动物细胞培养和核移植技术新医学课件.ppt

1、动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术动物细胞核移植动物细胞核移植动物细胞培养动物细胞培养动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术（基础）（基础）在治疗烧伤病人时，通常采用的方法是取烧伤在治疗烧伤病人时，通常采用的方法是取烧伤病人健康皮肤进行病人健康皮肤进行自体移植自体移植。但对于一个大面积。但对于一个大面积烧伤的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用烧伤的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源不足，而且会产生他人皮肤来源不足，而且会产生免疫排斥反应免疫排斥反应。动物细胞培养技术动物细胞培养技术那么，怎么才能获得大量的自体健康皮肤呢？那么，怎么才能获得大量的自体健康皮肤呢

2、？1、概念：、概念：就是从动物机体中取出相关的组就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成织，将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在，然后放在适宜的适宜的培养基培养基中，让这些细胞中，让这些细胞生长和生长和增殖增殖。2 2、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖（有丝分裂）（有丝分裂）CO2增殖能力强，分裂旺盛，分化增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养程度低，容易培养3.3.过程过程贴壁过程贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：内表面光滑、无毒、无菌、易于贴附内表面光滑、无毒、无菌、易于贴附在培养瓶悬液中分散培养的细胞很在培养瓶悬液中分散培养的细胞很快就贴附在瓶壁

3、上，称为细胞贴壁。快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。当贴壁细胞分裂生长到表面当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触相互接触时时,细胞细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接接触抑制。触抑制。细胞的接触抑制细胞的接触抑制接触抑制：接触抑制：CO2 当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触接触抑制后抑制后,用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理,使使细胞从瓶壁上细胞从瓶壁上脱离脱离下来下来,然后然后加入新的培养液加入新的培养液,将细胞分离将细胞分离稀释稀释,并并从原培养瓶内转接到从原培养瓶内转接到新的培养瓶内新的培养瓶内,这个过程称这个过程称传传代培养代培养.（分瓶培养的过

4、程分瓶培养的过程）分瓶扩大培养：分瓶扩大培养：以以1:2或或l:3以上的以上的比率比率进行分装进行分装1050代细胞代细胞无限传代无限传代分瓶分瓶胰蛋白酶胰蛋白酶原代培养接触抑制原代培养接触抑制110代细胞代细胞传代培养传代培养单层细胞单层细胞细胞核型细胞核型保持正常保持正常多层细胞多层细胞细胞突变细胞突变核型改变核型改变第第 一次危机一次危机第第 二次危机二次危机部分细胞核型部分细胞核型可能可能改变改变癌细胞（癌细胞（不死性不死性，无限增殖无限增殖，失去失去接触抑制接触抑制，易转，易转移）移）单层细胞单层细胞每分瓶扩大培养一次每分瓶扩大培养一次为一次传代；传代代为一次传代；传代代数就是分瓶次

5、数；数就是分瓶次数；每一代的细胞培养，每一代的细胞培养，从细胞贴壁到贴满瓶从细胞贴壁到贴满瓶壁过程中，细胞分裂壁过程中，细胞分裂了很多次；了很多次；思考题思考题传代培养中传代培养中,传代代传代代/次数次数与与细胞增殖细胞增殖/分裂次数分裂次数是否相同？是否相同？1.为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？的呢？成块的组织细胞靠在一起成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖，彼此限制了细胞的生长和增殖，也不利于细胞营养物质的吸收和代谢废物的排出。也不利于细胞营养物质的吸收和代谢废物的排出。思考题思考题2.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细

6、胞间的物质胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？是什么成份？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？胰蛋白酶水解蛋白质胰蛋白酶水解蛋白质细胞间的成分是蛋白质细胞间的成分是蛋白质不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适pH不同不同胰蛋白酶长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，因此胰蛋白酶长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，因此必须控制好胰蛋白酶的处理时间。必须控制好胰蛋白酶的处理时间。4.传代培养的细胞能一直传代下去吗？传代培养的细胞能一直传代下去吗？5.有些为何能一直传下去？有些为何能

7、一直传下去？不都能。传代培养到不都能。传代培养到50代左右的时候，大部分代左右的时候，大部分的细胞都停止分裂，最终衰老死亡；但有少数的细胞都停止分裂，最终衰老死亡；但有少数细胞能够继续传代。细胞能够继续传代。这些发生突变，获得不死性，朝着癌细胞方向这些发生突变，获得不死性，朝着癌细胞方向发展（成为了癌变细胞）发展（成为了癌变细胞）3.如果培养的细胞数量并未达到人们的需求，应如果培养的细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？该怎样办？用胰蛋白酶处理用胰蛋白酶处理将贴满瓶壁的细胞分离下来，将贴满瓶壁的细胞分离下来，然后分瓶后继续培养（传代培养）然后分瓶后继续培养（传代培养）8.动物细胞培养能否像植

