还原型谷胱甘肽课件.ppt

1、院系：任课老师：姓名：L/O/G/O还原型谷胱甘肽菌株的选育和发酵过程调控菌株的选育和发酵过程调控54还原型谷胱甘肽的应用及市场前景还原型谷胱甘肽的应用及市场前景312 还原型谷胱甘肽的性质与生理功能还原型谷胱甘肽的性质与生理功能 什么是还原型谷胱甘肽什么是还原型谷胱甘肽6 还原型谷胱甘肽的生产方法与工艺还原型谷胱甘肽的生产方法与工艺 总结与展望总结与展望主要内容1.走近谷胱甘肽.什么是谷胱甘肽？谷胱甘肽(glutathione)是一种含-酰胺键和巯基的生物活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，其中半胱氨酸上的巯基为其活性基团。存在于几乎身体的每一个细胞之中。并且广泛存在于动植物和微生物中

2、，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一。产谷胱甘肽的微生物 1921年Hopkins在酵母中首先发现谷胱甘肽。随后，谷胱甘肽的化学结构得到确定。日本等国家首先开始了发酵法生产谷胱甘肽，由于不断改进和提高发酵工艺，逐渐在日本国内实现了谷胱甘肽生产的工业化，并使得微生物发酵法成为目前最普遍使用的生产方法。自然界中能较多的在细胞内累积谷胱甘肽的微生物主要为酵母菌及革兰阴性菌。产谷胱甘肽的酵母菌主要有：产朊假丝酵母(Candida utilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。国内外利用细菌生产谷胱甘肽的

3、报道比较少，代表为：藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)，甲烷甲基单胞(Methylomonas methanolvorens)，奇异变形杆菌(Proteus mirabiliss)。谷胱甘肽的分类 谷胱甘肽具有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽（GSH），只有还原型谷胱甘肽才具有生理活性，而生物体内的氧化型谷胱甘肽需要还原后才能发挥其重要的生理功能。因此我们平常所指的谷胱甘肽一般为还原型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽分子结构还原型谷胱甘肽分子结构两种谷胱甘肽之间的关系，氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽2分子分子GSH脱

4、氢后以脱氢后以二硫键相连形成氧二硫键相连形成氧化型化型谷胱甘肽谷胱甘肽(GSSG)在在NADPH存在条件下，存在条件下，谷胱甘肽还原酶谷胱甘肽还原酶(GR)作用于作用于GSSG还原生还原生成成GSH，反应中，反应中NADPH来源于来源于葡萄糖磷酸戊糖途径；葡萄糖磷酸戊糖途径；2.还原型谷胱甘肽的性质与功能还原型谷胱甘肽理化性质与结构特征还原型谷胱甘肽理化性质与结构特征分子式：C10H17N3O6S 分子量：307.32348 熔点：为189193C，晶体呈无色透明细长粒状，等电点为5.93。结构特征：GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键形成，分子中有一特殊的 一肽键，即由谷氨酸的COOH与

5、半胱氨酸的一NH2 缩合成的肽键，它不同于蛋白质分子中的普通肽键。GSH为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固体较为稳定，而水溶液在空气中则易被氧化。GSH的生物合成途经及代谢调控 合成途径是在 谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化合成。L谷氨酸，L 半胱氨酸在 谷氨酰半胱氨酸合成酶（-glutamylcysteine synthetase，GSH）的作用下合成 谷氨酸半胱氨酸(-glutamylcysteine，一ECG)，然后在谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase，GSH)的作用下与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。两

6、步反应如下：两步反应如下：ATPATPL-Glu+L-Cys L-Glu-L-Cys +ADP +Pi （1）L-Glu-L-Cys +Gly L-Glu-L-Cys-Gly +ADP+Pi （2）影响生物体内GSH合成的重要因素包括GSH 与GSH的活性和ATP的供给。前者主要影响生物合成的效率，后者决定了生产成本。在GSH生物合成过程中直接添加ATP经济上不合适，因此在研究中需要引入有效的ATP合成系统，与GSH合成系统耦合，提高效率降低成本。GSH在体内的生物合成在GSH 的作用下进行，并且GSH 受到谷胱甘肽产物的反馈抑制，除此之外还受转录水平两个调节子Yap 1P和Skn7P控制。与

