3.2基因工程的基本操作程序ppt课件 -2023新人教版(2019）《高中生物》选择性必修第三册.pptx

1、新课程标准核心素养1.1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。阐明基因工程的原理和基本操作程序。2.2.针对人类生产或生活中的某一需求，针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。试设计获得某一转基因产品的方案。3.3.尝试进行尝试进行PCRPCR的基本操作并用电泳鉴的基本操作并用电泳鉴定定PCRPCR的产物。的产物。1.1.科学思维科学思维结合生产实例，结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作举例说出基因工程的基本操作程序。程序。2.2.科学探究科学探究针对人类生产针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出和生

2、活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初初步的基因工程构想，完成初步设计。步设计。第2节 基因工程的基本操作程序 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？从社会中来转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？与载体拼接与载体拼接 普通棉花（无抗虫特性）（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉（有抗虫特性）（有抗虫特性）导入导入抗虫基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2

3、.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的 检测与鉴定从社会中来目的基因的筛选与获取Screening and acquisition of target genes第一部分DNA基因1 基因2 基因3放大终止子非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子原核基因终止子编码区非编码区非编码区内含子 启动子编码区上游 编码区下游 真核基因1.基因的结构一.目的基因的筛选与获取原核 VS 真核基因的结构具有遗传效应的DNA片段 （1）非编码区组成：编码区上游+编码区下游功能：不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列 (如启动子、终止子）。（2）编码区：编码蛋白质的

4、合成1.基因的结构一.目的基因的筛选与获取原核 VS 真核基因的结构典型的原核细胞基因的结构示意图典型的真核细胞基因的结构示意图原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的连续不连续编码区非编码（连续的）（不连续）基因=非编码区+编码区RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录启动子本质：位置：作用：是一段特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；终止子本质：位置：作用：是一段特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录原核细胞基因的结构示意图真核细胞基因的结构示意图1.基因的结构一.目的基因的筛选与获取原核 VS 真核基因的结构启

5、动子 与 终止子VS起始密码子 与 终止密码子 密码子：mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基翻译起始与终止转录起始与终止定义：定义：在基因工程的设计和操作中，用在基因工程的设计和操作中，用于于改变受体细胞性状改变受体细胞性状的或的或获得预获得预期表达产物期表达产物的基因。的基因。目的基因受体细胞目的基因目的基因主要是指主要是指编码蛋白编码蛋白质质的基因的基因抗逆性基因抗逆性基因生产药物基因生产药物基因毒物降解基因毒物降解基因工业用酶基因工业用酶基因一.目的基因的筛选与获取1.目的基因转基因抗虫棉转基因抗虫棉目的基因目的基因 Bt Bt基因基因苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌产生产生Bt基因基因

6、伴胞晶体蛋白伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白抗虫蛋白)表达表达破坏鳞翅目昆破坏鳞翅目昆虫的消化系统虫的消化系统杀死棉铃虫杀死棉铃虫棉花细胞棉花细胞导入导入抗虫棉抗虫棉培育培育一.目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。基因海洋目的基因如何筛选相关的已经结构结构和功能和功能清晰

7、的基因筛选筛选方法之一一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因2 2、目的基因的筛选、目的基因的筛选一、目的基因的筛选与获取一、目的基因的筛选与获取（1）较为有效的方法之一从相关的已知结构已知结构和功能清晰功能清晰的基因中进行筛选。（2）辅助工具 随着测序测序技术技术的发展，以及序列序列数据库（数据库（GenBankGenBank）、）、序列比对序列比对工具（如工具（如BLASTBLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。苏云金杆菌制成杀杀虫虫剂剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉防治棉花害虫花害虫发现杀虫发现杀虫作用与作

8、用与Bt基因有关基因有关掌握掌握Bt基因的基因的序列序列深入了解深入了解Bt基基因的表达产物因的表达产物(Bt抗虫蛋白抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。实例：Bt基因的筛选一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因测序技术测序技术序列数据库序列数据库(如如GenBank)序列比对工具序列比对工具(如如BLAST)测定核酸核酸和蛋白质蛋白质序列以碱基顺序碱基顺序或氨基酸残氨基酸残基顺序基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相比对识别相关的序列关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质基因和蛋白质的功能。筛选目的基因的

9、技术手段一.目的基因的筛选与获取3.筛选合适目的基因方法：方法：3 3、目的基因的获取、目的基因的获取（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（3 3）利用）利用PCRPCR技术扩增（常用）技术扩增（常用）（2 2）人工合成）人工合成一、目的基因的筛选与获取一、目的基因的筛选与获取（1）从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（cDNA文库）（包含一种生物的一部分基因）三、目的基因获取方法1基因文库概念2基因文库类型提取某种生物的全部DNA

