（抗生素教学课件）抗生素类药物的分析(184p).ppt

1、第十一章第十一章1第一节第一节 概述概述抗生素的定义抗生素的定义antibiotics 抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。制或杀灭作用。抗生素的来源抗生素的来源1.1.生物合成（发酵）生物合成（发酵）2.2.化学合成或半合成化学合成或半合成2q特点：特点：化学纯度较低化学纯度较低,同系物多，异构体同系物多，异构体多，降解物多；多，降解物多；活性组分易发生变异活性组分易发生变异；稳稳定性差定性差。q鉴别方法：生物学法，理化方法鉴别方法：生物学法，理化方法q特殊检查项目：异常

2、毒性、热源或细菌内特殊检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌，组分分析毒素、降压物质、无菌，组分分析 ，聚合，聚合物等。物等。3抗生素质量的复杂性抗生素质量的复杂性 产品稳定性差产品稳定性差分子结构大多不稳定，降解分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒后疗效下降、失效或增加毒副作用副作用发酵过程不易控制易受污染发酵过程不易控制易受污染生产工艺复杂生产工艺复杂发酵液中杂质发酵液中杂质 无机盐、脂肪、各种蛋白质、无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、各种降解产物、色素、热原、毒性物质毒性物质 4测定方法：测定方法：稀释法，比浊法，管蝶琼脂法扩散法。稀释法，比浊

3、法，管蝶琼脂法扩散法。比浊法和管蝶琼脂法扩散法为比浊法和管蝶琼脂法扩散法为国际通用法国际通用法。中国药典中国药典采用管蝶琼脂法扩散法。采用管蝶琼脂法扩散法。5678分类分类（按结构与性质）：（按结构与性质）：内酰胺类、氨基糖苷类、内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类林可霉素类、其他抗生素类9NSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）第二节第二节 内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素 青霉素类青霉素类一、化学结构与性质一、化学结构与性质*6-APA10头孢菌素类头孢

4、菌素类7654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCO*7-ACA117654321NONHSCH2R1COOH母核（7-氨基头孢菌烷酸）RCONSCH3CH3COOHOHN1234567RCO母核（6-氨基青霉烷酸）*头孢菌素类头孢菌素类青霉素类青霉素类12CONSOHNCOOHCH3CH3CH2青霉素青霉素（青霉素（青霉素G、苄青霉素）苄青霉素）13NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH2氨苄西林氨苄西林（氨苄青霉素）（氨苄青霉素）14阿莫西林阿莫西林（羟氨苄青霉素）（羟氨苄青霉素）NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH215C2H52NCH2CH

5、2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH2普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素16头孢氨苄头孢氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH217头孢拉定头孢拉定CH2NH2CONONHSCH3COOH18头孢羟氨苄头孢羟氨苄NONHSCH3COOHOCNH2CH2HO19头孢噻吩钠头孢噻吩钠SCH2CONONHSCH2OCOCH3COONa20NSOHNCOOKCH3CH3OCCH2酸性酸性结构与性质结构与性质一、一、NaNa与碱金属与碱金属(Na+、K+)成盐成盐 （一）羧基（一）羧基 易溶于水易溶于水 21与有机碱与有机碱(普鲁卡因普鲁卡因)成盐成盐 难溶于水难溶于水普鲁卡因普鲁卡因青霉

6、素青霉素C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCCH2NH222NSO1234567（二）手性（二）手性C 87654321NOS(5%头孢唑啉钠溶液头孢唑啉钠溶液 1824)20D 头孢菌素类头孢菌素类 C6 C7青霉素类青霉素类 C3 C5 C6 旋光性旋光性 23 （三）共轭体系三）共轭体系 NSO头孢菌素类头孢菌素类 母核有共轭体系母核有共轭体系 青霉素类青霉素类 母核无明显母核无明显UV 多数有苯环取代基多数有苯环取代基 NOS UV24青霉素钠青霉素钠UV7-202526（四）四）内酰胺环内酰胺环 水溶液水溶液 不稳定不稳定 干燥纯净干燥纯净 稳定稳定 不稳

