实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门课件.pptx

1、 汇报人：朱林林 2011/03/25实时荧光定量PCR技术目录目录实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR基本原理基本原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的实验设计的实验设计实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR两种相对定量方法比较两种相对定量方法比较实时实时荧光定量荧光定量PCRPCR误差分析误差分析及操作规范及操作规范实验中污染的防实验中污染的防控控荧光定量荧光定量PCRPCR报告模板报告模板实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR基本原理基本原理常规常规PCR：借助电泳对扩增反应的：借助电泳对扩增反应的终产物终产物进行半进行半定量定量及及定性定性分析。分析。定量定量PCR技术：利用技术：利用

2、荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增扩增反应中反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对，最终精确的对起始起始模板进行模板进行定量分析。定量分析。常规常规vs vs实时实时优缺点优缺点比较比较定量定量PCRPCR三个基本概念三个基本概念(1)扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。定量定量PCRPCR三个基本概念三个基本概念(2)阈值的概念在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。定量定量PCRPCR三个基本概念三个基本概念(3)CT值PCR

3、过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。C(t)C(t)与初始模板含量与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210荧光定量荧光定量PCRPCR的定量的定量原理原理浓度的对数值浓度的对数值与与循环数循环数呈线性关系，根据样品呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品值）就可分析样品中起始模板中起始模板量。量。荧光定量荧光定量PCRPCR的化学原理的化学

4、原理 化学化学方法分类方法分类非特异性非特异性SYBR Green I法法特异性特异性TaqMan探针法探针法SYBR Green ISYBR Green I法法原理：原理：结合结合双链双链DNADNA分子小沟分子小沟延伸结束，形成双链延伸结束，形成双链DNADNA，SYBR SYBR GreenGreen结合到双螺旋小沟中，当受结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度反映产物浓度优点优点使用方便，无需复杂的设计使用方便，无需复杂的设计成本较低成本较低缺点缺点与非特异性产物结合，无模板特与非特异性产物结合，无模板特异性异性试验方法较难优化试验

5、方法较难优化灵敏度低灵敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBR Green ISYBR Green I法法溶解曲线分析荧光染料的特点及应用(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；(2)、可做双链核酸的熔解曲线分析；(3)、SYBR Green染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStar Taq酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；(4)、适合于基因含

6、量及基因表达变化的粗略分析或初筛；(5)、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。(6)、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。TaqMan探针法水解型水解型报告基团，淬灭基团报告基团，淬灭基团FRETFRET（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）识别特异性产物识别特异性产物优点优点特异性高，可准确定量特异性高，可准确定量灵敏度高灵敏度高设计不同标记的探针，可进设计不同标记的探针，可进行多重检测行多重检测缺点缺点一个探针只适用于一个目标一个探针只适用于一个目标价格较高价格较高探针设计较繁琐探针设计较繁琐TaqManTaqMan作用机理两种化学的比较实时荧光定量

7、实时荧光定量PCRPCR的实验设计的实验设计绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNADNA，RNARNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量相对定量：计算初始反应模板的相对含量定量PCR-绝对定量标准品，标准曲线标准品，标准曲线已知浓度的相应已知浓度的相应DNADNA模板，按不同浓度稀释模板，按不同浓度稀释根据实时根据实时PCRPCR反应得到相应的反应得到相应的C(t)C(t)，构建标准曲线，构建标准曲线样品样品与标准品同时进行与标准品同时进行PCRPCR反应得到未知浓度样品的反应得到未知浓度样品的C(t)C(t)值值定量PCR

8、-相对定量相对定量的目的相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题相对定量的问题样品材料不均一造成的差别样品材料不均一造成的差别内标基因内标基因内标通常是内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差误差实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR两种相对两种相对定定量量方法比较方法比较相对标准曲线相对标准曲线

9、法和法和2-c(t)法法相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准标准曲线曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得因，获得C(t)C(t)值值用内标基因对目标基因用内标基因对目标基因均一化均一化处理样本与未处理样本目标基因处理样本与未处理样本目标基因C(t)C(t)值经内参值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异理样本的表达差异适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低扩增效率较低2-c

10、(t)法前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：CT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)CT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值：CT=CT（test)-CT（calibrator)3、计算表达水平比率：2 CT=表达量的比值当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比一般步骤选定目标基因和内标基因选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法设计一步法或两步法RT-PCRR

11、T-PCR反应反应数据获得及处理数据获得及处理目标基因目标基因C(t)值值内标基因内标基因C(t)值值计算计算2-c(t)作图作图适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较较一致一致不做标准曲线，高通量检测不做标准曲线，高通量检测实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR误差分析误差分析及及操作规范操作规范1、误差分析（1）、实验方案本身的误差 荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；2-CT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起误差；Taqman探针法误差相对较小；双标准曲线法误差相对较小。（2）、仪器设备引起的误差

12、 测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再到摩尔量，误差本身就很大；定量PCR仪的误差，耗材引起的误差，96空板封口膜透光性的差异等（3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差（4）、操作引起的误差 样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误差。2、操作规范 荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。（1）、样品的处理及选取 处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种药物到小白鼠免疫系统的影响，必须做到每

13、次饲喂时此药品完全被小白鼠摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有结缔组织等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。（2）、核酸提取 加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNA OD260/2802.0左右，DNA OD260/2801.8左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。（3）、得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放，反转录所得cDNA要用看家基因检测。（4）、对于精度要求较高的

14、定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。（5）、做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。（6）、体系中最好掺入ROX参比荧光，消除光程差和加样的偏差。（7）、重复操作 让重复操作最大的修正偏差。最有意义的重复是在提取样品RNA时就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们是把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的

15、多。同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。同一cDNA样品的三个重复模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。实验中污染的防控1、荧光定量PCR实验中污染源的分析（1）、PCR产物引起的污染 在检测过程中，荧光定量PCR产物都是封闭在PCR管中的，不存在开管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量PCR产物时引起的污染，只要将电

16、泳室与PCR加样室隔离开，就能有效的避免PCR产物的污染。（2）、标准品引起的污染 常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的PCR产物等，由于标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，有可能引起污染。（3）、高浓度的样品引起的污染 高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。2、荧光定量PCR实验中污染的防控（1）、对于PCR产物引起的污染 最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用dU代替dT配合UNG酶，是解决PCR产物污染的有效办法，但是成本较高。（2）、对于标准品引起的污染 目前只能是以预防，加标

17、准品时最好采用专用移液器，不要和加样的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操作台隔离开。（3）、对于样品间的检查污染 样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶胶，因为样品的cDNA链较长，经常开紫外灯，把长链cDNA打断，能有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止此类污染。（4）、对于未知污染源的顽固的污染的防控 这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量减去污染的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号电泳结果显示，该阴性对照确实有PCR产物出现通过定量PCR检测，测得该阴性样品中含有227个初始模板。假如这个污染属于是顽固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去227，来避免污染引起的误差荧光定量荧光定量PCRPCR报告模板报告模板