1、 生物分离工程 （第二版） 孙彦编著 Bioseparation Process Science Antonio A. Garca et al编著编著 l平时成绩：30分 课堂测验、作业、出勤情况 l期末考试：闭卷考试，70分 l绪论绪论 2 2学时学时 l细胞分离与破碎细胞分离与破碎 2 2学时学时 l初级分离初级分离 2 2学时学时 l膜分离技术膜分离技术 6 6学时学时 l生物产品萃取技术生物产品萃取技术 8 8学时学时 l色层分离技术色层分离技术 1010学时学时 l蛋白质复性蛋白质复性 2 2学时学时 l沉淀与结晶沉淀与结晶 2 2学时学时 重要性重要性 l生物分离过程生物分离过程
2、特点特点 一般步骤一般步骤 l工业生物分离过程工业生物分离过程 典型的生物分离过程典型的生物分离过程 过程的选择依据过程的选择依据 生物分离工程: 从粗原料中获得合乎使用要求的目标产 物的过程，包括目标产物的提取、浓 缩 、分离纯化及成品化等。 多学科的交叉多学科的交叉 多种分离技术的集成多种分离技术的集成 生物工程生物工程 科学研究的科学研究的 （Engineering) 合乎使用合乎使用 最新成果最新成果 要求的产品要求的产品 (Science) (Product) Upstream Technology Downstream Processing Genetic Engineering
3、Bioreaction Engineering Bioseparation Engineering l在基础研究领域， 生物分离技术的发展在某 种程度上决定人类对生命、对自然的认知程度； l在工业生物技术领域，决定了生物产业的成本 和经济效益。 生物工程的基本过程生物工程的基本过程 生产生产生产生产 大多数酶：大多数酶：7070 医用酶如天门冬酰胺酶：医用酶如天门冬酰胺酶：8585 基因工程表达产物：基因工程表达产物：8585一一9090以上以上 青霉素：青霉素：5050 乙醇：乙醇：1414 传统产品传统产品 小分子（少数工业用粗酶）小分子（少数工业用粗酶） 理化性质清楚理化性质清楚 易于放
4、大易于放大 基因产品基因产品 大分子大分子 胞内胞内 不稳定不稳定 放大困难放大困难 生物分离过程的特点生物分离过程的特点 u目标产物含量低目标产物含量低 u待分离物组成复杂待分离物组成复杂 u稳定性差，容易失活稳定性差，容易失活 u对最终产品的质量要求严格对最终产品的质量要求严格 发酵液中：青霉素发酵液中：青霉素 4.2% 庆大霉素庆大霉素 0.2% 动物细胞培养液：动物细胞培养液： 目标物含量目标物含量 5 50 g/ml Back 细胞组成（占干重百分比） 类 型 蛋白质 % 核 酸 % 多 糖 % 类脂物 % 细 菌 40-70 13-34 2-10 10-15 酵 母 40-50 4
5、-10 小于15 1-6 丝状真菌 10-15 1-3 小于10 2-9 藻 类 10-60 1-5 小于15 4-80 动物细胞 小于10 小于50 小于50 小于50 植物细胞 小于70 小于30 小于50 小于80 Back 产物失活的主要机制是化学降解或微生物产物失活的主要机制是化学降解或微生物 引起的降解。引起的降解。 影响因素包括：影响因素包括： pH 温度温度 浓度浓度 蛋白水解酶等蛋白水解酶等 要求：分离条件温和，并采用快速的分离纯化要求：分离条件温和，并采用快速的分离纯化 方法除去影响目标产物稳定性的杂质。方法除去影响目标产物稳定性的杂质。 Back 目前对医药、生物制剂的要
6、求：无菌、无目前对医药、生物制剂的要求：无菌、无 热源，对于蛋白类药物，一般要求杂蛋白含量热源，对于蛋白类药物，一般要求杂蛋白含量 2%。 例如：例如： 对医用青霉素，噻唑蛋白类的含量必须要对医用青霉素，噻唑蛋白类的含量必须要 1.5 10-6； 原亲酶素和重组胰岛素，杂蛋白含量应原亲酶素和重组胰岛素，杂蛋白含量应 0.01%。 对有些产品还要求呈稳定的无色晶体对有些产品还要求呈稳定的无色晶体 u 高效生物分离技术缺乏高效生物分离技术缺乏 u目标产物的回收率低目标产物的回收率低 u 分离的成本高分离的成本高 生物分离过程中存在的主要问题 破碎、萃取破碎、萃取 沉淀、吸附沉淀、吸附 层析、色谱层
7、析、色谱 超滤、冷冻干燥超滤、冷冻干燥 离心、过滤离心、过滤 萃取、超滤萃取、超滤 电泳电泳 喷雾干燥、结晶喷雾干燥、结晶 粗提粗提初分离初分离精分离精分离成品化成品化 每步的回收率： Yi = mi2 / mi1 mi2 第i步分离后得到产品的总量， mi1 第i步分离前产品的总量 总回收率： i i T YY l提高每步操作的回收率 l减少操作步骤 对分离技术及设备进行系统研究，努力开发新型高效 的分离纯化方法是实现降低目标产物的成本、提高经济 效益的必由之路。 例如：对人干扰素的分离 总回收率：16% 离子交换离子交换 （62.7%)62.7%) 硫酸盐盐析硫酸盐盐析 (96.2%)(9
8、6.2%) 铜亲合层析铜亲合层析 (46.0%)(46.0%) 疏水层析疏水层析 （78.3%)78.3%) 凝胶电泳凝胶电泳 (88.9%)(88.9%) 仅三步产品的回收率就达到仅三步产品的回收率就达到81%，且产品的，且产品的 纯纯 化程度与上述纯化过程相当。化程度与上述纯化过程相当。 分离路径的选择非常重要！分离路径的选择非常重要！ 硫酸盐盐析硫酸盐盐析免疫亲合层析免疫亲合层析阳离子交换层析阳离子交换层析 方法：方法： 1 寻找差异 u物理性质：重力，分子大小，溶解度 u化学性质：分子的亲疏水特性及其所带电荷性质的差异 u生物学性质：生物分子间的特异性识别作用 性质上最大的差异将导致最
