补体参与的反应.ppt

1、Part 补体参与的反应补体参与的反应Part T细胞数量及其功能检测细胞数量及其功能检测免疫学教研室免疫学教研室王丽娜王丽娜Email： 补体参与的反应补体参与的反应 补体的溶血反应补体的溶血反应-免疫血清的制备与应用免疫血清的制备与应用 补体结合试验补体结合试验 T细胞及其功能检测细胞及其功能检测 E花环形成试验花环形成试验 淋巴细胞转化试验：淋巴细胞转化试验：形态学方法形态学方法 3HTDR掺入法掺入法 MTT比色法比色法 T细胞亚群检测：间接免疫荧光法细胞亚群检测：间接免疫荧光法 免疫组化法免疫组化法-SABCAP法法 补体激活的三条途径补体激活的三条途径经典途径经典途径MBL途径途径

2、旁路途径旁路途径IC+C1qMBL+病原体配基病原体配基细菌细菌+C3膜攻击复合物膜攻击复合物细胞溶解细胞溶解Part 补体参与的反应补体参与的反应思考题l材料：绵羊红细胞、补体、免疫血清（自制）l问题：请设计实验检验你所制备的免疫血清的特异性？1、补体的溶血反应、补体的溶血反应 -补体参与的反应补体参与的反应l原理原理 绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBC）作为抗原与其相应抗体）作为抗原与其相应抗体（溶血素）（溶血素）结合后，通过结合后，通过经典途径经典途径激活补体，激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。溶血反应。孔号孔号 SRBC溶

3、血素溶血素补体补体NS13滴滴3滴滴3滴滴3滴滴23滴滴3滴滴6滴滴33滴滴3滴滴6滴滴43滴滴9滴滴结果结果l 实验步骤及结果判断实验步骤及结果判断阴性阴性阴性阴性阳性阳性溶血溶血溶血溶血不溶血不溶血反应系统反应系统指示系统指示系统溶血反应溶血反应补体结合试验补体结合试验补体补体2、补体结合试验、补体结合试验 -补体参与的反应补体参与的反应原理原理12345反应系统反应系统AbAg补体补体CNS 摇匀，摇匀，37C水浴，水浴，30mins指示系统指示系统溶血素溶血素SRBC 摇匀，摇匀，37C水浴，水浴，30minsl 反应体系与结果判断反应体系与结果判断结果结果溶血溶血结果结果否否是是是是

4、是是否否羊红细羊红细胞对照胞对照Part T细胞数量及其功能检测细胞数量及其功能检测1.E花环形成试验花环形成试验l 原理原理 人外周血人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体（表面糖肽相结合的受体（E受体）受体），可结合可结合SRBC形成花环样细胞团。形成花环样细胞团。因为因为T细胞的异质性，它们对绵羊红细胞的亲细胞的异质性，它们对绵羊红细胞的亲和力不同，所以和力不同，所以T细胞可以形成不同类型的细胞可以形成不同类型的E花环，花环，如如EtRFC（总花环）（总花环）、EaRFC（活性花环）、（活性花环）、EsRFC（稳定性花环

5、）等。（稳定性花环）等。检测检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况。CD2l实验器材实验器材1.肝素抗凝血、绵羊红细胞（肝素抗凝血、绵羊红细胞（SRBC）2.淋巴细胞分层液、淋巴细胞分层液、Hanks液、液、1640培养液、培养液、0.5戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液3.试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等显微镜等l 实验步骤实验步骤密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：密度梯度离心法分离外周血单个核细胞：取稀释取稀释好的人外周血，用滴管贴管壁（倾斜好的人外周血，用滴管贴管壁（倾斜3

6、0）轻轻）轻轻叠加于叠加于2ml分离液上（界面要清晰）分离液上（界面要清晰）配平后配平后2000rpm离心离心 10mins。l离心后分为离心后分为5层，由上层，由上8而下分别为：稀释的血浆、单而下分别为：稀释的血浆、单个核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。个核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。1.淋巴细胞悬液的制备：淋巴细胞悬液的制备：动作轻柔；分清滴管及枪头！动作轻柔；分清滴管及枪头！稀释的血液稀释的血液 分层液分层液离心前离心前稀释的血浆稀释的血浆 单个核细胞单个核细胞分层液分层液粒细胞粒细胞红细胞红细胞离心后离心后 洗涤细胞：洗涤细胞：另取一支滴管，另取一支滴管，仔细仔细吸出位于血浆吸出位于血

7、浆和分离液之间的和分离液之间的乳白色的单个核细胞乳白色的单个核细胞，放入盛有，放入盛有5mlHanks液的试管液的试管2000rpm离心离心5mins。弃上清（弃上清（倾倒时液体不要回流倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入细胞轻弹混匀后加入Hanks液液5ml，重复离心一，重复离心一次。次。2.弃去上清，留经过洗涤的弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液淋巴细胞悬液0.1ml与与绵绵羊红细胞羊红细胞0.1ml、1640营养液营养液0.1ml混合混合轻轻弹混匀后放于弹混匀后放于37温箱温箱15mins。3.取出试管，取出试管，500rpm离心离心5mins。（注意此步

8、非。（注意此步非常关键，常关键，转速一定要慢转速一定要慢）室温静置）室温静置3-5分钟。分钟。4.取出试管，吸去半量上清液，轻轻取出试管，吸去半量上清液，轻轻旋转混匀旋转混匀，沿管壁沿管壁滴加滴加1滴戊二醛，轻轻混匀静置滴戊二醛，轻轻混匀静置5mins。5.取取25ul液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。盖玻片。6.显微镜下观察。显微镜下观察。E花环形成实验（灿烂甲酚兰染色，花环形成实验（灿烂甲酚兰染色，400）实验结果实验结果 高倍镜下观察，计数高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合率。淋巴细胞上结合