7、定不稳定性因素性因素四元环张力大四元环张力大 酰胺键易水解酰胺键易水解 27（某些金属离子）（某些金属离子）（温度）（温度）失失效效降降解解青青霉霉素素类类酸酸、碱碱、青青霉霉素素酶酶某些氧化剂某些氧化剂28例例青霉素的降解反应青霉素的降解反应青青霉霉素素青霉噻唑酸青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉素酶青霉酸青霉酸H2OpH2100青霉噻唑青霉噻唑酰基羟胺酸酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸青霉烯酸pH4青霉胺青霉胺CO2青霉醛青霉醛HgCl229失效失效降解降解头孢菌素类头孢菌素类酸、碱、胺类酸、碱、胺类内酰胺酶内酰胺酶 30二、二、K+、Na+反应反应（一）（一）鉴别鉴别 焰色焰色鲜黄色鲜黄色

8、+醋酸氧铀锌醋酸氧铀锌黄黄 Na+焰色焰色紫色紫色 +0.1%四苯硼钠四苯硼钠+Ac白白 K+31（二）呈色反应（二）呈色反应1.羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应-内酰胺类内酰胺类NaOH HClNOHH内内酰酰胺胺类类呈色呈色羟肟酸衍生物羟肟酸衍生物Fe3+/3H+32NSCOHNHOHNSCHNHOFe3+3OH+Fe3+/3（红、棕、褐）（红、棕、褐）332、与与H2SO4-HNO3反应反应亮黄亮黄红棕红棕黄色黄色头孢噻肟钠头孢噻肟钠头孢噻吩钠头孢噻吩钠头孢氨苄头孢氨苄 HNOSOH头孢菌素类头孢菌素类34NH2CONSOHNCOOHCH3CH3CH23.茚三酮茚三酮反应反应蓝蓝紫紫色色氨氨基基

9、茚茚三三酮酮 -氨基氨基35-氨基、伯胺氨基、伯胺某些羟基胺类某些羟基胺类酮式酮式烯醇式烯醇式茚三酮茚三酮茚三酮茚三酮缩合缩合蓝紫色蓝紫色+H2OCNCH2RC OH2RCHH2NCOOH2OHCCOCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCO364.双缩脲反应双缩脲反应-内酰胺类内酰胺类 CONH紫紫内酰胺类内酰胺类碱性酒石酸铜碱性酒石酸铜 （开环分解）（开环分解）372OHCONH2CuCOHNCCH3COONaCH3SNHNCH3CH3COONaCSNOHOHOOCH2NH2CH2HH蓝紫色蓝紫色385.与变色酸与变色酸-硫酸反应硫酸反应活泼活泼“-

10、CH2-”青霉素青霉素阿莫西林阿莫西林氨苄西林氨苄西林HCHOCHSOH ”羰基侧链含“羰基侧链含“（分解）（分解）变色酸变色酸显色显色39NH2CONSOHNCOOHCH3CH3HOCH2 变色酸变色酸阿莫西林阿莫西林HCHOSOH150（缩合）（缩合）色色褐褐40SO3HSO3HHOHOSO3HSO3HHOHOOHOHHO3SHO3SCHHCHO（缩合）（缩合）416.与重氮苯磺酸反应与重氮苯磺酸反应橙橙黄黄色色重重氮氮苯苯磺磺酸酸 OHHC（偶合）（偶合）酚羟基酚羟基头孢哌酮头孢哌酮42SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNNCH3 OH（偶合）（偶合）43

11、NNNNCH3SNOHCONHCHCONHH5C2OONNOCOOHCH2SNNNaO3S447.与铜盐反应与铜盐反应 CuSOHAc头孢氨苄头孢氨苄橄榄绿色橄榄绿色NaOH专属反应专属反应45（三）沉淀反应（三）沉淀反应1.遇酸遇酸白白青青霉霉素素青青霉霉素素钠钠青青霉霉素素钾钾 H462.有机胺盐反应有机胺盐反应（1）重氮化）重氮化-偶合反应偶合反应 青霉素青霉素普鲁卡因普鲁卡因普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素 H重氮化重氮化-偶合反应偶合反应红红 芳伯氨基芳伯氨基47C2H52NCH2CH2OOCNSOHNCOOHCH3CH3OCH+C2H52CH2NH2H2NCOOCH2CH2N普鲁卡因普