7、之相反，GSH保守不受调控。还原型谷胱甘肽的生理功能 GSH分子含有谷氨酰基和活性巯基，是GSH许多重要生理功能的结构基础。GSH在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其它红细胞蛋 白质的半胱氨酸残基处于还原状态。GSH还广泛存在于其它正常细胞中，有很强的亲和力，能与多种化学物质及其代谢物结合，清除体内氧自由基及其它自由基，具有保护肝细胞膜、促进肝酶活性抗氧化、解毒等作用，是人体细胞内的主要代谢调节物质。GSH还在蛋白质和DNA合成、物质运输，酶活性、新陈代谢及细胞保护等生物学功能中起着直接或间接的作用。它还是许多酶反应的辅基，可作为抗氧化剂保护生物分子蛋白的巯基，清除体内过多的自由基，

8、参与体内三羧酸循环及糖代谢，具有解毒、预防糖尿病、癌症及消除疲劳等作用。还原型谷胱甘肽的药理作用 还原型谷胱甘肽（GSH）激活多种酶【如巯基(-SH)酶等】，从而促进糖、脂肪及蛋白质代谢，并能影响细胞的代谢过程；它可通过巯基与体内的自由基结合，可以转化成容易代谢的酸类物质从而加速自由基的排泄，有助于减轻化疗、放疗的毒副作用，对化疗、放疗的疗效无明显影响，如保护肾小管免受顺铂损害的主要机制为肾小管细胞内含谷胱肽解毒时所需的r-谷酰氨转肽酶，而癌细胞却无此酶，故在不影响GSH的细胞毒效应同时保护了正常组织但器官。且对放射性肠炎治疗效果较明显；对于贫血、中毒或组织炎症造成的全身或局部低氧血症患者应用

9、，可减轻组织损伤，促进修复。通过转甲基及转丙氨基反应，GSH还能保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能，并促进胆酸代谢，有利于消化道吸收脂肪及脂溶性维生素（A、D、E、K）。3.还原型谷胱甘肽的应用及市场前景三食品中的应用食品中的应用一一临床医药中的应用临床医药中的应用四化妆品中的应用化妆品中的应用.二二在抗辐射上的应用在抗辐射上的应用 谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。GSHGSH的应用的应

10、用还原型谷胱甘肽在临床药物上的应用 目前，已人工研制开发出了谷胱甘肽药物，广泛应用于临床，除利用其巯基以螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素中毒外，还用在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等，作为治疗或辅助治疗的药物。近年来，西方科学家，尤其是日本学者发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病毒的功能。最新研究还表明，GSH能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽。还原型谷胱甘肽在抗辐射上的应用 辐射对生物体的危害较大，长期接受射线辐照，容易引起头昏乏力、记忆力减退，心悸失眠多梦，毛发脱落，皮肤干燥，骨关节酸痛

11、，晶状体混浊、肝脏肿大、齿龈出血、咳嗽等。还原型谷胱甘肽是一种内源性放射防护物质，含量高，其放射敏感性差；含量低，其放射敏感性强。原因是由于还原型谷胱甘肽本身是一种射线保护剂，它可使射线通过直接作用和间接作用在生物体内产生高活性的各种自由基，通过还原型谷胱甘肽作用后而淬灭。还原型谷胱甘肽在食品中的应用 GSH广泛应用于食品领域，如加入酸奶和婴儿食品起类似维生素C的稳定作用；防止水果罐头水果褐变；在面制品中起还原和强化氨基酸作用；缩短面包混揉时间；GSH在与谷氨酸钠、核酸系呈味物质或其混合物共存时具有肉类风味；GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品的核酸分解，延长保鲜期以及提高奶酪质量，防止酪蛋白

