关于透射电镜和扫描电镜等的样品制备课件.ppt

1、5.1 TEM对样品的基本要求制备原因要求措施放大倍数100万倍，铜网直径3mm脱水、固定时易浸透 取材小样品取材小样品电子束打击样品易变形样品结实固定、包埋固定、包埋高真空（电子束、穿透能力）样品在真空状态下无挥发物脱水脱水电子束穿透能力弱样品切片厚度样品切片厚度100nm超薄切片超薄切片样品组成元素原子序数小、图像反差小 增加反差重金属染色重金属染色 根据样品的种类、性质和分析要求选用不同的制备方法，有以下三种方法：支支 持持 膜膜 法法 复复 型型 法法 薄薄 膜膜 法法5.2 TEM样品的制备方法5.2.1支持膜法支持膜法 悬浮液、粉体等细小试样悬浮液、粉体等细小试样需要捞在覆有薄膜的

2、金属载网上。经干燥后进行观察。具体操作在铜网上覆盖支持膜，将经过超声波分散超声波分散的颗粒悬浮液滴在支持膜上，静置干燥，或用红外灯烘烤干燥。制作载网的材料大多是铜，因此习惯上将载网称为铜网，不过制作载网的材料还可以是金、银、镍、铝、铂及尼龙。载网的大小随电镜的需要而不同，一般直径为3mm。网孔的形状有圆形、方形、单孔形等，网孔有50、100、200、300及400目等多种规格。常用一般普通组织超薄切片选用200-300目的载网，对于过小的和过碎的样品，可选用400目的载网；对于不易查找的样品，可选用带字母标记的载网。载网类型载网类型 带字母的载网 400目平行载网 载网的数目再高也是有空隙的，

3、为了防止极微小的样品在捞片时漏掉；或切片时在电子束的轰击下卷曲；或为了加强空隙大的载网的支持作用等，需要在载网上覆盖上一层支持膜。制作支持膜所选的材料要求透透明明、本身在电镜下无可见的结构本身在电镜下无可见的结构以及在电子束轰击下电子束轰击下有高度的机械稳定性有高度的机械稳定性3个基本的条件。有多种支持膜，较常用的有孚尔瓦膜、碳膜、火棉胶膜等。孚尔瓦膜一般制成20nm左右，它的支持力较强，但制备较复杂。碳膜只需几个纳米厚，它的特点是分辨力高，化学性能稳定，机械强度也高，常用于加固其它膜。火棉胶膜的机械强度较孚尔瓦膜小，但容易制备，所以也较常用。介绍一下Formvar膜的制法：该膜的化学成分为聚

4、乙烯醇缩甲醛（Polyvinyl formal，简称PVF）。首先制备02.-0.5%的氯仿（或二氯乙烯）溶液，然后用洗净的干燥的载玻片伸入到该溶液中停留片刻，平稳取出，自然干燥后玻片上形成一层薄膜。再用刀片沿玻片边缘将膜划破，继将该玻片的一端垂直浸入玻璃平皿的蒸馏水中，待玻片上的薄膜完全漂在水面，把玻片轻轻下压取出。再将铜网排列在膜上，用滤纸与铜网完全贴附后，用镊子夹住滤纸的一角轻轻将其取出放于培养皿中，待自然干燥后就使用了。Formvar支持膜的制备支持膜的制备 在使用之前，新网和旧网都需要进行清洗，清洗的目的除了使载网清洁之外，还有除去载网的静电以便捞片的作用。对于新的载网，直接用95的

5、乙醇浸泡一下，再用重蒸水冲洗后自然晾干即可。旧载网的清洗方法有以下两种：氯仿法：把旧网放入锥形瓶中，用氯仿浸泡若干天，经常晃动帮助残存的样品从载网上脱落，接着用重蒸水冲洗数次，再用100乙醇洗一次后，放在垫有滤纸的培养皿中自然晾干。烧灼法：用95的乙醇烧灼片刻后放入其中，最后用重蒸水冲洗数次，最后一次用100乙醇，捞出后自然晾干。由于电子束穿透能力很低，因此要求所观察的样品很薄，对于常用的75-200kv加速电压来说，样品厚度控制在100-200nm为宜。对于那些易起变化或难以制成电子束对于那些易起变化或难以制成电子束透明的薄膜试样采用复型法制备样品透明的薄膜试样采用复型法制备样品。复型法是用

6、中间媒介物（碳、塑料薄膜）把固体样品表面微观形貌浮雕复制到薄膜上，利用透射电子的质厚衬度效应，通过对浮雕的观察，间接地得到材料表面组织形貌。复型法得到的样品是一种间接试样。它只能用于试样表面形貌的观察和研究，而不能用来观察试样的内部结构。5.2.2 复型法 对复型材料的主要要求：复型材料本身必须是“无结构”或非晶态的；有足够的强度和刚度，良好的导电、导热和耐电子束轰击性能。复型的种类复型的种类 按复型的制备方法，复型主要分为：一级复型 二级复型 萃取复型（半直接样品）碳一级复型（1）用常规方法将试样的表面抛光、腐蚀，其腐蚀深度较一般金相腐蚀略深。断口最好为新鲜断口。（2）在真空镀膜仪中将试样表