12、鲁卡因普鲁卡因青霉素普鲁卡因青霉素48NCH2CH2OOC2C2H5N+Cl-N2C2H5COOCH2CH2NNH2HClNaNO2 49（2）与三硝基苯酚反应）与三硝基苯酚反应 三硝基苯酚三硝基苯酚二苄基乙二胺二苄基乙二胺苄星青霉素苄星青霉素NaOH二苄基乙二胺二苄基乙二胺50三硝基苯酚三硝基苯酚H2OHOH-HCONSOHNCOOHCH3CH3CH2CH2NCH2CH2NHCH2OHNO2O2NNO2CH2NCH2CH2NHCH251光谱法光谱法（四）（四）1、UV法法A,Emin,max,%1cm1 光光谱谱图图样品、分解产物样品、分解产物nm339HA 苯苯唑唑青青霉霉烯烯酸酸苯苯唑唑

13、青青霉霉素素Cu2+头孢氨苄头孢氨苄 max=262nm青霉素青霉素V钠钠 A280nm/A264nm=1.301.5052NOCONHCH3NOSCH3CH3COONaNOCHCH3OCOCNHNCHHCCH3CH3SHCHCOOHCu2+pH3.85354氯唑青霉素氯唑青霉素 341 0.682双氯青霉素双氯青霉素 342 0.653苯唑青霉素苯唑青霉素 339 1.328max%1cm1E(nm)ml/g50 552、IR法法117401815 cmVOC116901710 cmVOC-内酰胺环内酰胺环酰胺酰胺56色谱法色谱法（五）（五）1、TLC法法对照品对照法对照品对照法和斑点颜色和

14、斑点颜色比较比较供试品供试品对照品对照品相同条件相同条件fR2、HPLC法法Rt比较比较供试品供试品对照品对照品相同条件相同条件57三、三、特殊杂质检查特殊杂质检查特殊杂质主要有：高分子聚合物，有关物特殊杂质主要有：高分子聚合物，有关物质，异构体质，异构体控制方法：控制方法：HPLC法，吸收度法，吸收度有关物质和异构体有关物质和异构体:ODS柱柱58n聚合物HPLC法n色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝胶用葡聚糖凝胶G-10G-10（4040120120 mm）为填充剂，玻璃柱内径为填充剂，玻璃柱内径1.31.31.5cm1.5cm，床体积床体积505060mL60m

15、L；流动相流动相A A为含为含3.5%3.5%硫硫酸铵的酸铵的0.01mol/L0.01mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g2.19g和磷酸二氢钠和磷酸二氢钠0.54g0.54g，加水加水1000mL1000mL使溶解，使溶解，调节调节pHpH值至值至7.07.0），），流动相流动相B B为为0.01%0.01%十二烷基硫十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟酸钠溶液；流速为每分钟1mL1mL；检测波长为检测波长为254nm254nm。以流动相以流动相A A为流动相，用为流动相，用1mg/mL1mg/mL蓝色葡蓝色葡聚糖聚糖20002000溶液进样溶液进样2002

16、00 L L进行测定，理论板数应进行测定，理论板数应不低于不低于900900，拖尾因子在，拖尾因子在0.750.751.51.5，对照品溶液对照品溶液以流动相以流动相B B为流动相为流动相，重复进样，重复进样200200 L L，峰面积值峰面积值的的相对标准差应小于相对标准差应小于5.0%5.0%。59n对照品溶液对照品溶液的制备的制备 取头孢他啶对照品适取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶量，精密称定，加水制成含头孢他啶100100 g/1mLg/1mL的溶液，摇匀。的溶液，摇匀。n测定法测定法 取取本品本品适量，精密称定，加水制适量，精密称定，加水制成含头孢他啶成含头孢他啶2

17、0mg/1mL20mg/1mL的溶液，立即进的溶液，立即进样样200200 L L，以以流动相流动相A A为流动相进行测定，为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液记录色谱图；另取对照品溶液200200 L L注入注入液相色谱仪，以液相色谱仪，以流动相流动相B B为流动相，记录为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过聚合物以头孢他啶计不得过0.3%0.3%。60n自身对照外标法自身对照外标法的原理：的原理：n该法是利用特定条件下该法是利用特定条件下-内酰胺类抗生素可内酰胺类抗生素可以以缔合成缔合成与高分子杂质有相似色谱行

18、为的与高分子杂质有相似色谱行为的缔缔合物合物，即在，即在K Kavav=0=0处表现为单一的色谱峰。处表现为单一的色谱峰。n以药物自身为对照品，测定其在特定条件下以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标；缔合时的峰响应指标；n然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色谱图中谱图中K Kavav=0=0处的高分子杂质峰的响应指标，处的高分子杂质峰的响应指标，n按外标法计算，即得样品中高分子杂质相当按外标法计算，即得样品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。于药品本身的相对含量。61n有关物质和异构体 n例例1 1 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检