12、褐变。还原型谷胱甘肽在化妆品中应用 绝大多数化妆品中含有铅，在使用过程会刺激皮肤以及沉着在皮肤上引起黑斑；当机体衰老时，体内各式各样自由基生成增多，自由基作为人体垃圾，是人体内重要的内毒素之一。由于GSH能够清除自由基、能够螯合重金属等内外毒素，防止皮肤色素沉着，防止新的黑色素形成并减少其氧化，因而GSH适用于延缓衰老而具有佳效。另外GSH的化学本质是小分子肽，因此它外用是容易透过细胞膜而被皮肤吸收，它作为化妆品外用是很显效的。同时，GSH作为小分子肽，它内服无须被消化即可吸收的，所以GSH口服更加有效。因此GSH无论内用还是外作都具有良好的养颜、美容、回春之效。还原型谷胱甘肽的市场前景1.国

13、产谷胱甘肽占主导地位 还原型谷胱甘肽（GSH）于1995年由日本协和发酵株式会社与日本山之内株式会社研制成功并上市。1999年，重庆药友制药的粉针制剂在国内获批生产，随后，昆明积大制药、山东绿叶制药的还原型谷胱甘肽注射剂先后上市。至2011年5月，国内已有26张生产批文，全部为制剂，谷胱甘肽进口注册批文共有12张，。目前，市场上还原型谷胱甘肽的价格在4000/kg上下，国内谷胱甘肽原料药虽然仍在研制开发中，据悉已有突破性进展。谷胱甘肽原料的大规模生产技术开发一直是国家大力扶持的项目。2010年，国内22个城市样本医院销售的注射用谷胱甘肽用药市场已达331亿元，增长率达1205%（见图）。在这一

14、市场中，国产还原型谷胱甘肽粉针剂占据了主导地位，其中重庆药友制药的阿拓莫兰，上海复旦复华药业的谷胱甘肽粉针剂，山东绿叶制药的绿汀诺、昆明积大制药的松泰斯，四家占据了83%的市场份额。而进口品牌则分羹另外17%的市场。从2010年样本医院统计数据分析，销售额超过千万元的有12个城市（或地区）。用药量最大的是上海，其次是北京、珠三角（除广州）、广州和杭州，前5个城市（或地区）占这一品种总体市场的半壁江山，达51.39%。用药金额不足千万元的另外10个区域合计占据了13.35%。2006-2010年注射用谷胱甘肽市场销售额及增长率年注射用谷胱甘肽市场销售额及增长率2.用药领域不断拓展 临床显示，谷胱

15、甘肽在减轻脑组织的缺血-再灌注损伤方面显示出一定作用，可用于改善急性脑中风患者辅助治疗，对心脏具有保护作用。与此同时，谷胱甘肽也是一个疗效较好的滴眼液，因此也为人工泪液、眼药水等药品提供了广阔市场。同时，谷胱甘肽本药的活性成分为还原型谷胱甘肽，它在细胞内参与氧化还原过程，起着SH酶的赋活、辅酶作用，能防止紫外线诱发的白内障，抑制角膜溃疡，并控制进行性白内障的发展及视网膜病变。据某研究机构数据显示，2009年我国眼科用药销售额为61.65亿元，比上年同期增长了10%。销售的药物仍以抗感染、抗干眼病、抗青光眼等为主。另外，谷胱甘肽作为生物活性强化剂，在食物添加剂领域的使用也日益受到人们重视，国外已

16、开发了相关的功能性食品。综上所述，谷胱甘肽是一个颇有市场前景的品种，不但在抗肝炎病毒药、肝病辅助用药及眼科用药领域发挥了较好作用，而且医学界已开始研究其在心血管及循环系统中的应用。随着肽类物质研究的不断深入，肽类物质具有的神奇功能不断被发现，谷胱甘肽将成为值得关注的重要品种。酶转化法酶转化法发酵法发酵法化学合成法化学合成法溶剂萃取法溶剂萃取法4.还原型谷胱甘肽的生产方法与工艺化学合成法与萃取法提取GSH随着多肽合成技术的日趋成熟，现已能用化学随着多肽合成技术的日趋成熟，现已能用化学合成法合成合成法合成GSH，但是化学合成法生产，但是化学合成法生产GSH 操作过操作过程复杂、耗时且得到的程复杂、

