 盐酸林可霉素 克林霉素 G+球菌、白喉杆菌、破伤风 梭菌、厌氧菌、沙眼衣原体 林可酰胺类抗生素与细菌50S核糖体亚基结合，抑制蛋白质合成，并可干扰肽酰基的转移，阻止肽链的 延长。八、糖肽类抗生素w万古霉素 替考拉宁 对 G+球菌有强大的活性w多粘菌素B和E G-菌强大的活性w 糖肽类抗生素与一个或多个肽聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成复合物，可阻断肽聚糖合成中的转糖基酶、转肽基酶及D-D羧肽酶的作用。磺胺类药物及增效剂w用于全身感染，口服吸收好：磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；w用于肠道，口服吸收差：柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶；w局部应用

9、：磺胺米隆、磺胺醋酰钠作用机制w 磺胺类药物分子结构中含有对氨基笨磺酰胺，能竟争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶结合，使菌体内核酸合成重要物质辅酶F（四氢叶酸）钝化而导致细菌生长受到抑制。w 甲氧苄胺嘧啶（TMP）能与二氢叶酸还原酶结合，抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸还原成四氢叶酸受阻而达到抑菌目的。其他合成抗菌药w硝基呋喃类：用于肠道、尿路感染和外用 呋喃坦啶、呋喃唑酮 干扰细菌体内的氧化还原酶系统，阻断细菌的代谢，产生抑杀细菌的作用其他合成抗菌药w硝基咪唑类：甲硝唑、替硝唑 用于厌氧菌 硝基咪唑类药物被厌氧菌还原而阻断DNA合成，从而阻止DNA的转录复制，导致细菌死

10、亡。替硝唑可干扰DNA合成，并能穿透细胞膜，快速进入细胞内。第二节 抗菌药物敏感性试验w抗菌药物敏感性试验的意义w试验常规抗菌药物选择w抗菌药物敏感性试验的方法 肉汤稀释法 琼脂稀释法 纸片琼脂扩散法 E试验抗菌药物敏感性试验的意义w预测疗效w指导医生合理选择抗生素w耐药监测，分析耐药变迁，掌握耐药菌感染的流行情况，控制预防耐药菌感染的发生和流行试验常规抗菌药物选择w根据NCCLS标准：wA组：常规首选药物wB组：临床使用主要抗生素wC组：对A组药物耐药的流行菌株，对A组过敏的病人和不常见的细菌wU组：仅用于尿道中分离的细菌方法：肉汤稀释法w常量稀释法和微常量稀释法w培养基：M-H肉汤（苛养菌

11、加添加剂）w药物稀释 药物原液制备 稀释抗菌药物 菌种接种 （对数生长期，5X105 CFU/ML）结果判断方法：琼脂稀释法w培养基：M-H琼脂（苛养菌加添加剂）w含药琼脂制备w菌种接种（对数生长期 0.5麦氏单位）w结果判断方法：纸片琼脂扩散法w试验原理：试验原理：将含有抗菌药物的纸片贴于已接种w测试菌的琼脂平板上，纸片中药物吸收琼脂中w水分后向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，w在纸片周围抑菌浓度范围内，测试菌的生长被w抑制，形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。纸片琼脂扩散法w培养基：M-H琼脂w抗菌药物纸片w菌种接种w结果判断和报告方法：E试验w原理：原理：结合稀释法和扩散法原理对微生物药 物

12、敏感性试验直接定量的技术wE试条：无孔载体上固定有一系列预先制备w的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。w细菌接种和加样w结果判断和报告E EF FB BC CA AD DMIC E testE test法法MICETST药物敏感性试验结果解释w敏感：敏感：测试菌可被测定药物常规剂量给药后，在机体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。w耐药：耐药：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。w中介：中介：提示该细菌对常规用药后，体液或组织中的药物浓度的反应低于敏感株，但在一些部位（如尿液中的喹诺酮类）或使用高于正常给药量（如-内酰胺类）临床上使用有疗效。联合药物敏感试

13、验和杀菌试验w联合药物敏感试验的意义 治疗混合感染 预防和推迟抗生素耐药性的发生 可减少剂量以避免达到中毒剂量 比单一用药时效果更好联合药物敏感试验和杀菌试验w抗菌药物联合应用可出现4种结果：w无关作用w拮抗作用w累加作用w协同作用w最低杀菌浓度测定监控抗生素的治疗效果试验w血清抗菌药物浓度测定w1、微生物测定法w2、荧光偏振免疫测定w3、高压液相层析法w4、均相酶免疫测定法w血清抗菌活性测定自动化仪器检测w自动化仪器Microscan、Vitek都有测定MIC功能和检测ESBL的专用孔和专家系统。第三节细菌的耐药性和产生机制专题讲座第四节细菌的耐药性检查方法特殊耐药菌检测特殊耐药菌检测对对M

14、RSA/MRSE检测检测青霉素耐药的肺炎链球菌（青霉素耐药的肺炎链球菌（PRSP）检测）检测对万古霉素耐药的肠球菌对万古霉素耐药的肠球菌(VRE)检测检测ESBLS检测检测 Ampc检测检测一、MRSA/MRSE检测1、正确鉴定葡萄球菌2、MRSA/MRSE的鉴定 高渗培养基（24%Nacl）较低的孵育温度（3335摄氏度）时间：MRSA 24h MRSE 48h检测MRSA/MRSE的方法甲氧西林或苯唑西林筛选RSA/MRSE标准纸片扩散法微量肉汤稀释法甲氧西林或苯唑西林筛选MRSA/MRSEMH琼脂+4%Nacl+苯唑西林 6g或甲氧西林10g用0.5McFarland菌液接种35 孵育2

