1、第六章 微生物的生长 生长生长微生物细胞的整个化学组分与结构在数量上微生物细胞的整个化学组分与结构在数量上 有规律按比例地增加，致使菌体细胞体积增大的过有规律按比例地增加，致使菌体细胞体积增大的过 程。程。 繁殖繁殖生命个体生长到一定阶段，经过细胞结构的复制和生命个体生长到一定阶段，经过细胞结构的复制和 重建所引起的个体数量增加的生物学过程。重建所引起的个体数量增加的生物学过程。 生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。 生长与繁殖的概念生长与繁殖的概念 第一节第一节 微生物纯培养的生长微生物纯培养的生长 一、一、纯培养的概念和分离方法纯培养的概念和分离方法 纯
2、培养纯培养(pure culture)(pure culture)微生物学中把从一微生物学中把从一 个细胞培养繁殖而得到的后代个细胞培养繁殖而得到的后代, ,称纯培养。称纯培养。 纯培养的分离方法有以下几种：纯培养的分离方法有以下几种： 稀释倒平板法稀释倒平板法 划线法划线法 单细胞挑取法单细胞挑取法 选择培养基分离法选择培养基分离法 首先将待分离的样品进行连续稀释首先将待分离的样品进行连续稀释, ,目的是得到高度稀释的效果目的是得到高度稀释的效果, , 如如1 1：1010、1 1：100100、1 1：10001000，取不同稀释度的稀释液各少量，取不同稀释度的稀释液各少量， 注入注入已灭
3、菌的培养皿中，已灭菌的培养皿中，再将已溶化并冷却至再将已溶化并冷却至4545左右的琼脂培左右的琼脂培 养基相倾入培养皿与菌液混合，在适宜的温度下培养，挑取单个养基相倾入培养皿与菌液混合，在适宜的温度下培养，挑取单个 菌落，并重复上述操作，以得到纯培养菌株。菌落，并重复上述操作，以得到纯培养菌株。 这种方法适合于细胞较大的微生物。这种方法适合于细胞较大的微生物。 （一）（一）稀释倒平板法稀释倒平板法 ( (二二) )平板涂布分离（平板涂布分离（Spread Plate） 简单易行，但易造成机械损伤简单易行，但易造成机械损伤 取取1ml稀释后的样品倒在无菌琼脂平板上，用无菌刮刀在培稀释后的样品倒在
4、无菌琼脂平板上，用无菌刮刀在培 养基养基 表面将菌液涂均。表面将菌液涂均。 （三）（三）平板划线分离法（平板划线分离法（Streak Plate） 特点：快速、方便。特点：快速、方便。 先准备好无菌的营养琼脂平皿，用接种环沾取少量待分离菌落按图 示方法在培养基表面连续划线。 （四）（四）单细胞（单孢子）分离法单细胞（单孢子）分离法 将显微挑取器安装在显微镜上，把一滴微生物菌悬液置于载将显微挑取器安装在显微镜上，把一滴微生物菌悬液置于载 玻片上，在显微镜下，用显微挑取器上的毛细吸管对准单个玻片上，在显微镜下，用显微挑取器上的毛细吸管对准单个 细胞挑取，再接种于培养基上，得到纯培养。细胞挑取，再接
5、种于培养基上，得到纯培养。 毛细管法：毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获 得纯培养。得纯培养。 小液滴法：小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜 下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。 （四）（四）选择性培养分离法选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可 以
6、根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条 件等，采用选择培养的方法进行分离。件等，采用选择培养的方法进行分离。 如从土壤中分离放线菌时，在培养基中加入如从土壤中分离放线菌时，在培养基中加入10%10%的的 酚数滴，以抑制细菌和霉菌的生长。酚数滴，以抑制细菌和霉菌的生长。 利用选择培养基进行直接分离利用选择培养基进行直接分离 二、细菌的个体生长二、细菌的个体生长 细菌的个体生长细菌的个体生长细胞个体吸收营养物质，细胞个体吸收营养物质， 细胞体积与原生质增加，细胞结构组建，细胞体积与原生质增加，细胞结构组建， 包括染色体的复制、核糖体的重建、细胞包括染
7、色体的复制、核糖体的重建、细胞 壁的扩增和细胞分裂等一系列生物学过程。壁的扩增和细胞分裂等一系列生物学过程。 （一）染色体的复制 细菌的染色体是双螺旋 的环状DNA分子，有双 向复制和单向复制两种 方式。 双向复制过程： 染色体附着到细胞质膜 上复制点按顺时针 运动，染色体逆时针运 动在复制点附近形 成新的复制点，断开的 一股DNA附着在新的复 制点上，开始复制。 （二）核糖体的建成 核糖体是细胞合成蛋白质的场所，核糖体由 40%的蛋白质和60%的RNA组成。每个细菌 细胞约有10000个核糖体，如按30分钟分裂 一次，则核糖体的生物建成速度为每秒56 个核糖体。 核糖体的建成通过在RNA上逐
8、渐添加蛋白质 来完成。 （三）细胞壁的扩增 细菌的生长伴随着体积的逐渐扩大，细胞 壁和细胞膜也不断扩增。 细胞壁的扩增方式与部位可借荧光抗体技 术来观察。 革兰氏阳性细菌的细胞壁扩增赤道板开始， 将老壁推向两端。 革兰氏阴性细菌的细胞壁扩增是新老壁互 相穿插的方式，扩增有多个点位。 （四）细胞分裂 当细胞生长到一定程度时，细胞中部 的细胞膜和细胞壁出现凹陷，并向心 生长，最终会合，形成两个细胞，完 成一次分裂，这种繁殖方式称为二分 裂。 分裂过程： 1、赤道带下面的膜向心凹陷，新的细胞 壁开始合成。核物质复制后，被分配 到凹陷的两边，同时产生两个新的外 壁，这两个外壁将分别成为两个子细 胞的赤