17、耗时且得到的GSH是左旋体和右旋体的混是左旋体和右旋体的混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效价很难保持一致，因此难以推广。效价很难保持一致，因此难以推广。萃取法主要是从高含量谷胱甘肽的动植物组织中提萃取法主要是从高含量谷胱甘肽的动植物组织中提取所采用的一种方法取所采用的一种方法,它是发酵法生产流程中的下游它是发酵法生产流程中的下游过程基础。可以从鼠血、鼠肝和鸡血、酵母、麦芽过程基础。可以从鼠血、鼠肝和鸡血、酵母、麦芽中提取中提取GSH,但以酵母作原料居多。萃取法生产但以酵母作原料居多。萃取法生产GSH所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇

18、等。所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇等。但但由于原料不易获得且由于原料不易获得且GSH 的含量极低，因此该法的的含量极低，因此该法的实际应用价值不大。实际应用价值不大。微生物发酵法生产还原型谷胱甘肽发酵发酵细胞细胞破碎破碎分离分离提取提取得到得到GSH微生物细胞内含有微生物细胞内含有GSH，且发酵周期短、操作简单、成本低，发酵法就，且发酵周期短、操作简单、成本低，发酵法就是采用廉价的糖类原料，利用微生物体内物质的代谢途径来进行是采用廉价的糖类原料，利用微生物体内物质的代谢途径来进行GSH生生物合成的方法。基本工艺如下：物合成的方法。基本工艺如下：一般情况下，微生物细胞中一般情况下，微生物

19、细胞中GSH的含量不高（的含量不高（仅为干重的仅为干重的0.5%1%)，过高含量的过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境。发酵法产容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境。发酵法产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量，二含量，二者的有机结合将有利于者的有机结合将有利于GSH产量的大幅度提高。产量的大幅度提高。菌株的选育采用常规诱变育种选育高产菌株采用常规诱变育种选育高产菌株利用遗传工程技术构建具有利用遗传工程技术构建具有GSH合成酶活性的基因工程菌合成酶活性的基因工程菌细胞密度的提高可通过对发酵过程的优化控制（包括高密度培养

20、）获得，而胞内GSH 含量的提高通常是由菌种选育来实现的，主要有两种方法方法一方法一方法二方法二由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此采用微生物发酵法已成为目前进和完善，因此采用微生物发酵法已成为目前GSH 工业化生产的最普遍方法。工业化生产的最普遍方法。常规诱变育种 到目前为止,针对GSH 生产的酵母菌株而进行的物理或化学的处理方法大致有紫外线、X 射线、射线以及亚硝基胍等,而培养基中的特定筛选物质(筛子)主要包括蛋氨酸、L-乙硫氨酸、DL-乙硫氨酸、1,2,4三氮唑、氰化钠、亚硫酸盐、酰

21、胺和靛酚等。通过一系列对菌株的改良及选育工作,获得了很多GSH 高产菌株。构建工程菌构建具有构建具有GSH 合成酶活性合成酶活性的基因工程菌的的基因工程菌的两种方法两种方法2.酵母基因重GSH在细胞内特殊的生理功能使其对自身合成产生反馈抑制，用诱变手段和构建基因工程菌株来减弱或消除这种反馈抑制非常重要。近年颇受重视的是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中。1.Ecoli基因重组 E.Coli基因重组方法 Ecoli菌种细胞中GSH含量虽较酵母少，但它的遗传背景清楚、简单，基因操作方便，菌体繁殖较快。为了消除GSH对GSH合成酶(GSH-）的反馈抑制，Murata从Ecoli中筛选了

22、1株GSH-脱敏的突变株，从中克隆了GSH-基因(gsh)并在Ecoli BRC912表达，使此株GSH合成活性大为提高，产量达48 1 p molg(湿细胞)。GSH-活性提高后，GSH-就成了合成GSH的限速酶。沈立新等构建了含有gsh 和GSH-基因(gsh)的重组质粒，分别转入Ecoli细胞，分步进行-谷氨酰半胱氨酸和谷胱甘肽的合成，合成率达378 gL，比同时转入的合成率高421，既解决GSH-和GSH一在同一菌株中克隆表达相互影响的矛盾，又解决了GSH对GH-的反馈抑制，降低了ADP对第二步反应的抑制程度。酵母基因重组方法 酵母糖酵解产生的ATP是GSH合成过程中不可少的能量供体。