19、查：头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查：色谱条件与系统适用性试验：要求色谱条件与系统适用性试验：要求头孢呋辛酯头孢呋辛酯A A，B B异构体之间、头孢呋辛酯异构体之间、头孢呋辛酯A A异构体与头孢呋辛酯异构体与头孢呋辛酯2 2-异构体异构体之间的分离度之间的分离度R R1.51.5；理论板数按头孢理论板数按头孢呋辛酯呋辛酯A A异构体峰计算，异构体峰计算，n1500n1500。异构体异构体照含量测定项下方法试验。以照含量测定项下方法试验。以A A异构体异构体峰的相对峰的相对tRtR为为1.01.0，B B异构体峰的相对异构体峰的相对tRtR约为约为0.850.85，供试品色谱图中供试品色谱图中

20、A A异构体峰的面积与异构体峰的面积与A A、B B异构体峰异构体峰的面积和之比应为的面积和之比应为0.480.480.550.55。有关物质有关物质按自身对照法测定有关物质限量按自身对照法测定有关物质限量62n2 2-异构体异构体是取头孢呋辛酯对照品经是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏加热破坏处处理而制得的，其相对理而制得的，其相对tRtR约为约为1.2 1.2。63n吸收度n如青霉素钠（钾）的吸收度检查：如青霉素钠（钾）的吸收度检查：n取本品，加水制成每取本品，加水制成每1mL1mL中含中含1.80mg1.80mg的溶的溶液，照分光光度法，在液，照分光光度法，在280nm280nm的波长处测的

21、波长处测定吸收度，不得大于定吸收度，不得大于0.100.10；在；在264nm264nm的波的波长处有最大吸收，吸收度应为长处有最大吸收，吸收度应为0.800.800.880.88。n此法中此法中264nm 264nm 处吸收值用来控制青霉素钠处吸收值用来控制青霉素钠（钾）的含量，（钾）的含量，280nm280nm处吸收值用来控制处吸收值用来控制杂质的量。杂质的量。n头孢氨苄中有关物质的检查头孢氨苄中有关物质的检查反相反相TLCTLC法法 （自学自学）64四、四、含量测定含量测定碘量法碘量法汞量法汞量法可见可见-紫外分光光度法紫外分光光度法HPLC电位络合滴定法电位络合滴定法65 IINaOH

22、头孢菌素族头孢菌素族青霉素族青霉素族（水解）（水解）H碘量法碘量法（一）（一）1.原理原理水解产物水解产物 OSNaNaIOSNaI定量过量定量过量剩余剩余-内酰胺类内酰胺类ChP66反应分两步进行：反应分两步进行：1.水解反应水解反应 (按化学计算量进行按化学计算量进行)2.氧化氧化-还原反应还原反应 (无固定的量关无固定的量关系，受温度、系，受温度、PH值和时间等因素值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定用标准品平行对照测定)67NSCH3CH3COOHOHNRCORCOHHNCOONaCH3CH3SNCOONaCCH3CH3SO3HCH

23、NH2COOHCHNHCORCOOH2+第一步第一步第二步第二步68例例注射用普鲁卡因青霉素注射用普鲁卡因青霉素 含量测定含量测定 取装量差异项下的内容物，精密称取约取装量差异项下的内容物，精密称取约0.12g，置，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液1ml放置放置20分钟，再加分钟，再加1mol/L盐酸溶液盐酸溶液1ml与醋酸与醋酸-醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在密

24、塞，摇匀，在2025暗暗处放置处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，滴定，69至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸分钟，用硫代硫酸钠滴定液（钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同滴定，作为空白。同时用青霉

25、素钠对照品同法测定作对照，算出供时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。试品的含量。70V样空样空V样样对照液对照液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴 V对空对空V对对2.方法方法供试液供试液+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴+碱碱+酸酸+缓冲液缓冲液+碘液碘液+回滴回滴71 空白试验空白试验A、消除样品已降解产物的干扰消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂消除样品中其他消耗碘的杂 质的干扰质的干扰C、消除碘挥发造成的误差消除碘挥发造成的误差 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定72空白空白样品样品I2Na

