1、第 二 章细 胞 工 程细胞工程细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过细胞器、细胞或组织水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。原理和方法操作水平目的分类细胞生物学、分子生物学和发育生物学细胞器、细胞或组织获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品动物细胞工程和植物细胞工程哈伯兰特提出细胞全能性的理论，但相关实验尝试没有成功。斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体古哈等在培养毛曼陀罗的花药时，首次得到了由花药中的花粉
2、粒发育而来的胚。卡尔森诱导烟草种间原生质体融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。土壤农杆菌的Ti质粒被发现。之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术的紧密结合。植物细胞工程的发展历程1902年1958年1960年1964年1971年1974年利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方式，又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？从社会中来植物组织培养技术一、植物细胞工程的基本技术0 1 植物组织培养技术概念指离
3、体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工控制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其分化为完整植株的技术。理论基础植物细胞的全能性细胞经过分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。全能性 具有全能性的原因一般生物体的每一个细胞都包含有该物种的全套遗传信息。即都有发育成完整个体所必需的全部遗传信息。体现全能性的标志细胞 完整个体或其他各种细胞实例：胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株 受精卵发育成个体（动植物）蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰 用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株 生物体内细胞不体现全能性的原因基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。实例：芽原基的
4、细胞只能发育为芽，叶原基的细胞只能发育为叶；造血干细胞可分化形成多种血细胞；全能性大小比较分化程度低的分化程度高的。分裂能力强的分裂能力弱的受精卵生殖细胞体细胞受精卵干细胞体细胞植物细胞动物细胞全能性0 1 植物组织培养技术一般过程外植体愈伤组织试管苗完整植株脱分化芽、根等再分化生长 发育接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽诱导生根移栽成活一般过程外植体愈伤组织试管苗完整植株脱分化芽、根等再分化生长 发育脱分化在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化细胞，失去其特有结构和功能而转变成未分化的细胞的过程。光照条件：一般不需要光照涉及的生命活动：细胞增殖（有丝分裂）一般来说，植物的花和幼嫩的组织脱分化
5、相对较易，而植物的茎、叶等成熟的组织脱分化则较难。该过程添加的外源激素主要是细胞分裂素和生长素（比例适中），因为二者能强烈地促进愈伤组织的形成。结果：形成愈伤组织一般过程外植体愈伤组织试管苗完整植株脱分化芽、根等再分化生长 发育愈伤组织细胞排列疏松且无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞团。一般过程外植体愈伤组织试管苗完整植株脱分化芽、根等再分化生长 发育脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出芽或根等器官的过程。再分化实质：基因的选择性表达光照条件：需要给予适当强度的光照涉及的生命活动：既有细胞增殖（有丝分裂），又有细胞分化。培养基的成分和物理性质对器官的形成有一定的影响，但起
6、决定作用的是植物激素，特别是生长素和细胞分裂素的配比。生长素/细胞分裂素 比值1 有利于根的分化 比值1 有利于芽的分化菊花的组织培养探究实践外植体的消毒外植体的切段接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽、生根炼苗、移栽流水冲洗 酒精消毒30s 无菌水清洗23次 次氯酸钠溶液处理30min 无菌水清洗23次菊花的组织培养探究实践外植体的消毒外植体的切段接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽、生根炼苗、移栽将消过毒的外植体置于无菌培养皿中 用无菌滤纸吸去表面的水分 用解剖刀将外植体切成0.51cm长的小段菊花的组织培养探究实践外植体的消毒外植体的切段接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽、生根炼苗、移栽 在酒精灯火焰旁
7、，将外植体的1/31/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。接种外植体时，不要倒插！（将“形态学上端”朝上）菊花的组织培养探究实践外植体的消毒外植体的切段接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽、生根炼苗、移栽置于黑暗 将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于1822的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。菊花的组织培养探究实践外植体的消毒外植体的切段接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽、生根炼苗、移栽置于光照 培养1520天后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到
8、诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照菊花的组织培养探究实践外植体的消毒外植体的切段接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽、生根炼苗、移栽炼苗移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。移栽用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。观察每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培菊花的组织培养植物组织培养成功的条件组织离体状态适宜的培养条件植物激素（主要是生长素和细胞分裂素）诱导和调节植物组织培养成功的条件组织离体状态适宜的培养条件植物激
9、素（主要是生长素和细胞分裂素）诱导和调节种类齐全、比例适合的营养物质适宜的外界条件（温度、pH、光照等）无菌环境拓展：植物组织培养的两种途径胚状体途径器官发生途径接种外植体诱导愈伤组织诱导生芽诱导生根移栽成活胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但经过胚胎发育过程形成的胚状类似物，因而称为胚状体。0 2 植物体细胞杂交技术要培育出如图所示的番茄马铃薯利用传统有性杂交方法能实现吗？不能，因为不同种生物之间存在着生殖隔离。于是，这些科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。0 2 植物体细胞杂交技术概念将不同来源的植物细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植
10、物体的技术。细胞融合初期人细胞鼠细胞人鼠杂交细胞细胞融合细胞融合37培养40min红色荧光素标记的抗体绿色荧光素标记的抗体参考动物细胞融合，若是植物细胞之间的杂交，则应先做什么？去除细胞壁原生质体：包括细胞膜、细胞质和细胞核，是指去除细胞壁后的植物细胞0 2 植物体细胞杂交技术过程A细胞B细胞A原生质体B原生质体正在融合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞愈伤组织 杂种植株移栽后的植株去除细胞壁酶解法：纤维素酶和果胶酶0 2 植物体细胞杂交技术过程A细胞B细胞A原生质体B原生质体正在融合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞愈伤组织 杂种植株移栽后的植株诱导融合物理法化学法电融合法、离心法聚乙二醇（PEG）
11、融合法高Ca2+-高pH融合法等0 2 植物体细胞杂交技术过程A细胞B细胞A原生质体B原生质体正在融合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞愈伤组织 杂种植株移栽后的植株植物细胞融合完成的标志：再生出细胞壁（高尔基体与细胞壁的形成有关）植物体细胞杂交的结果产生杂种植物植物细胞融合植物组织培养植物体细胞杂交体细胞融合成功后，培养基中共有几种细胞类型？融合细胞有几种，符合要求的是哪种？体细胞融合成功后培养基中共有5种细胞类型其中融合细胞类型有3种。因此要对融合细胞进行筛选。意义打破生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育植物新品种。研究现状仍有许多理论与技术问题没有解决，还不能让杂种植株表现出人们所需要的所有性状 番茄马铃薯杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么?主要原因是生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以番茄马铃薯杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。概念植物细胞融合原生质体制备过程变异类型植物组织培养原生质体融合原理育种类型原理过程花药离体培养细胞全能性操作步骤脱分化再分化外植体根、芽、胚状体愈伤组织外植体消毒接种切块形成愈伤组织诱导生芽生根植物体细胞杂交植物组织培养植物细胞工程优缺点
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