23、利用基因工程手段增加酵母中GSH合成酶系活性是提高GSH合成率的另一有效途径。Tazuka等将Ecoli B中gsh 基因片段与Scerevisiae 98的1个启动子融合，融合的GSH-在酵母中表达，结果GSH-活性和GSH的含量分别提高了100多倍和3倍多。Christine将带有gsh、gsh各1个拷贝的质粒PINE 转化入啤酒酵母，GSH产量达到细胞总干重的18，大大高于对照菌株。此外，通过优化菌株的培养表达条件也可提高GSH产量。有研究通过反馈控制乙醇浓度流加葡萄糖，利用正交试验设计优化发酵后期添加3种氨基酸配比和浓度进行酿酒酵母T65补料分批发酵生产GSH，产量达到219 gL。卫

24、功元等研究了温度、pH、溶氧和补料流加速度对产朊假丝酵母生产GSH的影响，发现较高温度对细胞生长有促进作用，较低温度则更有利于提高GSH产量，pH 5.5时对细胞生长和GSH合成均最佳，恒溶氧控制发酵可明显提高细胞干重和GSH产量，当恒溶氧浓度35时，二者的提高幅度可分别达到22和30，指数流加是较理想的补料方式。经优化培养，GSH产量达8572 mgL。除E Coti和酵母外，傅瑞燕等构建了重组乳酸乳球菌生产GSH，用乳酸链球菌素诱导4 h后，胞内GSH含量达到358 nmolmg蛋白质。培养基成分 碳源：碳源：碳源作为满足微生物生长需要最基本的营养要素，糖类物质成为研究的重点。酵母菌能较好

25、的利用蔗糖、葡萄糖，也可利用木糖，但基本不利用乳糖。卫功元等对葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、麦芽糖、果糖和可溶性淀粉等物质进行考察，结果显示蔗糖比较适合用于促进细胞生长，而葡萄糖更有利于促进GSH的合成，因此选择葡萄糖作为碳源。氮源：氮源：氮源通过对牛肉膏，蛋白胨等有机氮源及硫酸铵，尿素等无机氮源的比较得出单一无机氮源存在的条件下，细胞生长及谷胱甘肽合成均优于有机氮源，尿素在8 gL时，谷胱甘肽产量(150 mgL)和胞内谷胱甘肽含量(282)达到最高，而硫酸铵浓度在10 L时，细胞生长(70 gL)最理想。刘娟 等在确定蛋白胨对融合菌株生产谷胱甘肽影响的基础上研究了不同浓度无机氮源硫酸铵、氯化铵

26、及尿素，发现均无明显影响。前体：前体：前体多种氨基酸均能促进酵母生长，提供必要的营养物质，但却并非均能促进谷胱甘肽合成，所以学者研究在发酵过程加入适当比例的3种前体氨基酸使之既能促进酵母菌体生长又能促进谷胱甘肽生物合成。Wen等利用正交试验设计研究在Scerevisiae T65菌株培养基中添加最佳前体浓度为谷氨酸10 mmolL，甘氨酸18 mmolL，半胱氨酸335 mmolL，同时在培养过程中先加入2 mmolL半胱氨酸，再按最佳比例加入前体，使得谷胱甘肽产量达到3293mgL。发酵条件优化环境条件也是发酵法生产谷胱甘肽不容忽视的重要因素,其中影响细胞GSH含量的环境参数主要包括温度、溶

27、解氧、pH等。温度直接影响代谢过程中各种酶的活性,代谢反应速率,菌体生长量。卫功元等研究表明,较高温度可以降低底物对菌体生长的抑制,有利于细胞的生长,而低温更有利于谷胱甘肽的生物合成。童群义等在重组大肠杆菌培养过程中提出了温度分阶段培养策略,即前期控制37 培养菌体,后期降低温度增加酶的生物合成。氧气浓度对细胞生长和GSH 合成有显著影响,一方面影响着微生物的生长,另一方面对用。卫功元等研究了发酵罐中溶氧对产朊假丝酵母对分批发酵生产GSH的影响,当葡萄糖浓度为30 g/L,且通气量控制在5 L/min 时,搅拌转速达到300 r/min 即可满足细胞生长和谷胱甘肽合成对溶解氧的需求。发酵液中的