9、3个个SRBC者为者为E花环阳性。花环阳性。100%未形成花环细胞数形成花环细胞数形成花环细胞数E花环形成率(%)正常参考值：正常参考值：EtRFC：64.46.7；EaRFC：23.63.5；EsRFC：3.32.6l 实验结果实验结果2.淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 原理原理lT细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化

10、现淋巴细胞转化现象象。l淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。l常用方法常用方法形态学方法形态学方法3H-TDR掺入法掺入法MTT比色法比色法 胞核的大小、与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核胞核的大小、与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无仁的有无 成熟小淋巴细胞：成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；染色为轻度嗜碱性；淋巴母细胞：淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、体积增大，形态不规则，核变大、核质染色

11、疏松，有核仁核质染色疏松，有核仁1-2个，胞浆丰富，常出现个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；胞浆空泡；其他细胞：其他细胞：中性粒细胞在培养中性粒细胞在培养72小时后，绝大部小时后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。分衰变或死亡呈碎片。(1)形态学方法形态学方法 -淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 镜下结果镜下结果红细胞红细胞未转化淋巴细胞未转化淋巴细胞转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验 瑞氏染色瑞氏染色 10100 实验结果实验结果l淋巴细胞转化率淋巴细胞转化率转换的淋巴细胞转换的淋巴细胞转换的淋巴细胞未转化的淋巴细胞转换的淋巴细胞未转化的淋巴细胞100正常参考值：正常参考值：8

12、03H-TDR掺入法掺入法 -淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 T细胞受到细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TDR），可以被细），可以被细胞摄入而掺入胞摄入而掺入DNA中，通过中，通过-液体闪烁计数器测液体闪烁计数器测定定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。的掺入量，判断细胞的增殖程度。MTT比色法比色法 -淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验 MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过线粒为一种黄色可溶性物质，细

13、胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，将体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。MTT Formazan Insoluble 细胞上的细胞上的CD分子相应鼠抗人单克隆抗体分子相应鼠抗人单克隆抗体兔抗鼠兔抗鼠IgG荧光抗体荧光抗体反复洗涤，荧光显微镜下观察，计数阳反复洗涤，荧光显

14、微镜下观察，计数阳性细胞。性细胞。间接免疫荧光法间接免疫荧光法洗洗涤涤抗体抗体荧光标记荧光标记抗抗Ig抗体抗体间间接接法法3.T细胞亚群检测细胞亚群检测 间接间接SABC-AP法法 SABC：链霉亲合素：链霉亲合素生物素复合物生物素复合物 AP：碱性磷酸酶：碱性磷酸酶 生物素活化后可以标记抗体和酶，且不影响它们生物素活化后可以标记抗体和酶，且不影响它们的活性；链霉亲合素同一定浓度的生物素、酶混的活性；链霉亲合素同一定浓度的生物素、酶混合后，就能形成链霉亲合素合后，就能形成链霉亲合素(SA)-生物素生物素(B)-酶酶(E)复合物复合物(SAB-EC)。这种复合物中至少存在一个尚。这种复合物中至少

15、存在一个尚未被生物素占据的亲合素结合位点，可与生物素未被生物素占据的亲合素结合位点，可与生物素标记抗体结合。标记抗体结合。3.T细胞亚群检测细胞亚群检测 基本过程基本过程间接间接SABC-AP法法 -T细胞亚群检测细胞亚群检测 CD分子分子T细胞细胞一抗一抗（小鼠抗人（小鼠抗人CD3/CD4/CD8分子分子mAb）二抗二抗（生物素化）（生物素化）SABC（标有（标有AP）底物底物-AP-APAP-T细胞亚群检测（免疫组化，细胞亚群检测（免疫组化，400）补体参与的反应补体参与的反应 补体的溶血反应补体的溶血反应 补体结合试验补体结合试验 T细胞数量及其功能检测细胞数量及其功能检测 数量检测数量

16、检测 E花环形成试验花环形成试验 T细胞亚群检测：间接免疫荧光法细胞亚群检测：间接免疫荧光法 免疫组化法免疫组化法-SABCAP法法 功能检测功能检测 淋巴细胞转化试验：淋巴细胞转化试验：形态学方法形态学方法 3HTDR掺入法掺入法 MTT比色法比色法 小结综合性实验免疫血清制备及应用综合性实验免疫血清制备及应用不但要注意实验怎么做，还要知道该试验的用途。不但要注意实验怎么做，还要知道该试验的用途。1.溶血反应的原理、步骤、结果及分析。溶血反应的原理、步骤、结果及分析。2.E花环形成试验的原理、步骤（简单描述）、花环形成试验的原理、步骤（简单描述）、绘制镜下观察结果并进行简单分析。绘制镜下观察结果并进行简单分析。3.绘制淋巴细胞转化试验（形态学方法）、绘制淋巴细胞转化试验（形态学方法）、T亚亚群检测的镜下观察结果。群检测的镜下观察结果。实实 验验 报报 告告通通 知知下次实验课随堂考核下次实验课随堂考核l方式：笔试（闭卷）和操作方式：笔试（闭卷）和操作l范围：与所学（操作、示教）实验有关的原理、范围：与所学（操作、示教）实验有关的原理、结果及分析。结果及分析。