10、多个一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接，导入受体菌中储存用适当的限制酶切割基因组文库构建3基因组文库的构建某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录酶催化DNA聚合酶催化部分基因文库（如cDNA文库）构建 构建某生物体内全部DNA 许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）基因文库的构建过程 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）

11、基因多少 物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以内含子、启动子、终止子2101（2）人工合成在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是培育过程中，科学家采用的是人工合成人工合成的方法。的方法。DNADNA合成仪合成仪转基因抗虫棉转基因抗虫棉3 3、目的基因的获取、目的基因的获取在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成一、目的基因的筛选与获取一、目的基因的筛选与获取PCR技术：PCR是_ _的缩写，是一项根据_的原理，在_ _提供参与DNA复制的_ _与_ _

12、，对_ _进行_ _的技术；聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制全称全称聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因一.目的基因的筛选与获取（3）利用PCR获取和扩增目的基因原理原理操作环境操作环境目的目的优点：优点：复习：体内DNA复制1.条件：（1）DNA模板：亲代DNA分子的_条母链（2）原料：4种_（3）酶：_、_（4）能量：_2.原则：_(A-_;C-_)2脱氧核苷酸ATP解旋酶DNA聚合酶碱基互补配对原则TGDNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作

13、用 解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的DNA聚合酶）（体外用高温代替）（2种）引物是一小段能与_的一段碱基序列_的_DNA母链互补配对短单链核酸35DNA母链35DNA母链35引物35引物（3）利用PCR获取和扩增目的基因子链延伸子链延伸PCR的条件DNA（含目的基因）模板。分别与模板DNA相结合的两种引物。A、T、G、C四种脱氧核苷酸。耐高温的DNA聚合酶。稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。能严格控制温度的温控设备。一小段（20-30个）能与D

14、NA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。脱氧核苷三磷酸（dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）耐高温的Taq DNA聚合酶真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。检测方法完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物。35DNA母链135DNA母链235引物135引物235DNA母链135DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。引物结合在模板链的3端，引导子链从 5端3端方向复制。为什么需要引物？因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。01耐高温的

15、DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）55变性复性延伸温度上升到90以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。（3 3）P PCRCR反应过程反应过程第一轮循环的第一轮循环的产物产物作为第二轮反应的作为第二轮反应的模板模板，经过，经过变性、变性、复性和延伸复性和延伸三步产三步产生第二轮循环的产生第二轮循环的产物；物；第二轮循环的第二轮循环的产物产物作为第三作为第三轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性

16、、复性和延伸性和延伸三步三步产生第三轮的产生第三轮的产物；产物；第二轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物第三轮的产物完成以后，完成以后，常采用常采用琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳电泳来鉴来鉴定定PCRPCR的产的产物物PCR反应过程一.目的基因的筛选与获取PCR的结果由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。7.PCR产物的鉴定常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。【提醒】在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。脱氧核苷三磷酸（1）若开始只有一个D

17、NA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。（2）若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为 个。2nN02n一一.目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取PCR反应过程反应过程比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制DNA在高温下变性解旋全部解旋后在复制场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系模板模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料原料:均为四种脱氧核苷酸酶酶:均需DNA聚合酶引物引

18、物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3端合成子链用用PCR可以扩增可以扩增mRNA吗吗？mRNAmRNA不可以直接扩增，需要将它不可以直接扩增，需要将它逆转录逆转录成成cDNAcDNA再进行扩增。再进行扩增。1.1.逆转录酶逆转录酶以以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链链，形成，形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子；2.2.核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链，使之变成，使之变成单链单链DNADNA；3.3.以单链以单链DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶

19、的作用下合成另一条互补的的作用下合成另一条互补的DNADNA链，形成链，形成双链双链DNADNA分子分子，即，即cDNAcDNA(1)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()(2)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶()(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。()(4)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件。()解析解析：PCRPCR不需要解旋酶的参与。不需要解旋酶的参与。(5)PCR的每一个循环都包括变性复性延伸三个步骤，延伸后的产物又可以作为下一个循环的模板。()

20、【基础过关基础过关】3.（2021全国甲卷全国甲卷高考真题）高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：分析PCR扩增结果；从病人组织样本中提取DNA；利用PCR扩增DNA片段；采集病人组织样本。回答下列问题：（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_（用数字序号表示）。（2）操作中使用的酶是_。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、_三步，其中复性的结果是_。（3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核