9、道带。 2、两个新的外壁带因新壁物质的合成并 插入而互相分开，比较薄的横壁继续 向心生长。 3、细胞壁物质不断合成，横壁逐渐增厚， 形成新的细胞壁，直到横壁在中央会 合，形成完整的横壁，一次分裂结束， 两个新细胞形成。 4、当两个新的细胞半球达到一定体积， 两个新的外壁带处于新的子细胞赤道 带附近时，又会在子细胞的赤道带下 出现新的凹陷，第二次分裂又开始了。 （四）细胞分裂 细胞两次分裂之间的间隔时间称为世代时间，简称代时。 代时包括两部分时间即染色体复制时间和细胞分裂时间。 影响代时的三个因素： a、染色体复制前的准备时间； b、染色体复制所需时间R； c、细胞分裂所需时间D。 染色体复制和
10、细胞分裂所需时间是固定的，因此代时的长短 主要取决于染色体复制前的准备时间。 当代时大于R时，说明染色体的复制是不连续的，当代时小 于R时，说明染色体在第一次复制完成前就开始了第二次 复制。 三、细菌的群体生长 细菌个体生长时间短，繁殖快，在生产实 践和科研中常以群体生长作为个体生长的 指标，研究细菌的群体生长理念具有实际 意义。 群体生长表现为细胞数目或群体细胞物质 的增加。 （一）、群体生长的测定方法（一）、群体生长的测定方法 描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况， 需选用不同的测定指标。需选用不同的测定指标。 1、微生物群体、微生物群体细
11、胞数目细胞数目的检测法的检测法 直接法直接法（血球计数板）（血球计数板） 间接法间接法（活菌计数法、（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法液体稀释法、膜过滤法） 2、微生物群体、微生物群体细胞物质细胞物质标测定法标测定法 直接法直接法( (干重法，堆体积法干重法，堆体积法) ) 间接法间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标） 原理：将原理：将1mm20.1mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小格，小格， 从中均匀分布地选取从中均匀分布地选取80或或100小格，计数其中的细胞小格，计数其中的细胞 数目，换算成单位体积中的细胞数。数目，换算成单位体积中的
12、细胞数。 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌 等，不适用于细菌等个体较小的细胞。等，不适用于细菌等个体较小的细胞。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率， 或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。 1.1.显微镜直接计数法显微镜直接计数法血球计数板法血球计数板法 . .血球计数板血球计数板 2.稀释培养法稀释培养法平板菌落计数法平板菌落计数法 操作：操作：将样品做一系列的稀释，从后三个稀释度中各取将样品做一系列的稀释，从后三个稀释度中各取 一定量的
13、菌液与溶化并冷却到一定量的菌液与溶化并冷却到45左右的琼脂培养基混合，左右的琼脂培养基混合， 经培养后对菌落计数。经培养后对菌落计数。 技术要求技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完完 成操作），严格无菌操作；成操作），严格无菌操作； 注意事项：注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀 处理，倾注平板时的培养基温度；处理，倾注平板时的培养基温度； 适用范围：适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生 长的微生物，长的微生物， 误差：误差：多次稀释造成的误差是主
14、要来源，其次还有由于多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于 样品内菌体分布不均匀、以及不当操作样品内菌体分布不均匀、以及不当操作 3.平板菌落计数法平板菌落计数法 平板菌落计数法平板菌落计数法 最常用的活菌计数法。 将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保 温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可 以计算出原菌液的含菌量。 直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50500为 宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数 原则，以平板菌落数在30300之间为报告依据。 9ml 9ml9ml9ml 1ml1ml1ml 1ml1ml1ml1ml 222 3.比浊法比浊法 原理是在一定
15、范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成 正比，与光的透过率成反比，因此，借助于分光光度计，正比，与光的透过率成反比，因此，借助于分光光度计， 在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的 浓度。浓度。 特点：快速、简便；但易受干扰。特点：快速、简便；但易受干扰。 4、测量群体细胞物质含量方法 细胞干重 测细胞的某一化学组成，如测DNA含量的 方法比较准确，但费时费力，操作困难。 测代谢产物，如测乳酸菌的乳酸产量、酵 母菌的乙醇产量等。 干重法干重法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然