26、2S2O3I-I273 采用标准品平行对照测定采用标准品平行对照测定A、可消除温度、可消除温度、pH、操作、环操作、环 境等条件的影响境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定使本法测定结果与微生物检定 法一致法一致743.条件条件（1）弱酸性）弱酸性 pH4.5碱碱 I2 IO3-+I-酸酸 普鲁卡因与碘在酸性条件普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀下会产生复盐沉淀（2）温度）温度 2426温度温度38 未水解的供试品亦消耗碘未水解的供试品亦消耗碘75（3）水解时间）水解时间以水解以水解20分钟后的分钟后的耗碘量最大耗碘量最大（4）反应时间）反应时间反应反应20分钟后，分钟后，耗碘量随

27、时间的耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误变化较小，可减小含量测定的误差。差。76774.特点特点（1）灵敏度高）灵敏度高样品样品:碘碘 =1:8（2）反应条件、实验操作要求高）反应条件、实验操作要求高V对对、V对空对空V样样、V样空样空1份含量份含量加试剂次序、反应时间、滴定速度相同加试剂次序、反应时间、滴定速度相同4I28I-785.计算计算 原料原料%WWVVVV对对照照品品）（）（含含量量样样对对对对对对空空样样样样空空 79汞量法汞量法（二）（二）1.原理原理SHROH 青霉素族青霉素族（水解）（水解）HgRS）（青霉素族青霉素族ChP Hg .pH电位络合滴定法电位络合滴定法

28、802.方法方法 总总样样VNOHgHNONaOH 醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液pH4.6滴定滴定水解水解 降降空空醋醋酸酸盐盐缓缓冲冲液液VNOHg pH4.6滴定滴定样样品品 以未经水解的样品作空白测定以未经水解的样品作空白测定81例例青霉素钠青霉素钠 含量测定含量测定 取本品约取本品约50mg，精密称定，加水精密称定，加水5ml溶解后，加溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置摇匀，放置15分钟，加分钟，加1mol/L硝酸溶硝酸溶液液5ml，醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水及水20ml，摇匀，照电位滴定法摇匀，照电位滴定法(附录附录 A),用铂电极为

29、指示电极，汞用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极硫酸亚汞电极为参比电极，在为参比电极，在3540，用硝酸汞滴，用硝酸汞滴定液定液(0.02mol/L)缓慢滴定，缓慢滴定，82（控制滴定过程约为（控制滴定过程约为15分钟），不计第分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于相当于7.128mg的总青霉素的总青霉素(按按C16H17N2NaO4S计算计算)。另取本品约另取本品约0.5g，精密称定，加水精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完振摇

30、使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上滴定，终点判断方法同上.83每每1ml硝酸汞滴定液（硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当相当于于7.128mg的降解物（按的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。计算）。总青霉素的百分含量与降解物的百总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。分含量之差值即为青霉素的含量。843、讨论讨论（1）以第二次滴定突跃为终点以第二次滴定突跃为终点 电位法指示终点电位法指示终点 （2）反应摩尔比反应摩尔比 1:1（3）空白试验空白试验 消除已降解产物干扰消除已降

31、解产物干扰（4）优点优点 不需标准品不需标准品85%WFTV%WFTV%空空空空样样样样含量含量4、计算计算%FTWVWV%）（含量含量空空空空样样样样86 精密称取含水量为精密称取含水量为0.5%的青霉素的青霉素钠钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含按药典方法测定总青霉素含量时，用去硝酸汞滴定液量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密称取上述样品另精密称取上述样品0.5013g，按药典方法测定降解物含量时，用去硝按药典方法测定降解物含量时，用去硝酸汞滴定液酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干以干燥品计算，求样品中青霉素的含量。燥品计算，

32、求样品中青霉素的含量。例例青霉素钠青霉素钠 含量测定含量测定 .T87%.%.88（三）（三）1、原理原理青霉噻唑酸青霉噻唑酸青霉素类青霉素类NaOH（钠盐）（钠盐）OHNaClHClNaOH （剩剩余余）-内酰胺类内酰胺类ChP89NSCH3CH3COONaOHNRCONSCH3CH3COONaCHNONaORCO 定量过量定量过量NaOH902、方法方法 供供试试液液内内酰酰胺胺类类OHNaOH定定量量过过量量 HCl回滴回滴中和中和中和中和91例例苯唑西林钠苯唑西林钠 含量测定含量测定 取本品约取本品约0.5g，精密称定，加新沸过的并精密称定，加新沸过的并用用0.01mol/L氢氧化钠溶