28、pH对营养物质的解离状态、酶活性、代谢速率有着重要的影响,因此pH也是制约GSH 生产的一个关键因素。卫功元等研究了pH对谷胱甘肽发酵的影响,结果表明,当pH值控制在5.5 时谷胱甘肽总产量最高。温度温度 溶解氧溶解氧pH发酵过程的调控葡萄糖的流加策略葡萄糖的流加策略前体物质的添加前体物质的添加葡萄糖的流加策略 GSH 的生成与发酵液中葡萄糖的消耗密切相关。研究发现,只有在葡萄糖几乎耗尽、生长停止时,细胞内才开始大量合成GSH;且由于GSH 是胞内产物,所以在提高生产菌株胞内合成GSH 能力的同时,还需要在发酵过程中设法提高细胞数,以提高GSH 的总产量。为实现这一目标,必须加大底物(如葡萄糖

29、)的质量浓度。但过高的葡萄糖浓度会产生葡萄糖 效应,抑制细胞的生长并且目标产物得率会大大下降,因此一般采用后期限量流加葡萄糖的方法,以消除底物抑制,达到高密度细胞培养、延长GSH 的生产时间的目的。1.恒速流加恒速流加2.指数流加指数流加3.反馈控制流加反馈控制流加前体物质的添加 在前体氨基酸中,半胱氨酸为GSH合成的关键氨基酸,它的存在能明显提高细胞内GSH含量及GSH 的比生产速率,但阻碍细胞量的增加。在发酵过程中半胱氨酸的补加策略应以尽量减少对生长的抑制为原则。一般有两种补加方式:(1)连续流加，保持发酵液中半胱氨酸的浓度恒定。(2)定时补充。当发酵进行到比生长速率基本稳定时，加入少量高

30、浓度的半 胱 氨酸溶液。加入时间选择在发酵的第2 阶段刚开始时。酶工程法合成GSH 用分离提取的酶或游离细胞进行催化反应，减少了细胞代谢副产物对分离提取的影响，简化了下游工艺。早期研究中用去污剂和溶壁酶处理啤酒酵母增大细胞的通透性，加入含有葡萄糖、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸等前体的反应液，GSH产量大大增高，达9.06 g/L。也有人将经甲苯通透处理后的重组E.coli与干酵母细胞一起加入反应体系，GSH含量达5 mg/mL。由于游离酶难以重复使用，并影响产物的分离提取，故用固定化酶催化合成GSH。将自溶后的啤酒酵母分离出GSH合成酶，用聚丙烯酰胺凝胶包埋后加入反应液，半胱氨酸转化率为87（游离

31、酶为47），且稳定性提高。用固定化细胞法具有特定的优势，这是因为：（1）GSH合成酶是双酶体系，酶的分离提取更加繁琐，用固定化细胞催化合成GSH避免了繁杂的酶分离过程；（2）GSH合成过程需ATP作能量供体，实际生产过程中不可能直接加入ATP，而且ATP利用后生成的ADP对GSH-及GSH-有抑制作用，因此，提供合适的ATP再生体系无论从经济角度还是从酶反应角度均较为合理。ATP再生由酶系完成，固定化细胞可以利用相应菌株细胞内的ATP再生酶系和GSH合成酶系，通过偶联或与其它GSH合成酶活性较高菌株固定化细胞的种间联合成GSH，其优势是固定化酶法合成GSH无法比拟的。GSH不同合成方法的比较

32、与偶联 与固定化酵母生产GSH相比，含GSH合成酶系的重组E.coli具有稳定性好、成本低廉等优点，但须解决GSH合成过程中ATP再生的问题。已有许多ATP再生方法和GSH酶反应偶联合成GSH。利用E.coli细胞的乙酸激酶GSH合成酶系，以乙酰磷酸为磷酸供体将ADP等再生为ATP，合成GSH，偶联效果较好。但乙酰磷酸成本较高且不稳定，难以工业化生产。沈立新等用卡拉胶固定E.coli生产GSH，优化条件下罐式反应器GSH的产量为 0.84 g/L，稳定性较好；此外，与酵母生产ATP体系相偶联的共固定化体系在填充床中反应，GSH合成量达1.24 g/L，收率比直接加入ATP提高24.2%。童群义