7、面喷镀一层碳膜，厚度控制在1020nm。（3）用刀片或针尖将碳膜表面划成33mm的小方块。（4）将试样在专用的电解液中进行电解。当碳膜的边角翘起或有个别碳膜脱落时，取出试样并放到无水乙醇溶液中轻轻晃动，使碳膜脱落。（5）再用无水乙醇或水将碳膜轻轻漂洗23次，再在溶液中停留几分钟，将电解液彻底清除干净。（6）用铜网捞出晾干即可。碳一级复型示意图二级复型（1）用常规方法将试样表面抛光、腐蚀，其腐蚀深度较一般金相腐蚀略深。（2）配制好0.5%、1%、2%、5%几种不同浓度的火棉胶醋酸异戊脂溶液。（3）取0.5%的火棉胶溶液均匀地涂于试样表面，用红外灯烤干，依次用同样的方法将1%、2%或5%的火棉胶溶

8、液涂于试样表面，并烤干。（4）用透明胶带紧贴火棉胶面，不能有气泡，小心地将胶带与复型膜一同揭下来，让复型膜面朝上，将胶带固定在载玻片上，做好标记。（5）用真空镀膜仪在复型膜面上蒸发上1020nm厚的碳膜。（6）用尖刀将想要观察部分剪成略小于3mm铜网的小方块，放入二甲苯溶液中，浸泡1小时使胶带与复型膜分离。（7）用铜网将与胶带分离的复型膜捞到醋酸异戊脂溶液中溶掉火棉胶。（8）待火棉胶完全溶解后，用3mm铜网捞出，晾干。萃取复型 定义：萃取复型是样品制备中最重要的进展之一，其目的在于如实地复制样品表面的形貌，同时又把细小的第二相颗粒（如金属间化合物、碳化物和非金属夹杂物等）从腐蚀的金属表面萃取出

9、来，嵌在复型中，被萃取的细小颗粒的分布与它们原来在样品中的分布完全相同，因而复型材料就提供了一个与基体结构一样的复制品。萃取出来的颗粒具有相当好的衬度，而且可以在电镜下做电子衍射分析。萃取复型选择的腐蚀剂要求能够腐蚀并显示基体组织形貌，但不能与萃取相发生化学反应，其腐蚀深度也较普通复型样品的腐蚀深度要深些。碳萃取复型方法 按照一般金相试样的要求对试样磨削、抛光。选择适当的浸蚀剂进行深腐蚀，这种浸蚀剂既能溶去基体而又不会腐蚀第二相颗粒。将试样认真清洗以除去腐蚀产物。将试样放入真空镀膜机中喷碳，喷碳时转动试样以使碳复型致密地包住析出物或夹杂物。选择适当的电解液进行电解脱膜，电解脱膜时电流密度要适当

10、，电流过大形成大量的气泡会使碳复型膜碎裂，电流过小则长时间脱不掉碳膜，适当的电流要通过试验确定。将脱下的碳膜捞入新鲜电解液中停留10min左右，以溶掉帖在碳膜上的腐蚀产物。将碳膜捞入酒精中清洗，最后用铜网捞起放到滤纸上干燥待观察。萃取复型示意图5.2.3薄 膜 法 薄薄 膜膜 法法：不仅可得到高分辨率图像，显示试样内部十分细小的组织形貌衬度，还可以获得许多与试样晶体结构有关的信息（如点阵类型、位向关系、缺陷组态等）。A 金属样品：双喷电解减薄法、离子减薄法B 无机非金属材料和导体矿物质：离子减薄法C 高分子材料和生物试样：超薄切片法5.2.3.1 金属薄膜样品的制备 目前较普遍地被采用的金属薄

11、膜制备过程大体是：线切割-机械研磨（或化学抛光）-化学抛光-电解抛光。具体方法如下：1.线切割线切割：用线切割机床从大块样品上切下0.2-0.3mm厚的薄片，一般多切几片备用。2.机械研磨预减薄机械研磨预减薄：机械研磨方法与金相试样抛光过程基本一致，其目的是将线切割留下的凹凸不平的表面抛光并预减薄至100m左右。机械研磨具有快速和易于控制厚度的优点，但难免产生应变损伤和样品升温，因此，减薄厚度不应小于100m，否则其损伤层将贯穿薄片的全部深度。简单的机械研磨可以产生大面积的薄区，但却使样品过于脆弱，很容易损坏，以我们的经验，一般Si材料可以平磨到50m左右，对于脆性材料可适当增加厚度。手工平磨

12、时，应采用不断变换样品角度，或者沿“8”字轨迹的手法可以避免过早出现样品边缘倾角。如图示：P1500P20001m金刚石膏金刚石膏 3.化学抛光预减薄化学抛光预减薄 化学抛光是一种快速的减薄过程。抛光液一般包括三个基本成分，即硝酸或双氧水等强氧化剂用以氧化样品表面。又以另一种酸溶解产生的氧化物层，此外还应含有粘滞剂以作为溶解下来的原子进行扩散的介质。4.双喷电解最终减薄双喷电解最终减薄 经过化学抛光预减薄的薄片可以冲成3mm的小试样，剪成小块试样，然后将样品放入双喷电解抛光装置的喷嘴之间进行最终的减薄处理。最后得到的是中心带有穿透小孔的薄片样品，将样品清洗干燥即可以直接在透射电镜下观察小孔周围