33、液中和至酚酞指示液氢氧化钠溶液中和至酚酞指示液刚显红色的水刚显红色的水20ml，使溶解使溶解,再用再用0.01mol/L氢氢氧化钠溶液中和后，精密加氢氧化钠滴定液氧化钠溶液中和后，精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)25ml，摇匀，置水浴中加热摇匀，置水浴中加热20分钟分钟，注意避免吸收空气中的二氧化碳，冷却后，注意避免吸收空气中的二氧化碳，冷却后，加酚酞指示液，加酚酞指示液12滴，用盐酸滴定液滴，用盐酸滴定液92（0.1mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于相当于40.14mgC

34、19H19N3O5S。%WFTVV%样样空空含量含量933、讨论讨论（1）水解前先中和溶剂和样品水解前先中和溶剂和样品（2）加热时避免吸收加热时避免吸收CO2 CONaNaOHCO不能使酚酞变红不能使酚酞变红（3）空白试验校正空白试验校正(消除消除Na2CO3干扰干扰)（4）特点特点 简便快速简便快速 不适用于有残留酯的产品不适用于有残留酯的产品94%.%.799100101009009863001301080136421 95nmCupHA 青霉烯酸青霉烯酸青霉素族青霉素族（水解）（水解）可见可见-紫外分光光度法紫外分光光度法（四）（四）1、酸水解法（铜盐法）酸水解法（铜盐法）（1）原理）原

35、理稳定剂稳定剂JP青霉素族青霉素族96CH2COCONHHCCH3CH3CCOOHCCNHSHCONSOHNCOOHCH3CH3CH2 pHACu 97（2）方法）方法标标样样枸橼酸枸橼酸硫酸铜硫酸铜标准液标准液供试液供试液AAnmA 320（3）特点）特点实验条件随各药物稳定性不同而定实验条件随各药物稳定性不同而定标准品对照法标准品对照法98%WWAA标标准准品品含含量量样样标标标标样样 （4 4）计算）计算992、硫醇汞盐法硫醇汞盐法（1）原理）原理青青霉霉烯烯酸酸硫硫醇醇汞汞盐盐青青霉霉素素族族 HgCl（咪唑）（咪唑）nmmax 青霉素族青霉素族ChP100HgClCH3CH3COON

36、aSNHCONCH2NHCOCH3NSOHNCOONaCH3CH3OCCH2NHCOCH3 HgCl咪唑咪唑nmmax 101（2）方法）方法对照品法对照品法%WWAA%对照品对照品样样标标标标样样 计算计算标标样样咪唑咪唑硼酸缓冲液硼酸缓冲液标准液标准液供试液供试液AAHgCl 2pH 9102例例氨苄西林钠氨苄西林钠 含量测定含量测定 取本品约取本品约60mg 置置100ml量瓶中，加水溶量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置另置另一一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取精密量取5ml，置，置25m

37、l量瓶中，加硼酸缓冲液量瓶中，加硼酸缓冲液2.5ml与醋酐的乙腈溶液（与醋酐的乙腈溶液（150）0.25ml，放放置置5min后，加咪唑溶液至刻度，摇匀，置后，加咪唑溶液至刻度，摇匀，置60水浴中，加热水浴中，加热30min，取出冷却，取出冷却，103照分光光度法（附录照分光光度法（附录 A），在），在325nm的的波长处测定吸收度；另取氨苄西林三水合物波长处测定吸收度；另取氨苄西林三水合物标准品，按同法测定，计算，即得。标准品，按同法测定，计算，即得。104（3）讨论）讨论a.咪唑催化的水解产率高，硫咪唑催化的水解产率高，硫 醇汞盐稳定（醇汞盐稳定（3h）b.侧链有侧链有-NH2时，需加醋酐

38、先时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述将其乙酰化后才能发生上述 反应反应105NSOHNCOOCH3CH3OCCH2NH2NaNSOHNCOONaCH3CH3OCCH2NHCOCH3 OCHCH pH9106（4）特点）特点A、简便快速简便快速B、用标准品对照，重现性良用标准品对照，重现性良 好，好，RSD1%1073、羟肟酸比色法羟肟酸比色法USP JPFe3+/3H+红色红色-内酰胺类内酰胺类NaOH HClNOHH内内酰酰胺胺类类羟肟酸衍生物羟肟酸衍生物108HPLC法法ChP 头孢菌素类头孢菌素类特点特点 快速、高效、灵敏快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好专属性强、重现性好 一法