33、等将E.coli与啤酒酵母用PVA-卡拉胶混合载体固定生产GSH，比单一固定E.coli或单一固定化啤酒酵母效果好，但GSH合成无明显提高。主要是由于偶联体系在磷酸盐缓冲液浓度的不协调性引起的，再生ATP的高浓度磷酸盐缓冲液对GSH合成酶系产生抑制作用；而且ADP、ATP在E.coli和酵母两体系间的传递受到限制，也影响了偶联体系GSH合成效率。目前国内外常用的GSH工业生产方法是酵母发酵法，工艺较成熟，但产量有待提高。与ATP再生体系偶联合成GSH，乙酰激酶尽管效率较高，但乙酰磷酸的高价格及稳定性限制了此法的产业化；酵母糖酵解途径成本低廉，虽在胞二磷胆碱和NADP的合成方面获得成功，但合成G

34、SH的效率较低，主要是ATP再生反应效率不高，反应条件与GSH酶系催化合成GSH的条件不协调以及由此造成的成本较高限制了此方法潜力的发挥。分离与纯化方法(1)铜盐法：具有使用价值铜盐法：具有使用价值,但污染大但污染大(2)离子交换树脂法：经济效益较高离子交换树脂法：经济效益较高,主要根主要根据据-SH基基化合物与汞有很强的亲和作用化合物与汞有很强的亲和作用,用含汞树脂提用含汞树脂提取取含含-SH基化合物能取得很好的效果基化合物能取得很好的效果(3)双水相分配结合温度诱导相分离：双水相双水相分配结合温度诱导相分离：双水相分配技术是一个新型生物分离技术分配技术是一个新型生物分离技术,利用双水利用双

35、水相技术可以省去细胞破碎后的固液分离操作相技术可以省去细胞破碎后的固液分离操作,并利用温度诱导相分离能实现聚和物的循环并利用温度诱导相分离能实现聚和物的循环利用利用目前报道的分离提纯目前报道的分离提纯GSH的方法主要有的方法主要有3种种:总结与展望 还原型谷胱甘肽（GSH）是一种重要的调节生理功能的药物,在临床上的应用越来越广,已成为医学重要的具有调节人体免疫功能和辅助抗癌的药物之一。GSH 的抗氧化性又使它在食品工业中的应用备受人们关注,在食品贮藏保鲜和改善产品风味、提高产品营养价值方面的作用越来越被人们看好。虽然GSH的产品功效很大,但如何实现GSH 的工业化、产业化却是摆在人们面前的一个

36、应对课题。在目前GSH价格高，使其推广应用受到限制。尽管日本已实现了酵母发酵法制备GSH的产业化，并已将研究结果以专利形式公布，但是如何提高发酵法生产GSH的产量，降低生产成本仍有一些问题需要研究：1234选育性能良好的选育性能良好的GSH高产菌株或通过重组高产菌株或通过重组DNA技术构建基因工程菌合技术构建基因工程菌合 成成GSH；GSH生产菌株高密度培养过程中各种关键因素（如生产菌株高密度培养过程中各种关键因素（如CO2抑制和抑制和O2供供给等）的解决；给等）的解决；环境条件（温度、环境条件（温度、pH、溶氧等）和培养基成分对、溶氧等）和培养基成分对GSH生产的影响及其生产的影响及其发酵动力学规律；发酵动力学规律；如何使胞内合成的如何使胞内合成的GSH分泌至胞外，解决胞内分泌至胞外，解决胞内GSH高积累产生的反高积累产生的反馈抑制；馈抑制；5建立和优化发酵调控策略，利用多尺度参数实现建立和优化发酵调控策略，利用多尺度参数实现GSH生产过程的生产过程的优化控制；优化控制；6进一步建立和优化分离纯化工艺，提高进一步建立和优化分离纯化工艺，提高GSH产率。产率。主要为以下6个方面：L/O/G/OThank You!