大肠杆菌表达系统使用指导课件.pptx

1、（二）融合蛋白技术的内容（二）融合蛋白技术的内容构建融合蛋白的基本原则是，构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的将第一个蛋白的终止密码子删除终止密码子删除，再接上再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的，以实现两个基因的共同共同表达表达。具体步骤有：。具体步骤有：1.进行目的基因的克隆：进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则根据基因序列互补原则，设计合适的引物序，设计合适的引物序列，以列，以cDNA为模板，利用为模板，利用PCR技术扩增不同的目的技术扩增不同的目的DNA片段片段。2.在载体中进行重组：在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个通过限制

2、内切酶将两个DNA片段进行酶切并回片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。测序。4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。（三）融合蛋白技术的关键（三）融合蛋白技术的关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序

3、接头序列列(Linker)，即连接肽，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。一般来说，一般来说，3-5 3-5 个氨基酸的个氨基酸的Linker Linker 可满足大部分融可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入有人尝试在融合蛋白间加入

4、一段有一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链疏水性和一定伸展性的较长肽链，如，如(Gly4Ser1)(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满并获得了满意的结果。意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式，合蛋白时，应多选择几种融合方式，从中优化出理想的从中优化出理想的连接方式。连接方式。另外，大量研究表明另外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。白质的功能结构域是十分重要的

5、。常用的融合蛋白的载体有常用的融合蛋白的载体有人血清白蛋白人血清白蛋白(Huma serum albumin，HSA)融合蛋白融合蛋白、-半乳糖苷酶融合蛋白、半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱谷胱甘肽甘肽 S-转移酶转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋白融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx)融合蛋融合蛋白等。白等。而人血清白蛋白而人血清白蛋白(HSA)则由于本身特殊的优点，则由于本身特殊的优点，更适合于充当长效融合蛋白类更适合于充当长效融合蛋白类 药物的融合载体。药物的融合载体。HSA是包含是包含585个氨基酸残基的个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白单链无糖基化的球形蛋白质质，分子量分子量65kD。它是。它

6、是人血浆中含量最高的单一蛋白质人血浆中含量最高的单一蛋白质(达达40g/L)，在体内有维持血液渗透压，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它运输营养和其它重要生物物质的作用。重要生物物质的作用。HSA本身是许多本身是许多内源因子和外源药内源因子和外源药物物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度，用度，增加在体内的半衰期至增加在体内的半衰期至19d之久。之久。人血清白蛋白融合技术具有明显人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：的优点，包括：HSA与目与目标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接

7、，不需额外的体不需额外的体外处理外处理；HSA表达水平较高，表达水平较高，融合后可以提高融合后可以提高目的蛋白的表目的蛋白的表达水平达水平；HSA是一个稳定的是一个稳定的“惰性惰性”蛋白，蛋白，融合后可以提融合后可以提高高目的蛋白的稳定性目的蛋白的稳定性；HAS融合蛋白具有比融合蛋白具有比PEG修饰的蛋白药修饰的蛋白药物更长的半衰期物更长的半衰期。（三）细胞因子重组融合蛋白（三）细胞因子重组融合蛋白细胞因子重组融合蛋白是细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物其他有特定功能的蛋

8、白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、细胞因子细胞因子与毒素的融合蛋白与毒素的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋白、细胞因子与细胞因细胞因子与细胞因子受体的融合蛋白子受体的融合蛋白以及以及细胞因子与其他分子的融合蛋白细胞因子与其他分子的

9、融合蛋白。这些兼具特。这些兼具特异异 性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床，性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床，在抗肿瘤、在抗肿瘤、抗抗风湿病、抗风湿病、抗 HIV感染等领域发挥作用，感染等领域发挥作用，为人类疾病的治疗提供新的手为人类疾病的治疗提供新的手段。段。1、细胞因子与毒素的融合蛋白、细胞因子与毒素的融合蛋白 在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体，在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体，可利用细可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞。白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白白喉毒素与细胞因子

10、的重组融合蛋白便是这样便是这样一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。2、细胞因子与细胞、细胞因子与细胞因因 子子受体的融合蛋白受体的融合蛋白 通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细胞因子与细胞因子受体基因重组，胞因子与细胞因子受体基因重组，可大大促进其生物学活可大大促进其生物学活性的发挥。性的发挥。IL-6在肝细胞的增殖中起着增强作用。在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL-6和和IL-6R(gp80(gp80)的结合使其易于和另一个受体的结合使其易于和另一个受体IL-6R(gpl30)结合。结合。帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化纯化方便:先用 溶液处理,然后 洗出 样品没有很好细心去除不溶性物质 重复使用前树脂没有洗干净 蛋白质之间存在相互作用 可以提高盐浓度,改变pH,添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质 是不是在进行复性时用了Redox buffer 尝试用 Urea gradient /Gel filtration来解决