39、多用（鉴别、检查、含测）一法多用（鉴别、检查、含测）这是这是-内酰胺类抗生素含量测定的主要方法。中内酰胺类抗生素含量测定的主要方法。中国药典收载的本类抗生素原料及制剂共约国药典收载的本类抗生素原料及制剂共约70种，种，应用应用HPLC法测定含量的有法测定含量的有50多种，约占多种，约占78%。本类药物的本类药物的HPLC法通常采用反相法通常采用反相HPLC，以外标，以外标法计算含量。法计算含量。109哌拉西宁哌拉西宁 原料药原料药 含量测定含量测定色谱条件色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇剂；以甲醇0.2mol/L磷酸二氢钠溶磷酸二氢钠溶液液10氢氧化

40、四乙基铵溶液氢氧化四乙基铵溶液水水（400503547）用磷酸调节）用磷酸调节pH值至值至5.5为流动相。检测波长为为流动相。检测波长为254nm。110第三节第三节 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素苷苷苷苷元元糖糖缩缩合合 氨氨基基糖糖苷苷苷苷元元氨氨基基糖糖缩缩合合 链霉素链霉素 双氢链霉素双氢链霉素新霉素新霉素 卡那霉素卡那霉素庆大霉素庆大霉素 巴龙霉素巴龙霉素111链霉素链霉素链霉胍链霉胍+链霉糖链霉糖+N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺 苷元苷元糖糖链霉双糖胺链霉双糖胺112NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉胍

41、链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺113NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3链霉胍链霉胍链霉糖链霉糖N-甲基甲基-L-葡萄糖胺葡萄糖胺114庆大霉素庆大霉素 糖糖 苷元苷元绛红糖胺绛红糖胺 +脱氧链霉胺脱氧链霉胺 +加洛糖胺加洛糖胺 糖糖 115ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺绛红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺116ROC R1R2HNNH2OOHH2NNH2OOOHNHCH3OHCH3绛红糖胺绛

42、红糖胺紫素胺紫素胺2-脱氧链霉胺脱氧链霉胺加洛糖胺加洛糖胺N-甲基甲基-3-去氧去氧-4-甲甲基戊糖胺基戊糖胺117庆大霉素庆大霉素C复合物复合物 庆大霉素庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素庆大霉素C2a R=CH3 R1=R2=H 庆大霉素庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3118ONH2OOCH2OHHOOHONH2NH2OOHOHNH2HOOOHR2CH2OHD-葡萄糖胺 脱氧链霉胺 D-核糖 巴龙霉糖 巴龙胺 巴龙二糖胺 *R1巴龙霉素119一、一、结构与性质结构与性质多

43、与硫酸成盐多与硫酸成盐链霉素链霉素 3个个庆大霉素庆大霉素 5个个碱性中心碱性中心碱性碱性（一）（一）水溶性水溶性溶解性溶解性（二）（二）120链霉素链霉素 pH57.5庆大霉素庆大霉素 pH212 稳定稳定UV（三）（三）稳定性稳定性（四）（四）链霉素水解产物反应链霉素水解产物反应（五）（五）链霉素在链霉素在230nm，庆大霉素等无紫外，庆大霉素等无紫外吸收吸收121NH CNHNH2HOOHOHNHCH2NNHOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHCH3坂口反应坂口反应N-甲基葡萄甲基葡萄糖胺反应糖胺反应麦芽酚反应麦芽酚反应122二、二、鉴别鉴别 茚三酮反应茚三酮反应（一）（一）蓝

44、紫色蓝紫色庆大霉素庆大霉素链霉素链霉素茚三酮茚三酮羟基胺结构羟基胺结构123N-甲基葡萄糖胺反应甲基葡萄糖胺反应（二）（二）甲甲基基葡葡萄萄糖糖胺胺庆庆大大霉霉素素链链霉霉素素水水解解 N乙酰丙酮乙酰丙酮OH-吡咯衍生物吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基苯甲醛H+红色红色（Elson-Morgan反应）反应）124NHCH3NHNHNH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNCH3COCH3HHOCH2CHOH3(缩合缩合)323COCHCOCHCH OH125HHH3CH3CCHNNCOCH3CH3COCH3CH3N红色红色对二甲氨基苯甲醛对二甲氨基