13、的透明区域。电解抛光的抛光液配法很多，最常用的是10高氯酸酒精溶液.双喷电解减薄工作原理双喷电解减薄工作原理：试样与铂丝导线保持接触作为阳极，电解液喷管中的一对铂丝作为阴极，喷管对准试样的中心。电解液通过耐酸泵加压循环。样品中心逐渐减薄，直至穿透。洞口的边缘为透射电镜观察的区域，厚度小于200nm。一般采用双喷或者离子减薄。这种方法主要用于金属和合金样品。离子减薄仪的工作原理离子减薄仪的工作原理：在电场作用下氩气被电离成带Ar+的氩离子，带着一定能量的氩离子从阳极飞向阴极，通过阴极孔，打在接地的样品表面，使样品表面溅射，这就是氩离子轰击的基本原理。这种方法对于陶瓷、金属等试样都可以适用，是一种

14、普适的减薄方法。双喷电解抛光装置原理图双喷电解减薄仪离子减薄装置原理示意图金属与非金属薄膜制备工艺图金属与非金属薄膜制备工艺图500m80m3mm5m2.5mm5.3 超薄切片的基本操作程序 超薄切片是生物样品制备方法中最基本、最常用的技术。制备超薄切片的过程包括两个大的步骤：第一步是制备组织包埋块；第一步是制备组织包埋块；第二步是切块。第二步是切块。高分子生物医学材料超薄切片流程图5.3.1 取材 取材-按“快、冷、小、净、准”的原则，在尽可能短的时间内将1mm3的样品放入 固定液。快快 为了能观察到尽量接近生活状态时的生物组织或细胞结构，取材越快越好。冷冷 尽量保持低温下操作，使酶作用降低

15、，减小对微细结构的影响。小小 取材时，动作要轻巧，刀片要锋利，组织块要 1mm3。否则固定液穿透不良。净净 尽量少带血液或组织液进入固定液。但切忌用水冲洗，可用缓冲液把表面血液或组织液冲掉。准准 取材的部位要准确。电子显微镜的放大倍率很高，观察到的视野很小。为了避免由于取材不准确而造成的一孔之见，要求取材要有一定的形态学实验基础。定义定义：指用物理的或化学的方法手段迅速地杀死细胞，使组织细胞的形态尽可能地保存在接近其生活时的状态。目的：目的：1.防止组织细胞离体后变化，防止自溶，以保持组织细胞的成分和结构与其生活状态尽量一致。2.在固定以后的漂洗、脱水和包埋等样品处理过程中，保护样品使其物质不

16、致溶解和流失。3.使组织适当的硬化为样品以后的处理做好准备。方法：方法：有物理的和化学的固定法。其中化学的方法是最常用的固定方法。对于不同的样品材料，以及不同的实验目的应采取不同的固定方法。5.3.2固定 化学固定，化学固定，是用化学试剂使各种结构成分形成不溶物，以免被水溶液与酯溶剂所提取。组织块切小后，立即浸到大量固定液中。一般使用青霉素小瓶，每瓶放10-20块组织，固定液2-4ml，置于4摄氏度固定2-4h或更长时间常用双重固定或多重固定。一般常用的固定剂是戊二醛和锇酸。一般常用醛类固定液做预固定，经过漂洗后再用四氧化锇固定液后固定，以提高固定效果。物理的方法物理的方法指用冷、热或微波等物

17、理方法对生物组织进行固定，是化学固定的辅助方法。冷冻固定和微波固定是较为常用的方法。1.四氧化锇和四氧化锇固定液四氧化锇和四氧化锇固定液 四氧化锇也被称为锇酸。实际上它既非电解质，也不生成盐，是强氧化剂。市售为安瓿状的微黄色结晶，挥发性强，有强烈的刺激性气味。该试剂较贵重，0.5g或1g包装。四氧化锇的毒性很强，它的蒸汽对眼角膜及鼻、喉粘膜具有毒性作用，使用时要注意防护作用，最好在通风橱内操作。四氧化锇固定液一般配置成2%的水溶液保存，临用时加等量的缓冲液稀释，使最终浓度为1%，锇酸不易溶解，配后要1-2天才能使用，而且应该避光，贮存在冰箱内。水溶液应呈无色或淡黄色透明，若变成棕色则不能使用。

18、优点优点：它能与不饱和脂肪酸结合形成脂肪-锇复合物固定脂类，与蛋白质发生交联稳定蛋白质，因此能较好的保存组织细胞的微细结构；虽然四氧化锇不和单独的核酸及糖类起反应，但当核酸糖类与蛋白质结合在一起时也能被固定，因此它几乎能和所有的细胞成分结合；四氧化锇电子密度高，能使被固定的组织产生良好的反差，本身起到染色的作用。而其它对缓冲液的要求不高。缺点缺点:1.它不能保护糖原不能固定核酸，对微管固定较差；2.四氧化锇渗透组织很慢，所以组织块要切的很小。当组织块大于1mm以上时，不能得到完全固定。3.四氧化锇不能保存酶的活性，因此不能用作细胞化学的固定剂。2.戊二醛和戊二醛固定液戊二醛和戊二醛固定液戊二醛