21、苷酸序列进行大量复制的技术Taq酶(耐高温的DNA聚合酶）延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合当堂巩固当堂巩固基因表达载体的构建基因表达载体的构建Construction of gene expression vectorConstruction of gene expression vector第二部分第二部分培育转基因抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢苏云金芽孢杆菌杆菌抗虫基因抗虫基因普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)思考：思考：将生物的所有将生物的所有DNADNA直接导入受体细胞直接导入受体细胞不是更简便吗？如果不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样这么做，效果会怎样？这种方法这种方

22、法针对性差针对性差，完全靠运气，也无完全靠运气，也无法确定哪些基因导法确定哪些基因导入了受体细胞。入了受体细胞。基因表达载体是由基因表达载体是由哪些部分组成的呢？哪些部分组成的呢？1.1.构建构建基因表达载体的目的：基因表达载体的目的：2.2.基因表达载体的组成基因表达载体的组成思考：思考：要各个元件有什么作用？要各个元件有什么作用？二.基因表达载体的构建核心核心步骤步骤（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。目的基因：启动子：终止子：标记基因：控制特定性状或表达特定产物。位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始。

23、位于基因的末端，终止转录。检测目的基因是否导入受体细胞，筛选含有目的基因的受体细胞。复制原点：DNA聚合酶结合位点。基因表达载体的组成载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。启动子终止子起始密码子终止密码子【区分两组概念】位于基因上位于mRNA上翻译的起始点翻译的终点转录的起始点转录的终点本身不转录决定氨基酸不决定氨基酸用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了

24、一个重组DNA分子。过程1、单酶切（同一种酶）：（1）目的（结果）：产生相同的黏性末端，以便进行连接（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：目的基因载体连接物载体载体连接物目的基因目的基因连接物分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化拓展3：限制酶的选择拓展3：限制酶的选择2、双酶切如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？-G-CTTAA-A-TCTAG使用两种限制酶的优点：防止目的基因和载体的自身环化 还可以防止目的基因与载体的反向连接将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞Introduce the target gene into the recipient cel

25、l第三部分第三步：将目的基因导入受体细胞基因表达载体受体细胞导入转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。动物植物微生物三、将目的基因导入受体细胞导入导入植物细胞植物细胞导入导入动物细胞动物细胞导入导入微生物细胞微生物细胞导入受体细胞的方法受体细胞类型（常用）花粉管通道法农杆菌转化法（常用）显微注射法Ca2处理法（又称感受态细胞法）受精卵或体细胞受精卵原核细胞 感受态细胞感受态细胞(能吸收周围环境能吸收周围环境DNA分子的生理状态分子的生理状态)（一）导入植物细胞农杆菌转化法花粉管通道法(常用)导入方法1.花粉管通道法：我国科学家独创我国科学家独创受体细胞：受体细胞：

26、体细胞体细胞子房子房花粉花粉柱头柱头花粉管花粉管精子精子卵细胞卵细胞胚囊胚囊三、将目的基因导入受体细胞用微量注射器将含有目的基因的DNADNA溶液直接注入子房中子房注射子房注射花柱滴加花柱滴加在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNADNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。适用生物：开花植物适用生物：开花植物花粉管通道法的过程：花粉管通道法的过程：三、将目的基因导入受体细胞萌发的花粉管花柱子房胚囊卵细胞方法方法1花粉管通道法花粉管通道法柱头利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的活跃的DNA

27、复制复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。操作简单操作简单、技术成本低技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。三、将目的基因导入受体细胞农杆菌特点：农杆菌特点：a a.能在自然条件下侵染能在自然条件下侵染_和和_，而对大多数，而对大多数_没有侵染能力；没有侵染能力；双子叶植物双子叶植物裸子植物裸子植物单子叶植物单子叶植物b.b.农杆菌细胞内含有农杆菌细胞内含有_，当它侵染植物细胞后，能将，当它侵染植物细胞后，能将_上上的的_（_）转移转移到到被侵染的细胞，并且将其被侵染的细胞，并且将其_；TiTi质粒质粒TiTi质粒质粒T-DNAT-DNA可转移的可转移的DNAD