45、苯甲醛H+NCH3COCH3HHOCH2CHOH3126 麦芽酚反应麦芽酚反应（三）（三）链霉糖特有反应链霉糖特有反应链链霉霉糖糖链链霉霉素素 OH麦麦芽芽酚酚紫紫红红色色 3FeH+分子重排分子重排127NH C NH2HOOHOHNHCH2NOOCH3OHCHOOOCH2OHOHOHNHNHNHCH3H2O NaOHOOOHCH3OOCH3Fe3+H+OFe33+/紫红紫红麦芽酚麦芽酚128链霉胍特有反应链霉胍特有反应橙红橙红羟基喹啉羟基喹啉链霉胍链霉胍链霉素链霉素次溴酸钠次溴酸钠 8OH（或或-萘酚萘酚）8-8-羟基喹啉羟基喹啉坂口反应坂口反应（四）（四）-萘酚萘酚129ONBrRNHC

46、O NH130（四）（四）24SO反应反应白白 BaSOSOBaH+UV法法（五）（五）IR法法（六）（六）庆大霉素无庆大霉素无UV吸收吸收nmmax 链霉素链霉素TLC法法（七）（七）131三、三、检查检查链霉素杂质链霉素杂质（一）（一）链霉素链霉素B（甘露糖链霉素）甘露糖链霉素）2.方法方法 TLC中的对照品法中的对照品法3.（BP）1.来源来源 反应中间体反应中间体132n 2 2、硫酸奈替米星中有关物质的、硫酸奈替米星中有关物质的TLCTLC检查：检查：n供试品溶液：供试品溶液：150mg/mL150mg/mL；n标准品溶液（标准品溶液（1 1）1.5mg/mL1.5mg/mL；n标准

47、品溶液（标准品溶液（2 2）3mg/mL3mg/mL；n标准品溶液（标准品溶液（3 3）1.44mg1.44mg西索米星西索米星/mL/mL，n点样：各点样：各2 2 L L，n展开剂：二氯甲烷展开剂：二氯甲烷-甲醇甲醇-浓氨溶液（浓氨溶液（4 4：4 4：2 2）n显色：显色：0.2%0.2%茚三酮溶液，茚三酮溶液，110110加热加热20min20min。133n结果：供试品溶液如显杂质斑点，其颜色结果：供试品溶液如显杂质斑点，其颜色n与标准品溶液（与标准品溶液（3 3）所显主斑点相比较，不）所显主斑点相比较，不得更深（得更深（1%1%），），n其他杂质与标准品溶液（其他杂质与标准品溶液（

48、1 1）所显主斑点相）所显主斑点相比较，均不得更深（比较，均不得更深（1%1%），），n如有一点超过，应不深于标准品溶液（如有一点超过，应不深于标准品溶液（2 2）的主斑点（的主斑点（2 2%）。）。n注：奈替米星是由西索米星经化学衍生而成的注：奈替米星是由西索米星经化学衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能残留西索米星，需进行控制。残留西索米星，需进行控制。134对微生物的活性无明显差异对微生物的活性无明显差异毒副作用和耐药性不同毒副作用和耐药性不同发酵菌种不同发酵菌种不同工艺差别工艺差别C组分比例组分比例不一致不一致规定控制各组分的相对百

49、分含量规定控制各组分的相对百分含量ChPUSPBPJP庆大霉素庆大霉素C组分的测定组分的测定（二）（二）135 .pH吲吲哚哚衍衍生生物物巯巯基基醋醋酸酸邻邻苯苯二二醛醛氨氨基基max=330nm衍生化原理衍生化原理 1.1.1361-烷基硫代烷基硫代-2-烷基烷基异吲哚衍生物异吲哚衍生物RNH2+HSCH2COOHOH-CHOCHONRSCH2COOH137RPHPLC方法方法 2.规定规定 C1 2550%C1a 1540%C2a+C2 2050%计算计算 3.%AAAAA%ACCCCiiaa 峰面积归一化法峰面积归一化法138HHOORNH2+HSCH2COOHOH-NRSCH2COOH

50、139四、四、含量测定含量测定链霉素、庆大霉素链霉素、庆大霉素微生物检定法微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。，以测定供试品效价的一种方法。140五、血清中庆大霉素的五、血清中庆大霉素的HPLC法法n血浆样品的预处理血浆样品的预处理n离子对色谱法的目的：离子对色谱法的目的：除去氨基酸、肽、胺的干扰除去氨基酸、肽、胺的干扰n选用选用OPA为荧光衍生化试剂为荧光