19、含有两个醛基，30以上浓度的戊二醛易聚合，一般商品浓度在25以下，含有较多杂质。新处理过的戊二醛为无色或很淡的黄色，贮存久时颜色会变深。由于戊二醛中的醛基易氧化为有机酸，使PH值下降。当PH值下降到3.5以下时，就失去固定能力，需要纯化。纯化的方法有蒸馏及用活性炭处理等方法。醛类固定剂固定后，一般需要四氧化锇进行二次固定，这就是广泛应用的双固定方法。戊二醛固定剂具有下列优点：1.它与蛋白质交联的能力是固定剂中最好的，也能固定糖原和核酸，对细胞内结构如微管等保存也较好，并能保存细胞内一些酶的活性，因此是保存精细结构最有效的醛；2.戊二醛的渗透速度比四氧化锇要快些，且反应快；3.戊二醛能够弥补四氧

20、化锇固定剂的不足，对微管、内质网和细胞基质有较好的固定作用，可以避免四氧化锇做原始固定剂可能产生的抽提作用；戊二醛较适用于进行超微细细胞化学研究工作。戊二醛固定的主要缺点为：1.它不能固定脂质，致使其在以后的脱水过程中被有机溶剂溶去，因而不适于作为单独的电镜固定剂；2.戊二醛不像四氧化锇那样能提供高反差，因此与四氧化锇复合使用，则可发挥两种固定剂的长处，互相弥补不足之处；3.戊二醛固定不影响细胞的渗透性，因此它对缓冲液及其渗透压要求较高。戊二醛通过交联作用稳定细胞的结构，对细胞膜系统、糖原、核蛋白和细胞基质的固定效果好。固定时温度允许在4度至10度之间，固定的时间根据样品而定。浓度一般用缓冲液

21、配制成2-3%。3.多聚甲醛和多聚甲醛固定液多聚甲醛和多聚甲醛固定液 多聚甲醛：电镜样品固定多用纯化的多聚甲醛，为白色粉末。多聚甲醛经水解后，解聚为甲醛溶液。多聚甲醛的优点是能和蛋白质、脂类、核酸等起反应，并能保存部分细胞内酶的活性；多聚甲醛的分子很小，因此穿透组织的能力很强，对固定致密的组织以及较大的组织尤其合适。此外，多聚甲醛价格便宜、使用方便。但甲醛只有一个醛基，反应速度慢，与组织形成的交联数目比戊二醛固定液少，导致甲醛固定液的微细结构的保存和组织反差不如戊二醛固定液。所以，多聚甲醛固定液一般多用于组织化学或快速固定。在样品前处理中，一般用多聚甲醛固定液作为前固定，以后再用四氧化锇做后固

22、定，能取长补短，效果好。也可与戊二醛同时进行混合固定，效果更好。化学固定剂通常需用一定的缓冲液配制，缓冲介质在固定时所起的作用为：使固定液维持稳定的PH，使固定液有适当的渗透压，不使细胞收缩或肿胀；提供适当的离子成分，使细胞成分不被抽提或成点。用于电镜固定液的缓冲介质有多种，如磷酸缓冲液、二甲砷酸盐缓冲液等。由于大多数动物组织的PH值为7.4，因此缓冲液的PH值选择在7.4左右。缓冲液及其配制 磷酸缓冲液 它的优点是便宜，无毒但缺点是久放易产生沉淀易遭到细菌的污染。磷酸缓冲液的PH会随温度的变化而稍有变化，在PH7.5以下，它的缓冲能力很强，控制固定液的PH值比较有效。磷酸缓冲液常用于配制戊二

23、醛固定液。二甲砷酸盐缓冲液 此溶液配制比较简单，也比较稳定，能保存，不易被细菌污染；但有一定毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制。尽量不使试剂与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入。常用浓度为0.1mol/L。醋酸巴比妥缓冲液 醋酸巴比妥液在电镜技术的早期用来配制四氧化锇，固定效果比磷酸缓冲液的效果好。此缓冲液缓冲能力较差，和醛产生作用后减弱缓冲能力，因此不能用来配制醛类固定液。此外，该缓冲液易于被细菌污染，不能长期保存。4.影响固定效果的因素：影响固定效果的因素：固定是一种复杂的化学过程。固定液的PH、浓度、离子组成与渗透压、固定时的温度、时间与方式以及组织块的大小等因素都能影响固定的效果。至今

24、还没发现一种固定液适合任何一种组织，因此在实际工作中就需要根据不同的组织选用恰当的固定液和固定条件。固定液的固定液的PH 蛋白质是一种两性化合物，其相对分子质量以及其它理化性质与溶液的PH密切相关。固定液的PH将影响细胞中原生质的组成、膜的选择性及酶的活性。固定液的PH必须接近固定组织的PH，这样可以使细胞避免由固定液所造成的蛋白质结构和性质的变化。固定液的浓度固定液的浓度 一般来说，较低的浓度需要较长的固定时间，这样就容易引起酶的扩散、细胞物质的抽提及组织的肿胀。过高的固定浓度液是不合适的，因为浓的溶液毁坏酶的活性和细胞的精细结构。尤其是氧化固定剂，如锇酸和高锰酸钾，只有在适当的浓度下，才是