9、有效的分离性质上最大的差异将导致最有效的分离 2 对于生物活性物质，必须考虑分离方法对其生 物活性的影响 生物分离产品的类型： 小分子类小分子类：MWMW 10001000MW 1000，酶、抗体、重组蛋白、，酶、抗体、重组蛋白、 核酸等核酸等. . 利用分子间相互作用力的差异实现分离 l利用生物分子的化学和生物学性质的差异 l沉淀、萃取、吸附、色谱等 利用分子间物性上的差异实现分离 l如分子量、沉降系数、挥发度等 l膜过滤、凝胶筛分、电泳、离心、蒸馏等 单单 元元 操操 作作 分分 离离 机机 理理 分分 离离 对对 象象 举举 例例 膜分离膜分离 微滤微滤 压力差、拆分压力差、拆分 菌体、
10、细胞菌体、细胞 超滤超滤 压力差、筛分压力差、筛分 蛋白质、多糖、抗生素蛋白质、多糖、抗生素 反渗透反渗透 压力差、筛分压力差、筛分 水、盐、糖、氨基酸水、盐、糖、氨基酸 透析透析 浓度差、筛分浓度差、筛分 尿素、盐、蛋白质尿素、盐、蛋白质 电渗析电渗析 电荷、筛分电荷、筛分 氨基酸、有机酸、盐、水氨基酸、有机酸、盐、水 渗透汽化渗透汽化 汽液相平衡汽液相平衡 乙醇乙醇 萃取萃取 有机溶剂萃取有机溶剂萃取 液液相平衡液液相平衡 有机酸、抗生素有机酸、抗生素 双水相萃取液液相平衡双水相萃取液液相平衡 液液相平衡液液相平衡 蛋白质、抗生素蛋白质、抗生素 液膜萃取液膜萃取 液液相平衡液液相平衡 氨基
11、酸、有机酸、抗生素氨基酸、有机酸、抗生素 反胶团萃取相平衡反胶团萃取相平衡 液液相平衡液液相平衡 氨基酸、抗生素氨基酸、抗生素 超临界流体萃取超临界流体萃取 相平衡相平衡 香料、脂质香料、脂质 层析层析 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 浓度差、筛分浓度差、筛分 脱盐、分子分级脱盐、分子分级 反相层析反相层析 分配平衡分配平衡 甾醇类、维生素、脂质、肽甾醇类、维生素、脂质、肽 离子交换层析离子交换层析 电荷、浓度差（电荷、浓度差（pHpH、 蛋白质、氨基酸、抗生素、蛋白质、氨基酸、抗生素、 离子强度）离子强度） 核酸、有机酸核酸、有机酸 亲和层析亲和层析 生物亲和作用生物亲和作用 蛋白质、核酸蛋白质、
12、核酸 疏水相互作用疏水相互作用 疏水作用疏水作用 蛋白质蛋白质 层析聚焦层析聚焦 电荷、浓度差（电荷、浓度差（pHpH） 蛋白质蛋白质 电泳电泳 凝胶电泳凝胶电泳 筛分、电荷筛分、电荷 蛋白质、核酸蛋白质、核酸 等电点电泳等电点电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸 等速电泳等速电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸 区带电泳区带电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸蛋白质、核酸 离心离心 离心过滤离心过滤 离心力、筛分离心力、筛分 菌体、菌体碎片菌体、菌体碎片 离心沉降离心沉降 离心力离心力 菌体、细胞、血
13、球菌体、细胞、血球 超离心超离心 离心力离心力 蛋白质、核酸、糖类蛋白质、核酸、糖类 u溶解度溶解度：受受 pHpH、盐等影响，将指导沉淀过程或、盐等影响，将指导沉淀过程或 萃取过程萃取过程 u分子电荷分子电荷：将指导如何有效地进行离子交换等将指导如何有效地进行离子交换等 u分子大小分子大小：指导凝胶过滤和膜过滤指导凝胶过滤和膜过滤 u疏水性疏水性：指导沉淀过程和疏水分离指导沉淀过程和疏水分离 u功能团功能团：功能团为稳定条件、提取剂及亲和吸功能团为稳定条件、提取剂及亲和吸 附剂的选择提供依据附剂的选择提供依据 u稳定性稳定性：适宜的适宜的pHpH值范围、温度范围、半衰期值范围、温度范围、半衰
14、期 u挥发性挥发性：是小分子物质选择分离过程的依据是小分子物质选择分离过程的依据 1 1氨基酸氨基酸： 两性电解质，具有等电点，溶解度受溶两性电解质，具有等电点，溶解度受溶 液液pHpH影响显著的特点。影响显著的特点。 常采用的分离纯化方法常采用的分离纯化方法 结晶结晶 离子交换离子交换 2 2蛋白质和多肽蛋白质和多肽： 特点：两性电解质，具有带电性、疏水性特点：两性电解质，具有带电性、疏水性 和生物亲和性，分子量差异较大。和生物亲和性，分子量差异较大。 常用的分析方法：常用的分析方法： 离心离心 沉淀沉淀 膜分离膜分离 萃取：双水相萃取、反胶团萃取萃取：双水相萃取、反胶团萃取 层析层析 电泳
15、等电泳等 3 3、糖类、糖类： 单糖、低聚糖、多糖单糖、低聚糖、多糖 分离纯化方法以吸附层析为主 4、脂质脂质： 脂肪酸、不饱和脂肪酸、卵磷脂等。 分离纯化方法： 有机溶剂萃取 超临界流体萃取 层析等方法 5 5抗生素抗生素： 分离纯化主要采用： 有机溶剂萃取 离子交换 结晶 吸附层折 6 6其他其他 天然植物及中药中的药用成分。 分离纯化： 萃取：溶剂萃取和超临界萃取 吸附层析等 对于生物产品，消费者 更看重的是产品的价格、 质量和实用性。所以，工 业生物分离过程选择的标 准应该是以获得高质量、 低价格的产品为目标。影 响产品成本的除了分离步 骤和效率外，还有一个重 要的因素就是产品的浓度。
