λ噬菌体载体的类型课件.ppt

1、载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体（vector）。（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；（4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。1.克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；2.表达载体（expression

2、vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；3.穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解半乳糖半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系统系统a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解半乳糖分解半乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-

3、肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M15pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；(2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；(3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特

4、称为lacZ1基因；(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452

5、EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIlacZlacZN端端 C端端缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌完整的完整的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONNpGEM系列 总长度为2743bp 含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ编码基因 一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。pGEMpGEM系列与系列与pU

6、CpUC系列之间的主要差别系列之间的主要差别 pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于Lac z基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。pGEM-3ZpGEM-3Z：多拷贝多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCSMCS）

7、正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注意：注意：T7T7和和SP6SP6启动子特异性地由噬菌体启动子特异性地由噬菌体DNADNA编码的编码的RNARNA聚合聚合2743 2743 bpbpMCSMCSlacZlacZP PT7orioriApAprpGEM-3ZpGEM-3ZP PSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNARNA聚合酶，如：聚合酶，如：E.coliE.coli BL21 BL21（DE3DE3）等等该载体具有以下优点：该载体具有以下优点：可诱导，能高效表达所需基因或基因片段

8、。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。融合蛋白极易纯化。GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。该载体具有以下优点：该载体具有以下优点：可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶(如凝血酶、prescission protease，Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地

9、应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作用的研究等。QIAexpress 6His表达系统 该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统，优点：6His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6His切除。生理pH条件下6His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。因5His免疫原性差，所以无需去除6His,重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用环化作用图图3-1 噬菌体基因组结构噬菌体基因组结构（可转化为

10、黑白图）（可转化为黑白图）基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：调节元件或调节基因产物及功能PL,OL,PR,OR左右向转录的启动子和操纵子tR(1,2,3,4,5)右向转录的终止子tL(1,2)左向转录的终止子PRE C蛋白建立启动子，受C蛋白调控PIint基因启动子，受C蛋白调控PaQQ蛋白反义RNA启动子，受C蛋白调控PRMC蛋白基因维持启动子，受C浓度调控PR晚期转录的启动子nutnutL,nutnutRN蛋白左右两个反终止结合位点qutQ蛋白反终止结合位点croPL和PR的阻遏蛋白，并可阻遏PE，抑制 CI 表达cIPL 和PR 的主要的阻遏物，并可自主调控PRMc可以启动PRE

11、、PI 和PAQ，使进入溶原化途径c和C组成复合物，启动PE产生c及cro的反义RNANtR1,tR2及tL1的反终止蛋白QtR4的反终止蛋白.O,PDNA复制所需的蛋白S,R,R2裂解宿主所需的裂解酶int整合酶，使整合到宿主的染色体中xis切除酶，帮助在att位点和宿主连接bet,exo重组蛋白，帮助和宿主进行重组W,B,N u3,C,D,E,F,F,Z头部蛋白基因U,V,G,T,H,M,L,K,I,J尾部蛋白基因cos(cohesive)12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点，A蛋白切割位点A末端酶，识别cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组噬菌体立即进行PL和PR启动子启动的

12、N和ro基因转录。早期转录产生的N蛋白可使RNA聚合酶越过早期终止子而启动O、P和Q基因转录。O、P产物与复制有关，Q基因蛋白则与噬菌体的头、尾部包装和溶菌有关。DNA进入复制和滚环式复制，同时进行包装，最后导致细菌溶解，释放出子代噬菌体。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞），成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。基因组太大（基因组太大（49kb）；）；酶切点太多，它有酶切点太多，它有5个个BamH1位点（位点（GGATCC），），6个个Bg位点位点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。野生型只能接纳一

13、定长度的野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于若相当于噬菌体的噬菌体的75-105%，那么只能接纳那么只能接纳49kb5%=2.45kb的的DNA。切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）；去处太多的酶位点，每种酶只留去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口；增加标记基因（增加标记基因（remarke gene）。）。(4)(4)引入无义突变引入无义突变噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：置换型载体：可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。插入型载体：有一类只含一个限制性位点

14、可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。置换置换型载体 特殊性质：特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体裂解生长的能力。只有DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。这一特殊性质作为选择标记：重组子被包装：当EcoR切开DNA后，目的基因可以连接于左右两臂之间，形成足够长度的DNA片段而被包装。非重组子不被包装：如果没有外源DNA插入，由左右两臂直接融合起来的缺损基因，

15、由于长度不足，不能包装。Xgal蓝色噬菌斑试验区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法：噬菌体载体带有编码-半乳糖苷酶的基因，当这种噬菌体感染lac宿主细胞并在含有X-gal的培养基上生长时，半乳糖苷酶与X-gal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。插入型载体：插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。失去了非必需区仅保留了EcoR的单一切点切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA插入型载体插入型载体-c基因内保留Hind和EcoR单酶切位点，

16、当有外源DNA在这酶切位点插入时，使c基因失活，感染hf-大肠杆菌后可形成空斑。插入型载体插入型载体-注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：38kb 52kb。体外包装：噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白 粘粒的组成及性质：粘粒的组成及性质：它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达45kb 质粒复制起点（colE1）象质粒一样转化和增殖 抗性标记ampr cos位点 有的粘粒载体含有两个cos位点四、M13 噬菌体载体 单链DNA噬菌体是一类丝状的大肠杆菌噬菌体，由单链环状DNA分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成。M13噬菌体是单链DNA噬菌体

17、中的一个典型的代表。M13噬菌体的组成和结构 M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的组成和结构单链DNA，由6407碱基组成。90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和基因以及基因和基因之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。M13噬菌体的基因组的基因组M13噬菌体的基因组的基因组 编码3类蛋白质：复制蛋白（基因，和）形态发生蛋白（基因，和）结构蛋白（基因、和）4.3 M134.3 M13噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建 M

18、13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中；M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。M13M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：噬菌体作为载体具有几个重要的特点：M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。外源片段插入位点在基因和基因之间的508bp间隔区-M13不像噬菌体基因组那样

19、含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因/和基因/之间）。如果将未置换的载体转人携带有F附加体的宿主菌中，并放在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和X-gal的培养基上，就会产生蓝色噬斑 在M13mp1的LacZ区域插入外源基因片段，便会破坏-互补作用，结果产生的克隆重组体仅形成淡蓝色或无色的噬斑 通过观察噬斑颜色的变化，就能很容易识别和挑选重组体。M13mp18 和 M13mp19 这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有

20、所不同。当RF DNA被两种不同的限制酶切割以后，M13mp18 和 M13mp19 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链DNA片段时，方可闭合成环。M13mp18 和 M13mp19这一片段在 M13mp18 和 M13mp19 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在 M13mp18 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mp19 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即 M13mp18 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链，M13mp19重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用 M13mp18 和 M13mp19 作为一对载体，就可能

21、用一个引物（通用引物），从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。M13噬菌体产生单双链DNA的机制：1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA。4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。+-+-+-+-+-+-单链单链结合蛋白结合蛋白RF型型DNA复制约复制约200copy+以以-链链DNA为模为模板合成板合成+链链DNA