25、有效的交联剂，较高的浓度就会造成蛋白质分子的断裂。含水较多的组织，一般需要较高的固定浓度。固定液渗透压及离子组成固定液渗透压及离子组成。一般来说，低渗的固定液容易引起组织膨胀，而高渗的固定液容易造成组织的收缩。为了调节固定液与组织的渗透压平衡，固定液中常加入钾、钠、钙盐等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质。固定的温度和时间固定的温度和时间 为了降低酶的活性、减少细胞自溶及胞内物质的抽提，大部分组织通常是在0-4摄氏度下固定1-4h，但细胞中的微管与微丝应在室温下固定。由于化学固定所引起的物质的抽提是随时间逐渐进行的，因此，过度的固定可能丢失更多的物质。组织块的大小组织块的大小 固定作用通常是不均匀

26、的，从组织块的表层到深部，存在着固定梯度。表层有高浓度的锇的沉积，但这一层的机械损伤较大；中心部位无机械损伤但往往固定不足。因此，在这两层之间的那一部分组织是比较理想的。一般来说，锇酸的均匀固定大约在0.25mm的深度，因此组织块的大小最好在0.5mm3左右。固定是标本制备过程中及其关键的一步，也是复杂的化学过程。其中的每个因素都会影响固定的效果。5.3.3 漂洗与脱水 组织固定后，应用漂洗液洗去残留的固定液，尤其是醛类固定液固定后，一定要充分漂洗干净，一般需漂洗5次以上，漂洗时间为2h或过夜。这是因为醛会和锇酸起反应，产生细而致密的颗粒沉淀在样品中，既影响锇酸的固定作用，又会造成样品污染。此

27、外，由于锇酸亦和乙醇作用，产生沉淀，因而用锇酸固定后，也应把多余的锇酸固定液漂洗掉，但洗的时间可以短些，10-15min即可。常规电镜样品中所用的漂洗液一般是0.1mol/l磷酸缓冲液，其温度与固定液温度一致，为4度。大多数生物样品中水分的比例很高，达70-80%以上，而水中又有85-90%为游离态水，再加上包埋剂多为水不溶性物质，因此，如果包埋前不彻底除去样品中的游离态水将影响包埋块的质量。单纯的烘干会使样品收缩变形，并破坏其超微空间结构，所以要进行脱水。脱水剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙二醇等，最常用的为乙醇。一般用乙醇脱水时，其梯度浓度为30%-50%-70%-80%-90%-95%-100

28、%两次，每部10-15min。另外，70%以前需要在4度操作，80%以后转至室温。如果选用环氧树脂包埋，用乙醇脱水后，最好再用环氧丙烷处理20-30分钟，以置换出样品中的乙醇。因为乙醇与环氧树脂不能很好的混溶，可能会影响包埋块的质量。脱水l脱水剂的梯度幅度和每步脱水的时间都有讲究，梯度过大，速度过快会使样品样品收缩收缩，而脱水剂的浓度在70%以前时，每步脱水的时间过长会使样品膨胀过长会使样品膨胀；在95%以后每步脱水的时间过长会使样品收缩；只有在70%时，因为与生物样品的渗透压相似，可停留较长时间。l脱水过程中应注意两点：一是脱水要充分，脱水不完全会导致渗透不完全，造成切片困难，还会引起组织和

29、细胞受损；二是更换脱水剂是动作要快，尤其是换无水乙醇时，不要使样品干燥，否则样品内易产生小气泡而影响包埋剂的浸透。组织块在脱完水后，要用一种常温下为液态、经过加温聚合后有一定硬度的介质对其进行处理，使处理后的组织有适当的硬度和良好的切割性能。这种介质就称为包埋剂。通过脱水剂稀释包埋剂，并最终以包埋剂完全取代脱水剂，使其渗透到组织块中的过程就是浸透。而将浸透好的组织块放在适当磨具中并灌入包埋剂，再加温聚合成硬块的过程就是包埋。5.3.4浸透与包埋 浸透的目的和方法：浸透的目的是用包埋剂逐步替代浸入样品内部的脱水剂，以填充样品超微结构的各个空间。包埋的目的：经过脱水和浸透的样品还不能直接进行超薄切

30、片，还需要用某种在一定条件下能聚合成硬块的单体树脂，来填充样品的各个空间，把这一过程称为包埋。聚合：有加温聚合、降温聚合、快速聚合、或慢速聚合、普通光照聚合或紫外光照聚合。理想的包埋剂应具备以下特征：理想的包埋剂应具备以下特征：处于液态时粘度小、易渗透；固化后既不膨胀也不收缩，并有一定的机械强度，有助于保存样品的超微结构和制备超薄切片。并在电子束的轰击下性能稳定，不升华、变形和断裂，并且不干扰样品本身的而超微结构有良好的电子透过性。常用的包埋剂有环氧树脂包埋剂、聚酯树脂包埋剂和甲基丙烯酸脂包埋剂。国内常用的为国产环氧树脂618、Epon812及低粘度Spurr环氧树脂。环氧树脂为热塑性树脂，是