8、物组织培养那样最动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养出新个体？终培养出新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能形成新的动物个体不能形成新的动物个体7.动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？可以得到细胞，也可以得到细胞产物可以得到细胞，也可以得到细胞产物6.人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？保存保存10代以内的细胞，可以保持细胞正常的代以内的细胞，可以保持细胞正常的二倍体核型；而二倍体核型；而10代以后的细胞核型可能发代以后的细胞核型可能发生变化，有少部分还发生突变向癌细

9、胞方向生变化，有少部分还发生突变向癌细胞方向发展发展4.4.动物细胞培养条件动物细胞培养条件1.无菌、无毒的环境对培养液和培养用具进行无菌处理；在培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液；2.营养葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等+动物血清或血浆3.温度和pH温度36.50.5度，pH7.27.44.气体环境95%空气和5%CO2（CO2CO2培养箱提供培养箱提供）合成培养基合成培养基不能用胃蛋白酶代替胰蛋白酶O2是细胞代谢所必需的；COCO2 2维持培养液的维持培养液的pHpH获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞或细胞产品细

10、胞或细胞产品 新的个体或细胞产品新的个体或细胞产品培养结果培养结果或细胞产物或细胞产物快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原原 理理动物动物细胞细胞培培养养植物植物组织组织培养培养比较项目比较项目植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较葡萄糖等、葡萄糖等、动物血清动物血清5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用:1.1.生产生物制品生产生物制品 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单

11、克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 1.1.用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（组织细胞（）A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B.B.具有更强的全能性具有更强的全能性C.C.取材十分方便取材十分方便 D.D.分

12、裂增殖的能力强分裂增殖的能力强【随堂练习【随堂练习】D2.2.动物细胞培养的特点（动物细胞培养的特点（）细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 细胞分化细胞分化 接触抑制接触抑制 减数分裂减数分裂 原代培养一般传代原代培养一般传代1 11010代代 A A、B B、C C、D D、A A3.下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是（）A.培养基成分不同 B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行 C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能 D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株AC项：愈伤组织条件适宜可以传代培养不分化（扩大培养）D项：正因为C项，因此植物细胞也可以培养成大量细胞4.回

13、答下列有关动物细胞培养的问题：回答下列有关动物细胞培养的问题：（1）在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分）在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面裂生长到细胞表面 时，细胞会停止分裂时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的增殖，这种现象称为细胞的 。此时，瓶。此时，瓶壁上形成的细胞层数是壁上形成的细胞层数是 。要使贴壁的细胞。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的是是 。（2）随着细胞传代次数的增多，绝大部分）随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现细胞分裂停止，进而出现 的现象；但的现象；但极少数细胞可以连续增殖，这

14、些细胞因遗传物质极少数细胞可以连续增殖，这些细胞因遗传物质发生改变而变成发生改变而变成 细胞，该种细胞的黏着细胞，该种细胞的黏着性性 ，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量量 。相互接触相互接触 接触抑制接触抑制单层单层胰蛋白酶胰蛋白酶衰老或死亡衰老或死亡不死性不死性/癌癌降低降低减少减少（3）检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，）检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到最好选用细胞分裂到 期的细胞用显微镜进期的细胞用显微镜进行观察。行观察。（4）给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，）给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为

15、机体把移植的皮肤组发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作织当作 进行攻击。进行攻击。中中抗原抗原植物组织培养中，植物组织培养中，外植体外植体在适当的培养在适当的培养条件诱导下，可形成条件诱导下，可形成完整的植株完整的植株。那么，离体的动物组织细胞也能够通过那么，离体的动物组织细胞也能够通过一定的诱导，发育成一个完整的动物体一定的诱导，发育成一个完整的动物体吗？吗？分化潜能变弱分化潜能变弱：其全能性随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制限制，分化潜能变弱。（这是对整体细胞而言）细胞核仍具有全能性细胞核仍具有全能性：细胞核，细胞核，含有保持物种遗传性所需的含有保持物种遗传性所需的全套基因全