16、后烘 干(干燥温度可采用105、100或80)、称重，一个细 菌细胞一般重约10-1210-13g。 该法适合菌浓较高的样品。该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养 物中细胞浓度达到210 9个/ml时，100ml培养物可得 1090mg干重的细胞。 （二）一次培养 是相对于连续培养而言的，又称为分批培养。在 一次培养中，细菌群体的生长规律可用细菌的生 长曲线来表示。 细菌的生长曲线将少量细菌接种于液体培养 基中，在适宜的条件下进行培养，定时取样测定 其菌数，以菌数的对数或生长速率为纵坐标，以 生长时间为横坐标绘制而成的曲线。 生长曲线代表了细菌从
17、开始生长、分裂直至死亡 的整个动态变化过程。 每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生 长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲 线划分为四个时期。 典型的生长曲线典型的生长曲线 （Growth curve） 延延 滞滞 期期 对对 数数 期期 稳定期稳定期衰亡期衰亡期 时期的划分：按照生长速率常数（时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同）不同 其它名称：停滞期、调整期、适应期、迟缓期其它名称：停滞期、调整期、适应期、迟缓期 1.现象：现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。活菌数没增加，曲线平行于横轴。 2.特点：特点： 生长速率常数生长速率常数= 0
18、细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长 细胞内细胞内RNA特别是特别是rRNA（核糖体（核糖体RNA）含量增高，原生质）含量增高，原生质 嗜碱性增强嗜碱性增强 合成代谢活跃（核糖体、酶类、合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱合成加快），易产生诱 导酶导酶 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化 学药物）学药物） 3.原因：适应新的环境条件，合成新的酶、辅酶，积累必要的中原因：适应新的环境条件，合成新的酶、辅酶，积累必要的中 间产物间产物 .延迟期（延迟期（lag phase） 菌种菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延
19、迟期一般较短；繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； 接种物菌龄接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延用对数生长期的菌种接种时，其延 迟期较短，甚至检查不到延迟期；迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：一般来说，接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除接种量增大可缩短甚至消除 延迟期（延迟期（发酵工业上一般采用发酵工业上一般采用1/10的接种量）；的接种量）； 培养基成分：培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上在营养成分丰富的天然培养基上 生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后接种后 培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发培养
20、基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发 酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。 影响延迟期长短的因素：影响延迟期长短的因素： . .对数期（对数期（logarithmic phase） 其他名称：指数期其他名称：指数期 现象：现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点：特点： 生长速率常数最大，即代时最短生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行细胞进行平衡生长平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致菌体大小、形态、生理特征等比较一致 代谢最旺盛，故，对数期的细胞常被
21、用来作为种子或科学研代谢最旺盛，故，对数期的细胞常被用来作为种子或科学研 究的实验材料。究的实验材料。 应用意义应用意义： 由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄； 生产上用作接种的最佳菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等遗传研究或进行染色、形态观察等的良好的良好 材料材料。 . 稳定期（稳定期（stationary ph
22、ase） 产生原因：产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（物化条件（pH、氧化还原势等）不合适。、氧化还原势等）不合适。 特点：特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡新增殖的细胞数与老细胞的死亡 数几乎相等，数几乎相等，微生物的微生物的生长速率处于动态生长速率处于动态 平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。 细胞分裂速度下降，开始积累内含物，细胞分裂速度下降，开始积累内含物， 产