31、淡黄色或蜜黄色的液体。分子中有两种化学反应基团，即环氧基和羟基。末端环氧基易打开，与其它含有活性氢原子的化合物如胺类形成首尾相接的长链状聚合物。能够促进末端相接的交联剂叫做催化剂或加速剂催化剂或加速剂，它们能催化聚合反应，而本身并不加入到树脂链中。此外，单体中的羟基能和酸酐结合形成分子间的横桥连接。这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂或固化硬化剂或固化剂，它们参与交联反应并被吸收到树脂链中。因此，环氧树脂单体、胺类、和酸酐三者按照一定的比例混合，在一定温度下可形成具有三维空间结构、稳定的抗热和抗溶的交联状聚合物。浸透和包埋的具体操作(一)浸透组织块在用乙醇和无水丙酮或环氧丙烷脱水后，用包埋剂

32、与与环氧丙烷按照一定比例混合，逐渐渗透入组织块，取代乙醇。因为包埋剂的黏度要比脱水剂大得多，所以要用环氧丙烷与包埋剂配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐渐增加，以提高样品的质量。环氧丙烷和环氧树脂类的包埋剂较好的混溶，也有助于达到逐级浸透的目的。浸透液的配置和使用方法如下：环氧丙烷：包埋剂=3：1 （V/V）3060分钟环氧丙烷：包埋剂=1：1 （V/V）3060分钟环氧丙烷：包埋剂=1：3 （V/V）3060分钟100%包埋剂 1-2h注：在室温或是30-35度下浸透，必要时用慢摇床提高浸透的效果。浸透的时间可以灵活的掌握。浸透完成后就要进行包埋。操作：取要用空心胶囊或特制的锥形塑料囊或多

33、孔橡胶模板作包埋块的模子。包埋前先将胶囊或模板置于60度温箱中1-3h烘干；包埋时，先在胶囊中滴一滴包埋剂，再将组织块用牙签挑至胶囊中，然后注入包埋剂。或先将胶囊注满包埋剂，再用牙签挑起组织块放在胶囊的液面中心，让组织块自然沉淀，然后进行聚合。使用不同的包埋剂，制备不同的样品，需要的聚合条件不同。有加温聚合、降温聚合、快速聚合或慢速聚合、普通光照聚合或紫外光照聚合。环氧树脂618、Epon812可置于37度烤箱中12h或过夜，60度36-48h，亦可直接放入60度温箱中聚合，时间为1-2d；Spurr树脂放在70度温箱8h即可。总之，要使包埋剂完全聚合，才能有均匀的硬度否则会到导致切片困难。5

34、.3.5包埋及聚合硬化包埋操作中应注意以下几点：(1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；(2)所用器皿应烘干；(3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；(4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；(5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；(6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净。常用包埋模具常用包埋模具5.3.6修块与半薄切片定位 修块：是成功切出理想连续切片的关键。通常采用手工修块，将已聚合的环氧树脂包埋块放入专用的样品夹中，在解剖镜下用单面刀片修去其顶端和组织周围多余的包埋介质，暴露出的表面积小于0.1mm2和低于0.2mm的小方台，修完后呈金字塔形。定位:由于超薄切片的面积极小，为了

35、在电镜观察时容易找到所希望观察的部位，进行超薄切片前必须进行定位。半薄切片定位利用超薄切片机切厚度为1m-10m的切片，称厚切片或半薄切片。将切下的片子用镊子或吸管转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温，使切片展平，干燥后经甲苯 胺 蓝 染 色，光 学 显 微 镜 观 察 定 位。标本修块标本修块 半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1)定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去其余部分。(2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为

36、0.2mm0.3mm。5.3.7超薄切片 包埋块修整好后就进入超薄切片阶段了。要获得高质量的电镜照片，切片必须是超薄的，厚度均匀，表面平整，无震颤、无皱褶和破裂，且能耐受高真空和电子束的轰击。超薄切片机是用来将已包埋在环氧树脂中或已冷冻固定的生物样品制成纳米级厚度薄样品的专业机器。超薄切片机从进刀原理构成上可以分为两大类：一类是以热膨胀为主的切片机，利用金属杆热胀或冷缩时产生的微小长度变化来提供推进。一类是以机械推进式为主的切片机，用微动螺旋和微动杠杆微动螺旋和微动杠杆来提供微小推进。70年代前生产的为热膨胀式，80年代开始向机械推进式过度，目前的超薄切片机大多数为机械推进式。1.热膨胀式超薄

37、切片机 ：以LKB的系列产品为代表，该类超薄切片机的进刀控制由对热极为敏感的金属材料控制，当对其进行加热时，该金属规则膨胀，使切片机刀口缓缓向前推进，由于该种超薄切片机对温度极为敏感，所以在超薄切片的时候，对切片室的温度稳定性要求极高，温度变化大，易造成切片不稳定，切片厚度不易控制。因此在切制50nm以下的生物样品及用钻石刀切片时，最好不用。2.机械推进式超薄切片机：以莱卡系列产品为代表，该类型超薄切片机的进刀以机械推进机械推进的方式进行。由于采用了高精度的机械推进装置，使进刀的稳定性大大提高，摒弃了热膨胀式超薄切片机由于温度不稳定而带来的切片质量不易控制的缺点，如再配合使用钻石刀，则超薄切片

