优《血红蛋白的提取和分离》.ppt

1、1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性质的理或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类的蛋白质。类的蛋白质。一、血红蛋白的提取和分离一、血红蛋白的提取和分离3 3、提取分离方法、提取

2、分离方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法（一）（一）凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）2.2.凝胶：凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如葡聚糖或琼（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道。通道。根据被分离物质的根据被分离物质的蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量的大小，的大小，利用具有利用具有网状结构网状结构的凝胶，来进行的凝胶，来进行分离。分离。1.1.概念：概念：3.3.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对相对分子量

3、较小的蛋白质分子量较小的蛋白质容易容易进入凝胶内部的通道，进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢;相对分子量相对分子量较大较大的蛋白质的蛋白质无法进入凝胶内部的无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。度较快。依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强外加少量强酸或强碱酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶

4、液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响，值的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。2.2.作用作用:思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3 通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内使用的范围内使用的缓冲液。缓冲液。4.4.提问：在本课题中使用的缓冲液是提问：在本课题中使用的缓冲液是:_,:_

5、,利用缓冲液利用缓冲液模拟细胞内的模拟细胞内的PHPH环境环境，保证，保证 血红蛋白的正常结构和功能血红蛋白的正常结构和功能，便于观察，便于观察(红色红色)和科和科 学研究学研究(活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:其目的是其目的是:带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在有可解离的基团，在一定的一定的PHPH下，这些基团会带下，这些基团会带上正上正 电或负电。电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所在电场的作用下，这些带电

6、分子会向着与其所带电荷带电荷相反相反的电极移动。的电极移动。分离样品中各种分子分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。从而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。1 1、测定蛋白质分子量、测定蛋白质分子量:常用常用十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺和和交联剂交联剂N,N-

7、N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所带于它所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。2.2.原理：原理：SDSSDS能使能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链肽链，因此测定

8、的结果只是，因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有原有的电荷量的电荷量。因而。因而掩盖了不同种掩盖了不同种蛋白质间的蛋白质间的电荷差电荷差别，别，使使电泳迁移率完全取决于分子的大小电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS3.SDS作用机理作用机理:用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质的分子量时，可选用一组白质的分子量时，可选用一组已知分子量已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，可以测定，可以测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量、市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。售。