16、套基因，而且并没有因细胞分化而丢，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的失基因，因此高度分化细胞的细胞核细胞核仍仍具有全能性。具有全能性。对于动物细胞来说：对于动物细胞来说：根据动物细胞核仍具有全能性的特根据动物细胞核仍具有全能性的特点，怎样将动物细胞的全能性表现点，怎样将动物细胞的全能性表现出来出来?克隆动物克隆动物的获得，实际上利用的获得，实际上利用核移植技术核移植技术来实现的来实现的采集卵母细胞供体奶牛供体细胞供体细胞培养M期卵母细胞无核卵母细胞去除卵母细胞核将供体细胞注入去核卵母细胞将胚胎移入代孕母牛（受体）体内生出与供体奶牛遗传物质基本相同的牛犊细胞融合构建重组胚胎供体细

17、胞供体细胞（供核）（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞卵巢卵母细胞卵巢卵母细胞（M中期：供质）中期：供质）去核去核无核卵无核卵母细胞母细胞注入注入细胞细胞融合融合重重组组细细胞胞构建重构建重组胚胎组胚胎胚胎胚胎移植移植代孕代孕母体母体生出与供体奶牛遗传生出与供体奶牛遗传物质物质基本相同基本相同的犊牛的犊牛2.共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植和核移植和动物细胞培养、核移植、胚胎移植1.整个过程用了哪些技术？1.原理？动物细胞核的全能性2.繁殖方式？无性繁殖（克隆）3.3.有人说它上述的克隆牛有三个母亲，对吗？有人说它上述的克隆牛有三个母亲，对吗？4.新生牛的性别、基因？性别与供体相同、基因

18、与供体的基本相同5.5.体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了胞供体动物进行了100%100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是。克隆动物的性状与核供体生物的性状基本相同，而不是完全形同。因为克隆动物的细胞质遗传物质来自于受体卵母细胞。此外，生物的性状还受环境的影响。7.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的为使核移植动物的核遗传物质核遗传物质全部来自有利全部来自有利用价值的动物提供的细胞。用价值的动物提供的细胞。6.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代

19、以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变。8.为什么受体细胞选取减数第二次分裂中期（M期）的卵母细胞？它是最大的细胞，细胞核的位置靠近第一极体，用微吸管可以将其细胞核和第一极体吸去，易操作。它发育可直接表达性状）。物理方法：电脉冲等化学方法：钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等电刺激11.激活重组细胞的方法：9.9.促进供体细胞和受体细胞细胞融合的方法：促进供体细胞和受体细胞细胞融合的方法：10.10.对重组细胞进行激活的目的：对重组细胞进行激活的目的：激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程（三）体细胞核移植技术的应用前景1、畜牧业方面：2、医药卫生方面：可以加速家畜遗传改良的进程，促

20、进优良畜群繁育保护濒危物种，增加其存活数量转基因的克隆动物：生产医用蛋白质；用作器官移植的供体；3、其他领域了解胚胎发育及衰老过程用克隆动物作为疾病模型，更好追踪研究疾病的发展过程、治疗疾病1.下列关于体细胞克隆的叙述，错误下列关于体细胞克隆的叙述，错误的是（的是（）A 供体为体细胞的细胞核供体为体细胞的细胞核B 受体为去核卵母细胞的细胞质受体为去核卵母细胞的细胞质C 细胞核移植是体细胞克隆的关键细胞核移植是体细胞克隆的关键步骤步骤D 克隆出的后代与供体的遗传物质克隆出的后代与供体的遗传物质和表现型完全一致和表现型完全一致D随堂练习2.动物细胞体外培养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质

21、。下图是血清对正常细胞和癌细胞培养影响的实验结果。从该图提供的信息可以获得的结论，错误是（）A正常细胞与癌细胞的增殖速率相同 B有无血清对正常细胞培养的影响不同C培养基中补充血清有助于正常细胞的培养D培养基中是否补充血清对癌细胞的培养影响不大A3.下列有关体细胞核移植技术的说法下列有关体细胞核移植技术的说法不正确的是不正确的是()A.体细胞核移植技术在多种动物中体细胞核移植技术在多种动物中获得了成功，成功率非常高获得了成功，成功率非常高B.克隆技术的各个环节有待于进一步克隆技术的各个环节有待于进一步改进改进C.大多数克隆动物还存在一些遗传大多数克隆动物还存在一些遗传和生理缺陷类的健康问题和生理缺陷类的健康问题D.克隆动物食品的安全性问题仍然克隆动物食品的安全性问题仍然存有争议存有争议A4.下列哪项不属于体细胞核移植技下列哪项不属于体细胞核移植技术的应用（术的应用（）A.加速家畜遗传改良进程，促进优加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育良畜群繁育 B.保护濒危物种保护濒危物种C.获得组织器官异体移植的供体获得组织器官异体移植的供体 D.大量产生紫杉醇大量产生紫杉醇D