15、4h肉眼可见的菌落生长即为MRS标准纸片扩散法u在M.H琼脂(2%Nacl)上用0.5McFarland的 菌液划线接种。u贴上甲氧西林或苯唑西林纸片（1g），35孵育24h。u苯唑西林抑菌圈小于或等于10mm。甲氧西林抑菌圈小于或等于9 mm。微量肉汤稀释法M.H肉汤+2%Nacl+苯唑西林或甲氧西林。用0.5Mcfarland菌液接种，35孵育24hMIC：苯唑西林4g/ml 甲氧西林16g/ml 二、对青霉素耐药的肺炎链球菌二、对青霉素耐药的肺炎链球菌（PRP）的检测）的检测l筛选：苯唑西林纸片预测肺炎链球菌对青霉素的敏感性l方法:用含1g苯唑西林纸片,标准KB法作药敏试验l结果：抑菌环

16、20 mm敏感 MIC 19 mm作肉汤或琼脂稀释试验测MICl 药物的选择：青霉素、四环素、红霉素、TMP/SMZ、头孢菌素和万古霉素。肺炎链球菌对青霉素的敏感株(MIC:0.03-0.06g/ml)对氨苄西林阿莫西林阿莫西林/克拉维酸第二三代头孢菌素和泰能敏感.肺炎链球菌对青霉素的MIC值1.0g/ml的肺炎链球菌称为耐青霉素的肺炎链球菌(PRP)MIC值在0.12-1.0g/ml之间的菌株为相对耐药(低耐)菌株(PIP)MIC0.6g/ml为敏感株三、对万古霉素耐药的肠球菌三、对万古霉素耐药的肠球菌耐药性可分为低水平耐药(MIC8-32mg/L)高水平耐药(MIC64mg/L)根据肠球菌

17、对万古霉素和替考拉宁的不同耐药水平及耐药基因，VRE分为四个表型，分别是VanA VanB VanC VanDVRE:的分型及其耐药表型类型 万古霉素（g/ml）替考拉宁VanA R（64-1000）R（16-512）VanB R（4-1024）S（0.25-2）VanC I（2-32）S (0.12-2)VanD （16-64）S（2-4）VRE的检测方法：稀释法，纸片扩散法 Etest 和自动化仪器VanABC（Etest和琼脂筛选法最好，敏感率为100%）稀释法VRE筛选试验（琼脂稀释法）1、BHI琼脂+6ug/ml万古霉素2、用0.5 Mcfarland菌液接种，35 24h 3、1个

18、菌落 R 肉汤：生长 R VRE筛选阳性必须做MIC确认，并观察动力和色素，以区分获得性耐药（VanA、VanB）,及某些菌种存在的固有的中介（8-16g/ml）耐药（VanC）,两者在感染控制中意义不同。四、四、ESBLS检测检测（一）初筛试验 1.仪器 MIC2g/ml2.纸片扩散法 头孢泊肟或头孢他啶22 mm 头孢曲松25 mm 头孢噻肟或氨曲南27mm四、四、ESBLS检测检测（二）确证实验 头孢他啶（CAZ）头孢他啶+克拉维酸（CAZ/CLV）头孢噻肟（CTX）头孢噻肟+克拉维酸（CTX/CLV）差值5mm 确定为ESBLs五、五、Ampc 检测检测三维实验三维实验 制粗提酶：制粗

19、提酶：将将50ul0.550ul0.5麦氏单位待测菌液加入麦氏单位待测菌液加入12ml12ml肉汤中肉汤中 3535摇床上震摇摇床上震摇4-6h4-6h，离心，离心40004000转转/min/min 集菌集菌 -80-80反复冻溶反复冻溶5 5次，次，4 100004 10000转转/min/min 离心收集上清液离心收集上清液-20-20保存。保存。2.2.检测检测AMP CAMP C酶酶 在在MHMH平板上均匀涂抹平板上均匀涂抹0.50.5麦氏单麦氏单 位位ATCC25922ATCC25922 中心贴头孢西叮纸片中心贴头孢西叮纸片 在距纸片在距纸片5mm5mm处切槽处切槽 将粗提酶液加入

20、槽内将粗提酶液加入槽内 3535孵育孵育24h 24h 如果在抑菌圈内有细菌生长，则如果在抑菌圈内有细菌生长，则AMP AMP C C 阳性。阳性。第五节 抗分枝杆菌药物敏感性试验w抗分枝杆菌药物w一线药：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素w二线药：氨基水杨酸、乙硫异烟胺、环丝氨酸、卷曲霉素、卡那霉素、利福喷丁结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌结核分枝杆菌和缓慢生长分枝杆菌体外抑菌试验体外抑菌试验w结核分枝杆菌体外药敏试验指针w结核分枝杆菌体外药敏试验方法 培养基 Middlebrook7H10琼脂+油酸、白蛋白、葡聚糖等 药敏试验药物 细菌接种快速生长分枝杆菌体外药敏试验1、稀释法：操作方法基本同需氧和兼性厌氧法MH肉汤或CAMHB加入0.02Tween 80和玻珠，接种菌液，30孵育3-5天。快速生长分枝杆菌体外药敏试验2、琼脂纸片洗脱法 先将含药纸片放入6孔组织培养板中，以洗脱液洗脱，再加入溶化冷却的HA4.5ML，使之凝固成含药平板。0.5麦氏单位菌液-1：100稀释 每孔10微升 30孵育3-5天，判读结果：抑制细菌生长的药物浓度为MIC，磺胺药以抑制80细菌生长为终点。第六节厌氧菌体外抑菌试验第七节抗真菌药物敏感试验 自学 致致 谢！谢！