16、 根据热力学第二定律，混合过程熵增大，是自发过 程。所以，两种互溶的物质相互混合时，不需要外界能 量。但是，要使混合的物质得到分离，必须补充使熵减 小所需的能量。在恒温条件下使混合物中的各组分提纯 为纯粹的物质所需的最小功 与吉布斯自由能变化 相等，即 在稀溶液中： 即得到单位质量物质 所需的能耗与 成正 比。所以，原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高， 分离回收的成本越大。 min WG ii i i xRTxGWln min iii xRTxWln min, i )/1ln( i x 采取的方法： 1）增加产品在发酵液或细胞内的浓度； 2）将浓缩过程尽可能地放在分离的最初阶 段。 评价一个
17、分离过程对目标产物的分离效率主要有 下面三个标准： 浓缩率浓缩率 m（concentration factor)： 表征以浓缩为目的的分离过程的最重要指标 分离因子分离因子 （separation factor or purification factor) 表征目标产物的分离纯化程度的重要指标 回收率回收率 R (recovery factor) FC FP 原料 产品 CTC，CXC CTP，CXP FW CTW，CXW 废料 其中，F表示流速，C表示浓度，下标T和X分别表示目 标产物和杂质，C、P和W分别表示原料、产品和废料。 浓缩率 mT = CTP/CTC mX = CXP/CXC
18、如果 mT = mX ，则目标产物未得到分离纯化 分离器 分离因子 = 分离因子越大，分离效率越高 回收率R R = 100% = 100% TC TP CV CV c p xm mT TC TP CF CF c p 1 单克隆抗体的生产（monoclonal antibodies) 用途：临床治疗、检测及实验研究 生产规模： 1m3/day，小规模批量生产，属于高附加值 产品，反应器的体积一般为35L左右。 类型：IgG：分子量160,000Da，能够分泌到胞外； IgM：分子量是IgG的5倍，存在于细胞膜表面。 生产的方式：杂交瘤细胞生产的融合蛋白（血清培养）. IgG product C
19、ells Supernatant IgG eluted Unbound material 单克隆抗体的回收和纯化（单克隆抗体的回收和纯化（John Wiley 等，等，1995） Bioreactor fluid with cell Continuous centrifugation 100,000MW membrane Affinity chromatograph Sterile filtration Formulation Membrane concentration 2. 人胰岛素（人胰岛素（human insulin) 生产方式：基因工程 E.coli；以包含体的形式存在于胞内； 细胞
20、培养产生的是胰岛素前体，需进一步进行 化学转化为胰岛素 含量：小于1g/L（相当低）； 用途：临床注射用，要求的纯度相当高； 3. 狂犬病疫苗（狂犬病疫苗（Rabies vaccine) 病毒性疫苗的生产一般是在动物体内、单层培养或悬浮 培养，在病毒溶解细胞后在将其收集。 生产方式：使用猿猴细胞作为微载体悬浮培养，反应体积 上百立升。动物细胞被固定在珠状的微载体上。 病毒（0.3m)首先感染细胞并在其内复制。其 后被收集分离。 Product Product B-chain Cell debris A-chain Supernatant Cyanogen 人胰岛素的回收和纯化人胰岛素的回收和纯
21、化 Bromide （San Diego等，等，1998） Bioreactor fluid with cells Precipitation Chromatography 阴离子、体积排阻阴离子、体积排阻 Cell disruption Centrifugal extraction Dialysis Cleaning pro insulin Precipitation pH=5.0 Chromatography 弱阴、反向弱阴、反向HPLC Extraction Sulfonation Dialysis 狂犬疫苗的下游分离过程狂犬疫苗的下游分离过程 （John Wiley等等, 1994)
22、Cells Permeate Concentrated virus -Propiolactone 丙酸内脂丙酸内脂 4 C 37 C HSA Nonantigenic material Product Bioreactor fluid with cells Membrane UF membrane 10-100kDa Virus inactivation Hydrolysis(24 hr) Zonal(蔗糖）蔗糖） Centrifugation 除菌除菌 青霉素（青霉素（penicillin)：用青霉菌生产，主要提取步骤为萃 取。 蛋白酶（蛋白酶（protease) 用途：洗涤剂，所以对纯度要