38、的质量能够达到理想的程度。目前超薄切片机的类型基本上以机械推进式为主流。Leica EM FC6 冷冻超薄切片机 超薄切片使用的刀有两种，可选用钻石刀或玻璃刀。钻石刀的质量好，不用特意制备，市售有多种型号供选择，经久耐用，切片时容易对刀和切出优良的连续切片，特别适宜质地硬的样品。但其价格昂贵。玻璃刀临用之前制作，刀刃易脆裂，通常一把刀切一个样品就得废弃，且适宜质地较软的样品，但价格相对便宜的得多。这里讲的制刀指的是用制刀机制备玻璃刀的方法。制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为5mm6.5mm。制刀制刀 玻璃刀用制刀机制作。制好玻璃刀后，要围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有塑料水

39、槽和胶布水槽两种。塑料水槽有固定的形状，可反复使用。胶布水槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。刀槽刀槽刀的检查和保护刀的检查和保护：明显的劣质刀是出现双刀跟（即无刀锋）、刀缘突起、刀缘凹陷或刀缘上有明显的裂损等，这样的刀不能用。为了减少切片时的麻烦，有必要先检查刀缘是否有用肉眼不易看出的微小的损伤，及时淘汰劣质玻璃刀。方法是把刀安放在切片机的刀架上，打开白炽灯，在显微镜下观察刀缘，如果刀缘成一条暗线（尤其是在刀缘的左侧1/3段内），说明其锋利无损。如果刀缘上有许多反光的亮点，说明有小的裂损。用这样的刀切片，k肯定有划痕，因此弃之不用。为了保护刀缘，制刀

40、和切片过程中绝对不能用任何异物去碰，并且最好现做现用，以免因放置过久，空气的氧化作用使刀缘失去锋利。玻璃刀玻璃刀超薄切片的步骤包括：超薄切片的步骤包括：(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；(4)预切片；(5)换切片刀重新调节刀与组织块的距离；(6)调节切片厚度及切片速度，切片；(7)将切片捞在有支持膜的载网上。由于超薄切片切下的片子很薄，很难测量其厚度，因此，一般利用切片表面反射的光和从切片下面反射光所产生的干涉色来判断切片厚度，厚度不同的切片在显微镜下呈现的干涉色也不同。用树脂包埋的切片，其干涉色与厚度的关系如下：灰色：40-50nm；银白色：50-70nm；金黄

41、色：70-90nm；紫色：90nm以上。切片中可能出现的问题和解决的方法 产生问题的原因：切片的质量往往受到诸多因素的影响，切片中很可能会出现各种各样的问题，特别是有关切片质量的问题。如：切片开裂、切片过厚（表面的干涉光五颜六色）、切片上有一行行的平行排列的条纹或纵行的划痕、切片不能连续成串等。原因有以下几种，应具体分析：A影响包埋块质量的因素-包埋剂是否混合均匀，聚合的时间温度是否合适、样品渗透是否充分等 B 切片准备工作方面的因素-修快是否规范，刀口是否锋利，水槽的制作是否规范等 C 切片过程中的某些因素-刀角的选择，可能过大或过小，刀和样品的安装是否牢固和标准，切速过快过慢，对刀是否规范

42、等 D 其它方面的因素-附近是否有大型机械振动源，电压是否稳定，室温是否过高或过低等。可能出现的问题和相应的措施：A 切片上有颤纹：这是切片时最常出现的问题之一，其表现为切片上布满平行于刀缘的条纹，或粗或细，疏密不一。这是在切片过程中有震颤引起的。下表介绍了产生震颤的原因和解决的办法。原因解决的办法 样品块太软把已修好的样品放在100度烤箱里再烤1-2h，重新包埋，适当加大硬化剂的比例如：MNA，改变聚合条件如：延长时间或提高温度样品块太硬重新包埋，适当加大软化剂比例如：DDSA，改变聚合条件如：缩短时间或降低温度等。或改用钻石刀 修块面积太大重新修块，切片面积小于0.1mm3为宜 样品固定不

43、稳检查并旋紧样品臂上所有与固定样品有关的螺钮 刀固定不稳检查刀背是否紧贴刀架，检查并旋紧所有固定刀的螺钮 切片参数不适重新调整刀角和切速等 其它检查周围是否有大的震动源如：机械马达，人为碰撞切片机台面等 B 切片破碎：切片破碎是不宜捞取的，不完整的片子在电镜观察时往往也得不到良好的图像。其原因和解决的办法如下：切片表面凹凸不平-用手动切片重新修块，直到切下完整的片子为止包埋块脆-重新包埋，严格按照配方比例，并充分搅拌包埋剂和适当延长渗透时间。另外，脱水不彻底也会使包埋块脆并有许多小空洞，有时甚至在修块时就能看到大大小小的空洞。一般对于这样的包埋块就废弃了，并在重新包埋时注意严格脱水，在搅拌包埋

44、剂时应尽量减少气泡的产生，并静置一段时间，使气泡排掉之后再用。C切片不能连成带：有的研究工作需要观察连续 切片，如果切下的片一个一个都散开就无法捞片，其原因可能如下：原因解决的办法对刀不良重新对刀，使样品头上下边缘和刀缘平行修块不标准重新修块，使样品头表面至少有两条对应相互平行，并使平面的边缘整齐笔直 刀钝换刀缘或换刀，使落片顺畅 水槽液面不平用注射器点滴或吸取，调整过低或过高的液面，使液面与刀缘持平 D切片厚薄不匀：同一张切片有厚有薄的表现是切片的干涉色不一致，即有深有浅或五颜六色，这将直接影响成像的质量。切片上有空脂-重新修块；立体镜下示透亮的区域为空脂，即指没有样品结构的区域。空白包埋介