28、NA整合到该细胞的染色体整合到该细胞的染色体DNADNA上上 将目的基因插入将目的基因插入_中，通过农杆菌的中，通过农杆菌的_作用，就可以使目的基因作用，就可以使目的基因_利用农杆菌进行转化的思路：利用农杆菌进行转化的思路：TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA转化转化进入植物细胞进入植物细胞三、将目的基因导入受体细胞方法方法2农杆菌转化法农杆菌转化法（最常用）（最常用）Ti质粒T-DNA农杆菌农杆菌转化法的过程：农杆菌转化法的过程：T-DNAT-DNA目的基因目的基因构建表达载体构建表达载体含目的基因的含目的基因的重组重组TiTi质粒质粒转入农杆菌转入农杆菌含重组含重组TiTi质粒的质粒的

29、农杆菌农杆菌导入植物细胞导入植物细胞表现出新性状的植物表现出新性状的植物植物细胞植物细胞将目的基因插将目的基因插入染色体入染色体DNADNA中中植物组植物组织培养织培养三、将目的基因导入受体细胞两次拼接：第一次拼接是第一次拼接是第二次拼接第二次拼接(非人工操作非人工操作)指指两次导入：第一次导入是将第一次导入是将第二次导入第二次导入(非人工操作非人工操作)是是提醒提醒：农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入三、将目的基因导入受体细胞将目的基因拼接到将目的基因拼接到TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上；被插入目的基因的被插入目的基因的T-DNAT-DNA拼接

30、到受体细胞染色拼接到受体细胞染色体的体的DNADNA上。上。含目的基因的含目的基因的TiTi质粒重新导入农杆菌质粒重新导入农杆菌；指含目的基因的指含目的基因的T-DNAT-DNA导入受体细胞导入受体细胞。转化的具体方法：转化的具体方法：a.a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_，然后然后_，并，并_；与农杆菌共培养与农杆菌共培养筛选转化细胞筛选转化细胞再生成植株再生成植株b.b.可以将可以将_直直接浸没接浸没在在_中一段时间，然后中一段时间，然后培养培养植株并植株并获得获得_，再进行，再进行_、_等；等；花序花序含有农杆菌的溶液含有农杆菌的溶液种子种子筛选筛

31、选鉴定鉴定三、将目的基因导入受体细胞 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得成功。显微注射法显微注射法1.受体细胞：受精卵受精卵(因为受精卵容易表现出全能性因为受精卵容易表现出全能性)2.过程：构建基因表达载体构建基因表达载体并并提纯提纯利用利用显微注射显微注射将基因表达将基因表达载体注入动物的载体注入动物的受精卵受精卵中中早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植获得获得具有新性状的动物具有新性状的动物（二）导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞CaCa2+2+处理处理法法1.受体细胞：常用常用原核生物原核生物作为受体细胞，其中以作为受体细胞，其中以大肠杆菌大肠杆菌最

32、广泛。最广泛。2.原核生物的优点:繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。3.一般过程:CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌使细胞处于一种使细胞处于一种能吸收周围能吸收周围环境中环境中DNADNA分子的生理状态分子的生理状态将重组的将重组的基因表达载体导入基因表达载体导入其中其中（CaCa2+2+的作用：增加细胞壁的通透性）的作用：增加细胞壁的通透性）（感受态细胞）（感受态细胞）（三）导入微生物细胞Ca2+感受态细胞吸收三、将目的基因导入受体细胞实例：利用转基因大肠杆菌生产药物注意：注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质原核生物作为

33、受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工）生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。，需要在体外进行再加工。三、将目的基因导入受体细胞种类项目 植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法 农杆菌转化法；花粉管通道法显微注射法Ca2处理法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上导入植物细胞整合到受体细胞DNA中表达目的基因表达载体提纯取受精卵显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子【小结】三.将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定Detec

34、tion and identification of target genes第四部分四、目的基因的检测与鉴定检测是否插入了目的基因（DNA）检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：方法：DNA分子杂交、分子杂交、PCR技术技术方法：分子杂交、方法：分子杂交、PCR技术技术方法：抗原方法：抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术确定是否具有特性及抗性的程度（即个体是否具有相应性状或产物是否具有功能活性目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。四、目的基因的检测与鉴定分子水平的检测（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳

35、定地存在并遗传（2）基因探针：一段带一段带放射性标记的放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是可以是DNADNA，也可以是由之转录而来的，也可以是由之转录而来的RNARNA。1、检测是否插入了目的基因（3）核酸杂交：可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。四、目的基因的检测与鉴定1、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增DNA半保留复制原理：基本思路：制作基因探针，并用PCR扩增；提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同