23、求不高 目的：高浓度、高产率，而非高纯度 L-赖氨酸（赖氨酸（L-lysine) 可用于动物和人使用，不同用途，不同的纯化方式。 主要分离方式为吸附。 柠檬酸（柠檬酸（citric acid) 由Aspergillus niger（曲霉）生产，酸性菌，在低pH值 下生长。主要分离方式为萃取（用煤油和叔氨）。 青霉素的分离及纯化（青霉素的分离及纯化（Macmillan,1983) Product CaCl and Polyelectrolyte T=5 C Spent solvent Filtrate Spent Isopropanol Amyl acetate solvent or butan
24、ol 乙酸戊酯乙酸戊酯 Extract Spent solvent Acetone and water and Carbon and sodium or Impurities potassium acetate Bioreactor fluid with cells Filtration Extractions pH 2-3 Activated carbon treatment Filtration Drying Filtration Washing Filtration Precipitation 蛋白酶的分离纯化蛋白酶的分离纯化 （Shuler ML等等, 1992) Solid Prod
25、uct Cool to 4-5 C Filter aid Liquid Product Cells Precoat Bioreactor fluid pretreatment Filtration or centrifugation Two-stage ultrafiltration Ultrafiltration Sterile ultrafiltration Polishing ultrafiltration Formulation Formulation Drying Rotary filter Precipitation Liquids or solids 赖氨酸的回收和分离（赖氨酸的
26、回收和分离（Marcel Dekker, 1996) 柠檬酸的下游分离（柠檬酸的下游分离（Banid AMBanid AM等，等，19811981） 在工业生物分离纯化中作为设计者应关注在工业生物分离纯化中作为设计者应关注 的关键问题的关键问题： 高收率，降低总成本（也要考虑环境成本）； 高的可靠性和重复性：保证产品质量的稳定。 提高每步操作的回收率 减少操作步骤 将减小体积，增加目标物的浓度放在分离之初 首先分离最易除去的物质 在分离过程中尽早采用具有高分辨率的分离步骤 将最困难的分离留在整个工艺过程的最后 分离条件应保证产物的稳定性和活性 缩短分离时间以减小产物分解，提高活性 在工业上，欲
27、分离纯化某种胞内蛋白，请谈谈在工业上，欲分离纯化某种胞内蛋白，请谈谈 你对其分离纯化路径的设计思路以及在分离过你对其分离纯化路径的设计思路以及在分离过 程中应注意的问题。程中应注意的问题。 为什么在成品化的前一步要进行产品的浓缩为什么在成品化的前一步要进行产品的浓缩? ? 请阐述各项生物分离原则的理论依据。请阐述各项生物分离原则的理论依据。 l查找资料，提交一份生物产品分离纯化的具体查找资料，提交一份生物产品分离纯化的具体 工艺。工艺。 l贾凌云贾凌云 l目前基因表达的重组蛋白质已超过4000多种, 其中用E.coli表达的要占90%以上,而这些蛋白 质在E.coli中绝大多数是以包含体形式存
28、在； l用于临床的基因重组药物只占研发药物的约1%。 l复性效率低：常用的复性方法稀释和透 析法的复性效率为5-20%； l与杂蛋白分离困难，产品成本高。 包含体是指外源基因在宿主细胞中表达时， 表达的蛋白质不仅不能分泌到细胞外，反而在细 胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0m的 固体颗粒-包含体。这些基因表达产物的一级结 构(即氨基酸序列)虽然正确，但其立体结构是错 误的。 由于包含体具有很高的密度(约1.3mg/mL ) 它们在细胞裂解后可通过低速离心收获。 1. 蛋白质高效表达的结果 l在载体系统中采用强的启动子和增强子序列,靶 蛋白质表达分别可占细胞总蛋白的40%50%， 蛋白
29、质的合成速度太快，肽链来不及折叠形成 正确构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而 不溶。 2.宿主内缺乏目标蛋白质正确折叠的辅助因子 l对于大肠杆菌,来源于真核细胞的蛋白质是一 种外界刺激因子,在进化过程中细菌细胞还没 有形成与之完全相适应的结构基础和折叠机制, 例如,处于还原环境的细菌胞质不能有效地完 成二硫键蛋白质的氧化折叠;又如,辅助肽链折 叠的分子伴侣和折叠酶的种类和功能不能完全 适应较复杂真核蛋白质的折叠。 1，先用化学试剂将包含体溶解成为伸展的蛋白 质一级结构；常用变性剂尿素、盐酸胍以及去污剂 SDS等，可分别破坏蛋白质的高级结构及肽链之间的疏 水作用，使其变成松散的水溶状态。 2，