45、质与有样品结构的区域的硬度是不一致的，因此用同一硬度的刀切片时，会导致切片的厚薄不均，解决的办法是在重新修块时去掉空白区。刀缘的锐度不一致-调整刀缘或换刀。当刀缘的不同区域的锐度不一致时，刀缘锐利的部分切出的片子薄，反之则厚。E其它：切片带水-指样品块头部和刀背上沾水，使无法正常切片。解决的办法是用干净的滤纸条吸掉，但要注意操作时切勿碰刀缘，如果是水槽液面太高引起的，就需要重新调整一下液面。空切-切片时只有样品臂上下运动，却见不到有片下来的情况称为空切。引起空切的原因可能是对刀不准，距样品太远或样品面与刀缘不平行。也可能是加热不足或切速过快等。水面干涉色消失-有时在切片过程中，本来已经调好的乳

46、白的干涉色水面会缓缓消失，变成一片片黑影，使无法观察切片。其原因是水槽的液面下降了，这可能使由于切片过程太长、水分挥发和连续捞片损失引起的；也可能使由于水槽漏水引起的。5.3.8 电子染色 生物样品的化学成分主要是C、H、O、N等原子序数低的元素，再加上透射电镜要求样品先制成超薄切片（100nm左右），所以生物样品对电子的散射能力很小，图像反差很低。为了提高生物样品的反差，首先要设法增加其对电子的散射能力。选用重金属盐类进行电子染色可以达到这一目的。超薄切片的染色指的是用重金属盐溶液处理样品使其与细胞中某些特定成份结合或吸附在某些特定的结构上。常用的重金属：锇、钨、铅、锰等。因它们对生物样品中

47、的不同组分有不同程度的结合力，因此样品中结合重金属盐的区域对电子的散射能力也会不同程度的增强，使电子图像显示深浅不一的黑白色。这样既增强生物样品的反差，又增加了成像的层次，从而大大提高了电子显微图像质量。铀盐：常用醋酸双氧铀配制电子染色剂。醋酸双氧铀为荧光黄色粉末，再15度时饱和溶液的的浓度为7.7，用50或70的乙醇配制可提高溶解度。它能发射荧光，有微量放射性，所以应用时应格外小心。染色时需避免强光照射，并且用棕色瓶子壁光保存。它的染色效应是通过双氧铀离子与样品中的生物分子基团结合而实现的。生物分子基团能够提供一对电子，因而能于金属离子相结合，形成金属复合物。一个双氧铀离子能与一个或多个生物

48、分子基团相结合，形成不同的金属复合物。而双氧铀离子与羧基和磷酸基的亲和性较强，对富含这样结构的物质有广泛而明显的染色效果，如：脱氧核糖核酸、蛋白质和结缔组织等。铅盐：常用柠檬酸铅（枸橼酸铅）配制电子染色剂。其染色原理：与样品中不同的活性基团的反应机制不同，但铅盐的染色效应是一种离子结合反应，即铅离子与活性基团的反应。染液中的柠檬酸钠的作用是螯合溶液中的铅离子，并形成稳定的络合物。这样既减少碳酸铅沉淀的形成，又能将铅离子带入样品。在样品中铅与某些阴离子活性基团相结合，达到染色的目的。细胞核与核蛋白颗粒对铅离子的亲和力强，而糖原较差。染色方法：常规超薄切片中常用的是醋酸铀枸橼酸铅双染法。将1片洁净

49、的牙科蜡片放在培养皿中，滴一滴过滤的醋酸铀染液到蜡片上，再将带有切片的载网覆盖在染液上，使有切片的一面与染液接触，染色时间30min，染好后用水将切片洗净洗干，再覆盖在用同样方法的在另一洁净蜡片上的铅染液上，有切片的那一面与染液接触。铅染色时应严格控制染色时间5-7min即可，防止过染。同时应尽量减少暴露爱空气中的时间，并可在培养皿的周围放些氢氧化钠结晶，以免铅染液与空气中的二氧化碳形成沉淀，污染切片。超薄切片染色步骤超薄切片染色步骤超薄切片法流程 取材-按“快、小、轻、准、冷”的原则，在尽可能短 的时 间内将1mm3的样品放入 固定液。前固定-2%-5%戊二醛，1小时 4冰箱保存 清洗（1）

50、-磷酸缓冲液 10-15分钟，3次。后固定-1%锇酸1-2小时,4冰箱保存。清洗（2）-同清洗（1）脱水-酒精/丙酮梯度脱水：50%、70%、80%、90%，各10-15分钟/次，100%，10-15分钟/2次。浸透-包埋剂浸透3小时（可过夜）；包埋-用包埋剂将样品包埋在胶囊或包埋板里；聚合-置烤箱：37，24小时；45，24小时；60，24小时；超薄切片-用超薄切片机将样品切成厚约50nm 的超薄切片；电子染色-醋酸铀30-40分钟，柠檬酸铅30分钟；电镜观察透射电镜样品制备程序透射电镜样品制备程序5.4 冷冻超薄切片冷冻超薄切片技术是在光学显微冷冻切片和电镜超薄切片的基础上发展起来的。由于