36、一培养液；高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。方法2：DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：探针与受体中的探针与受体中的DNADNA分子杂交分子杂交出现杂交带：出现杂交带：不出现杂交带：不出现杂交带：已插入已插入未插入未插入四、目的基因的检测与鉴定2、检测目的基因是否转录出了mRNA方法：方法：PCRPCR扩增扩增或或分子杂交技术分子杂交技术基本思路：制作基因探针，并用PCR扩增；提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。探针与受体中的探针与受体中的mRNAmRNA杂交杂交出现杂交带：出现杂交带：不出现

37、杂交带：不出现杂交带：已转录已转录未转录未转录四、目的基因的检测与鉴定3、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：方法：抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术原理：抗原抗体的特异性结合苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交抗原转基因生物四、目的基因的检测与鉴定个体生物学水平的检测转转BtBt基因基因非转基因非转基因没有抗虫基没有抗虫基因的棉植株因的棉植株有抗虫基因有抗虫基因的棉植株的棉植株接种接种棉铃虫棉铃虫虫没有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目的基因表达目的基因表达类型检测内容方法个体生物学水平的鉴定个体是否具有相应性状或产物是否具有功能活性抗虫、抗病的接种实验产品

38、功能活性比较实例：如何鉴定转基因抗虫棉是否培育成功？个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常四.目的基因的检查与鉴定筛选和获取目的基因获取质粒、噬菌体等载体构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性基因工程的基本操作流程图筛选和获取目的基因1.利用PCR获取和扩增目的基因2.人工合成目的基因3.通过构建基因文库

39、获取目的基因第一步：目的基因的筛选与获取构建基因表达载体1.用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段2.用DNA连接酶连接第二步：基因表达载体的构建将含有目的基因的表达载体导入受体细胞1.导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法2.导入动物细胞：显微注射法3.导入原核细胞：用Ca2+处理受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性1.1.分子水平检测分子水平检测检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）检测目的基因是否转录（PCR等技术检测）检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）2.2.个体水平检测个体水平检测第四步：目的基因的检测与鉴定DNADNA片段

40、的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定第五部分探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理PCR利用了DNA的_原理，通过_来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_的仪器，一次PCR一般要经历_次循环；热变性调节温度自动调控温度30PCR扩增DNA片段还利用了_的原理；DNA半保留复制基因工程的基本操作程序（2）DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有_，在一定的_下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_的作用下，这些_会向着_的电极移动，这个过程就是_；可解离的基团pH电场带电分子电泳与它所带电荷相反PCR的产物一般通过_来鉴定

41、；在凝胶中DNA分子的迁移速率与_、_和_等有关（迁移速率与之呈负相关）凝胶中的DNA分子通过_，可以在波长为_的_下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象基因工程的基本操作程序2.材料用具PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）基因工程的基本操作程序10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5L20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1L20mol/L的引物2.5L2

42、0mol/L的引物2.5LH2O2833L1-5U/L的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）12U模板DNA（用量为1pg-1g）510L总体积50LPCR反应体系的配方4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等基因工程的基本操作程序3.方法步骤基因工程的基本操作程序PCR反应体系的配方反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液倍浓缩的扩增缓冲液5 L20 mmol/L的的4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸的等量混合液的等量混合液1 L20 mol/L的引物的引物2.5 L20 mol/L的引物的引物2.5

43、 LH2O2833 L15 U/L的的Taq DNA聚合酶聚合酶12 U模板模板DNA510 L总体积总体积50 L注：模板注：模板DNA的用量为的用量为1gp1g移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分（1）DNA片段的扩增3.方法步骤基因工程的基本操作程序循环程序循环程序变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性94，5min30次次94，30s55，30s72，1min最后最后1次次94，1min 55，30s72，1min离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应

44、速率）使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。反应：参照上表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。预变性：3.方法步骤基因工程的基本操作程序（2）DNA片段的电泳鉴定配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀制备凝胶A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽

45、内。3.方法步骤基因工程的基本操作程序加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相（2）DNA片段的电泳鉴定观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。注意:为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前

46、，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。在进行操作时，一定要戴好一次性手套。PCR扩增不能随意加大试剂用量。基因工程的基本操作程序3.方法步骤4.结果分析与评价(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。基因工程的基本操作程序【关键点拨】1未出现扩增条带的主要原因2出现非特异性扩增条带的主要原因（1）Taq DNA聚合酶失活；（2）引物出现质量问题；（3）Mg2浓度过低；（4）变性时的温度低，变性时间短。（1）模板DNA出现 ；（2）引物特异性不强或形成引物二聚体。（3）Mg2浓度 。（4）复性时的温度 等。污染过高过低