30、使蛋白质的一级结构在合适的条件下重新折 叠成正确的构象。 U I1 I2 IZ IC IN N AC A 聚集：是由暴露在溶剂中的疏水区相互作用的过 程，速度快，一般在30秒内完成。 复性：分子链内自我折叠的过程，相对缓慢，完 全复性大约需10分钟的时间。 溶菌酶处理高压匀浆破碎 低速离心 包含体沉淀需用去污剂(Triton X-100 或脱 氧胆酸钠) 和低浓度变性剂(如2 mol/L 尿素或盐 酸胍等) 洗涤以除去脂类和膜蛋白。 通过以上制备可获得高纯度的包含体(纯度 高于70%)。 1. 用膜透析法或凝胶过滤去除变性剂，也可用 稀释的方法，一般1-20mol/ml的低浓度条件 下，重组蛋
31、白的复性效果较好。 对小分子的多肽，复性效率较高，对大分 子蛋白和二硫键较多的分子，复性很困难。 2. 加入分子伴侣 人工分子伴侣体系(去污剂环糊精) 环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性 分子伴侣：就是在细胞内催化及维持其他蛋白质 正确构象的一类蛋白质，它参与细胞 内许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运 输，通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中 间体，阻止了蛋白质中间体聚集，帮 助其形成正确的构象。 l环糊精的分子结构环糊精的分子结构 其复性过程分为两步进行：第一步为捕获阶 段，在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分 子通过疏水相互作用与蛋白质的疏水位点结合形 成复合体，抑制肽链间
32、的相互聚集；第二步剥离 阶段，加入环糊精，由于环糊精分子对去污剂分 子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来， 从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白 质。 环糊精的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多 肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活， 从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。 直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白 质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直 链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结 合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利 于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便 宜，实际应用前景较好。 l直链糊精直链糊精 存在的问题：存在的问题： 分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并
33、 需要与复性蛋白质分离等缺点，目前，分 子伴侣还处于研究阶段，没有真正用于工 业规模的包含体复性。 液相色谱是纯化蛋白质的一个必不可少的手 段。其原理是根据待分离物质与色谱固定相之间 作用力的不同而得到分离。利用色谱复性正是利 用了变性的蛋白质在色谱固定相上的吸附作用而 避免了分子间的聚集作用，在吸附-脱附-吸附的 过程中实现了蛋白质的复性。 色谱法进行蛋白质复性的优点是色谱法进行蛋白质复性的优点是: : 在进样后可很快除去变性剂; 由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地 减少甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性 剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生, 提高蛋白质复性的质量和活性回收率;
34、 在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白 分离以达到纯化的目的,使复性和纯化同时进 行; 便于回收变性剂,以降低废水处理成本。 目前用于蛋白质复性分离的色谱方法：目前用于蛋白质复性分离的色谱方法： 体积排阻色谱 离子交换色谱 亲合色谱 疏水色谱 复性机理: 在变性蛋白进入柱顶端时,因有高浓度变性 剂的存在,变性蛋白质分子有一个随机的构象状 态和大的动力学水合半径,不能进入柱的空隙,蛋 白质在柱上不保留。当使用复性的缓冲溶液洗脱 时,因其逐步取代变性剂并使变性剂浓度降低,使 变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态, 这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳定的低能 态 即蛋白质的天然状态转化,从而