23、芽孢的细菌开始产芽孢。产芽孢的细菌开始产芽孢。 此时期的微生物开始此时期的微生物开始合成次生代谢产物合成次生代谢产物， 对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期 产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。 应用意义：应用意义： 1 1）发酵产物生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生）发酵产物生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生 产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料）补充营养物质（补料） 调调pH pH 调整温度调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。）
24、稳定期细胞数目及产物积累达到最高。 生长产量常数（生长产量常数（Y，或生长得率，或生长得率，growth yield）： 概念：表示微生物对基质利用效率的高低概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重菌体干重/ 消耗营养物质的浓度消耗营养物质的浓度 根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量 如：如：Y=0.5Y=0.5，表示要得到，表示要得到5g5g菌体，需某营养物（葡萄菌体，需某营养物（葡萄 糖）糖）10g10g。 Y= x x0 C0 C = x x0 C0 . 衰亡期（衰亡期（decline phase） 产生原因：产生原因：生长条件的
25、进一步恶化，使细胞内的分解代谢大生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大 大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡 特点：特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数， 群体中的活菌数目急剧下降，出现群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽 孢开始释放。孢开始释放。 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自 溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌
26、落的趋势。溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条 件有关。件有关。 （三）连续培养（三）连续培养（continuous culture） 分批培养分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定：将微生物置于一定 容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。 不再补充和更换，最后一次性收获。（一次培养）不再补充和更换，最后一次性收获。（一次培养） 连续培养连续培养（continuous culture） ：在微生物培养：在微生物培
27、养 的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排 除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物 长时间地处于对数生长期。长时间地处于对数生长期。 原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时， 一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢 流方式流出发酵液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物流方式流出发酵液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物 就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。就能长
28、期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。 单批培养单批培养 恒浊法恒浊法 恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养时间时间 连续流入连续流入 新鲜培养液新鲜培养液 lg细胞数（个细胞数（个/ml） 连续培养连续培养 连续培养原理连续培养原理 连续发酵（连续发酵（continuous fermentation） 连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。 优点：优点： 高效，简化了操作高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制；自控：便于利用各种仪表进
29、行自动控制； 产品质量稳定产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于 单批培养。单批培养。 连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年，年， 常用于丙酮、丁醇的连续发酵上。常用于丙酮、丁醇的连续发酵上。 （四）同步培养 在分批培养中，即使在对数期，群体细胞 也不同时分裂，在此情况下，对微生物的 生长和生理特性的测定实际上是群体细胞
30、的平均值，不能完全代表单个细胞的情况。 若能使群体细胞处于同一生长阶段，则此 问题可得到解决。 由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着 技术上的困难。技术上的困难。 同步生长同步生长的概念：使不同生长阶段的群体细胞转变的概念：使不同生长阶段的群体细胞转变 成在同一时间都处于同一生长阶段的培养，称为同成在同一时间都处于同一生长阶段的培养，称为同 步生长（步生长（synchronous growth） ，进行同步分裂的细，进行同步分裂的细 胞称为胞称为同步细胞。同步细胞。 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一同步细胞群体在任何一时刻都处在细
31、胞周期的同一 相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞 学、生理学和生物化学等研究的良好材料。学、生理学和生物化学等研究的良好材料。 （四）、同步培养（四）、同步培养 获得同步生长的方法：获得同步生长的方法： 1、选择法：将处于不同生长阶段的细胞进行差异离心或通 过微孔滤膜，得到刚分裂的小细胞，再接种到新鲜培养基 上培养。 2、诱导法： a、控制温度：通过最适温度和最低生长温度的交替变化， 可使不同步的细菌变为同步生长的细菌。 b、控制培养基成分：将营养缺陷型在缺少生长因子的培养 基里饥饿一段时间后再转移到完全培养中培养。 c、控制光照时间：对光
32、合细菌可通过光照与黑暗的交替处 理而得到生长同步的细菌。 由此获得的同步微生物在繁殖几代后又会出现不同步现象， 因为群体中的个体差异是永远存在的。 第二节 影响微生物生长的环境因素 微生物在生长过程中受到各种环境因子 （包括物理因子、化学因子、生物因子） 的影响，本节着重讨论物理因子和化学因 子对微生物的影响，生物因子的影响将在 微生物生态一章中讨论。 一、物理因子对微生物生长的影响 物理因子: 温度 氧化还原电位 渗透压 表面张力 辐射等。 1、微生物生长的三个温度基点、微生物生长的三个温度基点 从微生物整体来看从微生物整体来看:生长的温度范围一般在生长的温度范围一般在-10 100 极端下
33、限为极端下限为-30 ，极端上限为，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物：但对于特定的某一种微生物： 只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有 自己的自己的生长温度三基点生长温度三基点，即，即最低、最适、最高生长温度最低、最适、最高生长温度 处于最适生长温度时，生长速度处于最适生长温度时，生长速度 最快，代时最短。最快，代时最短。 超过最低生长温度时，微生物不超过最低生长温度时，微生物不 生长，温度过低，甚至会死亡。生长，温度过低，甚至会死亡。 超过最高生长温度时，微生物不超过最高生长温度时，微生物不 生长，温度过
34、高，甚至会死亡。生长，温度过高，甚至会死亡。 （一）温度（一）温度 根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型三个类型： 2、微生物生长温度类型、微生物生长温度类型 v低温型微生物（嗜冷微生物）低温型微生物（嗜冷微生物） v中温型微生物（嗜中温微生物）中温型微生物（嗜中温微生物） v高温型微生物（嗜热微生物）高温型微生物（嗜热微生物） 低温型微生物低温型微生物: 最适生长温度在最适生长温度在520,主要分布在地球的两极、冷泉、主要分布在地球的两极、冷泉、 深海、冷冻场所及冷藏食品中。深海、冷冻场所及冷藏食品中。 例：假单孢菌中的某些嗜冷
35、菌在低温下生长，常引起冷例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷 藏食品的腐败。藏食品的腐败。 嗜冷微生物在低温下生长的机理，嗜冷微生物在低温下生长的机理，目前还不清楚，据目前还不清楚，据 推测有两种原因：推测有两种原因： 它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活 丧失细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保丧失细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保 持半流动状态，可以进行物质的传递。持半流动状态，可以进行物质的传递。 中温型微生物：中温型微生物： 最适生长温度为最适生长温度为2040 ，大多数微生物属于此类。，大多数微生物属于
36、此类。 室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中。 体温型主要为寄生，在人和动物体内。体温型主要为寄生，在人和动物体内。 高温型微生物：高温型微生物： 最适生长温度为最适生长温度为50 60 ,主要分布在温泉、堆肥和土壤主要分布在温泉、堆肥和土壤 中。中。 在高温下能生长的原因：在高温下能生长的原因： 酶蛋白以及核糖体有较强的抗热性酶蛋白以及核糖体有较强的抗热性 核酸具有较高的热稳定性（核酸具有较高的热稳定性（核酸中核酸中G+C含量高（含量高（tRNA），）， 可提供形成可提供形成 氢键，增加热稳定性氢键，增加热稳定性 ）。）。 细胞膜中饱和脂肪酸
37、含量高，较高温度下能维持正常的液细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液 晶状态。晶状态。 （二）渗透压 高于细胞渗透压的溶液称为高渗溶液； 低于细胞渗透压的溶液称为低渗溶液； 等于细胞渗透压的溶液称为等渗溶液。 大多数微生物对渗透压的波动不敏感，如产 气杆菌可在0.112%的盐分培养基内生长。 高浓度盐（1015%）和糖（5070%）能抑 制微生物的生长。 （三）（三）氧化氧化-还原电势还原电势(redox poyential) 代表氧化剂和还原剂的相对强度，用代表氧化剂和还原剂的相对强度，用Eh表示，以伏特计量。表示，以伏特计量。 氧分压高，则氧分压高，则Eh高；高；pH高，则高
38、，则Eh低。低。 各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求：各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求： 好氧微生物：好氧微生物：+0.3+0.4V,(在在0.1V以上的环境中均能生长以上的环境中均能生长). 厌氧微生物：只能在厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长以下生长 兼性厌氧微生物：兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、以上呼吸、+0.1V以下发酵以下发酵 对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度 培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、 半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。半胱氨酸、谷胱甘肽、
39、二硫苏糖醇等。 （四）表面张力 什么是表面张力促使液体表面收缩的力叫做表面张力。 表面张力是一种物理效应，它使得液体的表面总是试图获 得最小的、光滑的面积，就好像它是一层弹性的薄膜一样。 其原因是液体的表面总是试图达到能量最低的状态。 例如：衣服上的油渍，表面张力大，不溶于水，洗衣粉中 带有表面活性剂，能减少油渍的表面张力，使其溶于水， 这样才能用水把脏东西从衣服上洗掉。因为表面活性剂减 少了水的表面张力，水就容易起泡泡。 胆汁中的胆盐、胆固醇和卵磷脂都能作为乳化剂（表面活 性剂），可减小脂肪的表面张力，使脂肪裂解为脂肪微滴， 从而增加了胰脂肪酶的作用面积，使脂肪酶分解脂肪的作 用加速；胆盐达
40、到一定浓度后，可聚合成微胶粒，肠腔中 的脂肪分解产物可掺入到微胶粒中，形成水溶性复合物， 使原本不溶于水的脂肪分解产物可以通过肠上皮表面静水 层到达肠黏膜表面，这对于脂肪的消化产物的吸收具有重 要意义。 因此，胆汁能促进脂肪分解、产物的吸收，这是胆汁 的重要生理作用。 （四）表面张力 蒸馏水在25时的表面张力为72达因平方厘米， 液体培养基的表面张力约为4565达因平方厘 米。 高分子有机酸、醇、去污剂、肥皂、蛋白质和多 肽能降低水的表面张力，称为表面活性剂。 低的表面张力能影响微生物的形态、生长和繁殖。 如肺炎球菌和脑膜炎球菌在表面张力低于50达因 平方厘米是不能生长或自溶。 （五）、其他影
41、响因素 干燥 辐射 光照：对光合微生物的生长有明显影响， 但对光合微生物以外的大多数微生物不需 要光。 影响影响细胞膜的通透性、细胞膜的通透性、培养基中培养基中物质的溶解度物质的溶解度，进，进 而影响对物质的吸收能力。而影响对物质的吸收能力。 影响影响细胞表面的电荷分布细胞表面的电荷分布，从而影响微生物的生长，从而影响微生物的生长 速率。速率。 不同类型的微生物生长的不同类型的微生物生长的pHpH值范围值范围 二、化学因子对微生物生长的影响二、化学因子对微生物生长的影响 （一）氢离子浓度即（一）氢离子浓度即pHpH值值 微生物最低pH值最适pH值最高pH值 细菌355.57.5810 酵母菌3
42、5.06.08 霉菌125.06.078 （一）氢离子浓度（pH值） 微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但 是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或 超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值， 将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌 微生物种类最低pH最适pH最高pH 大肠杆菌
43、 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 一般放线菌 一般酵母菌 4.3 4.5 4.2 1.5 5.0 3.0 6.08.0 6.07.5 7.07.5 5.06.0 7.08.0 5.06.0 9.5 8.5 9.3 9.0 10 8.0 一些微生物生长的一些微生物生长的pHpH值范围值范围 （二）营养物质 有些微生物不能合成一种或几种生长因素， 在培养基中缺乏相应的生长因素时，则不 能生长，如固氮菌在培养基中含有化合态 氮时，则不能固氮；异养菌在不含有有机 物的培养基中不能生长。 微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群 中差异很大，根据微生物与氧的关系中差
44、异很大，根据微生物与氧的关系, ,可可 把它们分为几种类群把它们分为几种类群: : 好氧菌好氧菌: : 好氧菌好氧菌 微好氧菌：微好氧菌： 兼性厌氧菌兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌：