(生化工程教学课件)16-沉淀法.ppt

1、1知知识识点点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀法，非离子型聚合物沉淀法,聚电解质沉淀法,金属离子沉淀法。重点重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并能根据实际情况予以灵活应用和选择。难难点点：常用沉淀方法的灵活运用。2盐析法等电点沉淀法有机溶剂沉淀法非离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法高价金属离子沉淀法3 1 盐盐析法析法 多用于各种蛋白多用于各种蛋白质质和和酶酶的分离的分离纯纯化。化。2有机溶有机溶剂剂沉淀法沉淀法 多用于生物小分子、多糖及多用于生物小分子、多糖及核酸核酸产产品的分离品的分离纯纯化，有化，有时时也用于蛋白也用于蛋白质质沉淀。沉淀

2、。3等等电电点沉淀法点沉淀法 用于氨基酸、蛋白用于氨基酸、蛋白质质及其它两及其它两性物性物质质的沉淀。但此法的沉淀。但此法单单独独应应用用较较少，多与其它方法少，多与其它方法结结合使用。合使用。4非离子多聚体沉淀法非离子多聚体沉淀法 用于分离生物大分子。用于分离生物大分子。5生成生成盐盐复合物沉淀复合物沉淀 用于多种化合物，特用于多种化合物，特别别是是小分子物小分子物质质的沉淀。的沉淀。6 热变热变性及酸碱性及酸碱变变性沉淀法性沉淀法 用于用于选择选择性的除去性的除去某些不耐某些不耐热热及在一定及在一定PH值值下易下易变变性的性的杂杂蛋白。蛋白。45，;M为盐的摩尔浓度221iiZcI678

3、随pH 变化（1）对数关系（2）等电点附近有极小值 随温度变化 随温度升高减小，热促失水膜 盐析注意事项：(1)稳定pH 用磷酸缓冲液（2）硫酸铵加入后体积变大（3）选择饱和度（4）分步盐析（5）初始蛋白浓度9（1）Ks盐析：固定pH,温度，改 变盐浓度（2）盐析：固定离子强度，改 变pH 及温度。10 阴离子盐析效果：柠檬酸PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-SCN-阳离子盐析效果：NH4+K+Na+高价阳离子 硫酸铵：（1）价廉；（2）溶解度大，稳定蛋白质；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。11121314 几种几种盐盐在不同温度下的溶解度（克在不

4、同温度下的溶解度（克/100/100毫升水）毫升水）0020208080100 100（NH4NH4）2SO42SO470.670.675.475.495.395.3103103Na2SO4Na2SO44.94.918.918.943.343.342.242.2NaH2PO4NaH2PO41.61.67.87.893.893.8101 101 1516硫酸铵的最终浓度（飽和）硫酸铵的初始浓度（）102025303335404550556065707580901001L中应加硫酸铵的量 g056114144176196209243277313351390430472516561662767105

5、786118137150183216251288326365406449494592694202959789112315518922526230034038242452061925304961931251581932302673073483904855833019306294127162198235273314356449546331243741071421772142522923334265223531639412916420023827831941150640316397132168205245285375469453265991341712102503394315033661011371

6、762143023921718192021机理：（1）破坏水化膜，（2）中和电荷盐析经验式 盐溶 盐析 饱和度 中性盐的盐析效果2223242526272829（1）适用于疏水性强的蛋白（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏 酸方向移动，溶解度增大（4）价廉价，无毒（5）蛋白对低pH 敏感，易失活30 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用 操作时的注意事项：（1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低（2）溶质的稳定性（3）盐析效应31 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水

7、的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理：降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。323334淀法优点3536 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；下降）；溶剂的选择溶剂的选择：和水互溶，与蛋白质不反应。乙醇，和水互溶，与蛋白质不反应。乙醇，蛋白质分子量蛋白质分子量：分子量越大，溶剂量就越少分子量越大，溶剂量就越少 一种蛋白质的溶解度会由于另一种的存在而降低一种蛋白质的溶解度

8、会由于另一种的存在而降低 沉淀的蛋白质若不能再溶解，就可能已经变性沉淀的蛋白质若不能再溶解，就可能已经变性 接近等电点，沉淀所需溶剂量减少接近等电点，沉淀所需溶剂量减少 溶液溶液pHpH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（止共沉现象。（pIpI）离子强度离子强度:离子强度低有利于沉析，离子强度低有利于沉析，0.010.05mol/L0.010.05mol/L 样品浓度样品浓度:0.52%:0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低浓：节省溶

9、剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：金属离子的助沉析作用：ZnZn2+2+、CaCa2+2+37优点：a 室温 b 颗粒大，易于收集 c 提高蛋白质的稳定性 d PEG 难去除机理：PEG 分子从溶剂排斥蛋白质，优先水合。38机理：静电与架桥聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚乙烯亚胺聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4,95%蛋白沉淀）3940Ca2+Zn2+Mg2+4142 硫酸铵的选用 1)它在低浓度时可能有盐溶作用，促进沉淀蛋 白溶解；2)因为本身有NH4+，与Zn 2+有络合作用，有利 于沉淀物溶解；3)硫酸铵为盐析所用，在最终盐析中，只需补 加规定量即可，而不引人其他成分。431 理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶，盐析2 沉淀与结晶有何不同？3 有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？用乙醇 沉淀蛋白质时应注意哪些事项？44