35、使蛋白质 开始复性。此时，局部复性的蛋白质可以进入球 的内部,开始在液固两相间进行分配,随着时间的推 移,当蛋白质分子的结构变得更加紧密时,蛋白质在 两相中的分配系数会逐步增加。当蛋白质进入柱填 料的孔隙后,其扩散速度减缓,从而限制了蛋白质的 聚集,这样就减少了沉淀的产生。蛋白质分子大,先 从柱子上洗脱下来,变性剂分子质量小,最后流出色 谱柱。故SEC的主要作用不是变性蛋白质与SEC固定 相间的特殊作用力,而是有利于更换变性蛋白质复 性的缓冲溶液,这里当然更不涉及二硫键是否正确 对接的问题。与稀释法比较,该方法可使溶菌酶、 碳酸酐酶和重组白细胞介素等的蛋白质质量回收率 和活性回收率显著提高。
36、复性机理复性机理：不同于SEC之处在于变性蛋白质与 固定相间有分子间的电荷作用,这种作用力可导 致变性的蛋白吸附于固定相表面,在洗脱过程中 进行吸附解吸再吸附的复性。 Hamaker将DEAE纤维素卷成柱状装入色谱 柱中,使用等浓度洗脱, 对重组白细胞分泌抑制 因子进行了复性纯化, 用该法复性的蛋白质浓度 比稀释方法提高了6.4倍, 且46%的蛋白质可以获 得复性,质量回收率为96%, 时间只用了5min. 复性机理：利用配体与目标蛋白质间的特异性亲 和作用,使变性蛋白分子保留在柱的 顶端使其与变性剂分离,而后在洗脱 过程中进行复性的。 按配基类型可分为: 固定化金属亲和色谱 脂质体亲和色谱
37、分子伴侣亲和色谱 脂质体作为配基对蛋白质复性的原理推测为: 局部变性的蛋白质分子结构类似于融球状态, 且具有与天然蛋白质相类似的二级结构,此时蛋 白质分子仍然具有强的疏水表面,故可同脂质体 的脂质双层作用以帮助蛋白质进行复性。 例如：用脂质体色谱对失活的碳酸酐脱氢酶进行 复性,其活性回收率为83%,如果使用没有脂质体 的柱子,则回收率便降至58%;如果直接采用稀释 50倍的方法,其活性回收率为52%。 分子伴侣亲和色谱介导蛋白质的复性同它在 溶液中的作用一致。即分子伴侣在复性蛋白质时, 为变性的蛋白提供一个中空环状疏水腔,当变性蛋 白质进入空腔后,可部分避免或完全消除变性蛋白 质分子间的相互聚
38、集作用,使蛋白质在疏水环境下 进行“结合-释放-再结合”的循环过程, 直到其恢复 到天然的构象状态。 目前英国剑桥大学的一个研究小组在这一领域 中做得最好。他们合成了几个复杂的固定相体系 用于蛋白质复性,使这些在溶液中无法复性的蛋白 质在柱子上得到了好的复性,并称之为折叠色谱 (Refolding chromatography) 复性机理: 当蛋白质、变性剂和杂蛋白质进入HIC系统后,由 于HIC固定相对变性剂的作用力较弱,而对变性 蛋白质的作用力较强,变性剂首先同变性的蛋白 质分离,并随流动相一同流出色谱柱。又因HIC 固定相能提供较通常方法高出数十乃至数百倍 的能量,在变性蛋白质被HIC固
39、定相吸附的同时 瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固 定相表面接触区域的水分子,而蛋白质的特定的 疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成 区域立体结构(Micro-domain),接着形成折叠 中间体(Intermediate),随着流动相的不断变化, 变性 蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再 吸附,并在此过程中逐渐被复性, 形成与天然蛋白质 构象相同的蛋白质并流出色谱柱。在此过程中,因不 同的蛋白质与固定,形成与天然蛋白质构象相同的蛋 白质并流出色谱柱。在此过程中,因不同的蛋白质与 固定相上的作用力强弱不同,复性的目标蛋白质就可 以与大部分杂蛋白进行分离。利用HIC对E
40、.coli 表达 的rhIFN和rhIFN分别在复性的同时进行了纯化。 rhIFN的GuHCl提取液在40 min内使用一次色谱过程 就可以使其纯度达到85%,活性回收率为稀释法的2- 3倍. l色谱固定相 l流动相的组成 l变性蛋白质的浓度 l蛋白质在柱上的停留时间 l流动相的流速、pH、温度 色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱 分离或层析分离。 惯用法 按固定相的基质（载体）类型分类： 层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维 素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操 作。 色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、 聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，
41、适合在高 压下使用。 也有人将层析称为色谱。 用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使 用要求的产品。 l当两相作相对移动时，利用溶质在互不相溶的 两相中吸附或分配的差异，引起移动速度的不 同而进行分离的方法。 l流动相与固定相： 流动相：可为气相、液相、超临界流体等 固定相：固体、液体和以固体为载体的液体薄层 l固定相的形状： 纸层析 薄层层析 柱层析 l操作压力 低压：0.5 MPa 中压：0.5-4.0 MPa 高压：4.0-40 MPa，用于分析目的 l分离操作模式 洗脱展开：最常用 前沿（迎头）分析 顶替展开 l用于大量制备用于大量制备 l分配机理 根据溶质和固定相间的作用机理 凝
42、胶过滤 离子交换 反相色谱 疏水层析 亲和色谱 常规的色层分离 色层分离过程包含两部分： l固定相：载体或载体+功能基团 l流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很 大区别。 l上上 样样 l洗洗 脱脱 l上上 样样 l冲冲 洗洗 l洗洗 脱脱 l高压液相色高压液相色 谱分离操作过谱分离操作过 程程 l层析分离操作过程层析分离操作过程 l保留时间(tR)和保留体积(VR) 从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所 需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间 内冲洗剂（流动相） 流过的体积为保留体积，用VR 表示。 FtV RR l 色谱流出曲线及参数色谱流出曲
43、线及参数 容量因子k 和平衡常数K 某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两 相中绝对量之比。 而平衡常数K为平衡时，物质在两相的浓度比： )( )( m s q q k 物质在流动相的量 物质在固定相的量 )/ )/( mm ss Vq Vq K 物质在流动相的浓度（ 物质在固定相的浓度 m s m s V V K q q k Vs和Vm分别为柱内固定相和流动相所占的体 积。于是有 l 溶质在固定相停留的时间分数溶质在固定相停留的时间分数= = 1 k k qq q ms s l溶质在流动相停留的时间分数溶质在流动相停留的时间分数 1 1 kqq q ms m 在柱内溶质只有转移到流动相时才能
44、沿柱的方向向 前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移 动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流 动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时 间分数之积： 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移 动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比： b u m u ) 1 1 ( k uu mb R o R m b t t u u ) 1 ( 0 ktt RR 当柱外死体积可忽略不计时， mR VV 0 smmmR KVVkVVV 0 0 0 0 1 R R R RR R R t t t tt t t k 选择性( )和相对保留值( ) = = 柱效率： 塔板高度（H）和
45、塔板数（N）是衡量色谱柱 效率的两个重要指标。 塔板高度（H）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流 动相之间达到分配平衡，这段柱长就相 当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。 l 1 2 R R t t )1( )2( 1 2 1 1 k k t t R R l l理论塔板数的计算公式为：理论塔板数的计算公式为： 2 )( R t N l式中式中 为标准偏差。为标准偏差。 理论塔板高度 为： 式中， 柱长。 塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。 l影响柱效的因素 1）理论塔板高度（ ）随填料粒度减少而减少； 2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效； 3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于 减小
46、； 4）分子量较小的样品分子 较小。 H N L H L H H H Gel filtration chromatography,GFC Size exclusion chromatograpy，SEC 是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大 小进行分离的层析技术。 应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离 和除盐。一般用作原料液的初分离，获取 几个不同分子量物质分级，供进一步分离 纯化使用。 l分离原理： 含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析 柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料 颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出 色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、 更小的分子可
47、通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体） 内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱 流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分 子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分 离的目的。 l凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如 下要求： （1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用； 蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、 分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液 的pH值和离子强度等物性无关。 （2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。 l天然及高
48、分子介质 经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼 脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成 的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚 乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。 （一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex） Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同 规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数 为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸 水2.5克，同样G-200每克干胶吸水20克。交联葡聚糖 凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100， G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程
49、度，膨 胀程度及分部范围。 Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生 物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。 （二）琼脂糖凝胶： 商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典， pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。 琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维 持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。 一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条 件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼 脂糖凝胶在40以上开始融化，也不能高压消毒， 可用化学灭菌活处理。 （三）聚丙烯酰胺凝胶： 是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为
50、单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工 成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型 号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺 凝胶的商品为生物胶P （Bio-Gel P），由美 国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共 10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的 排阻限度。 （四）聚苯乙烯凝胶 商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用 于分离分子量1600到40,000,000的生物大分子， 适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天 然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基 亚砜。 凝胶过滤的特点是凝胶过滤的特点是： 填料多为带有羟基、但不带电荷的惰性
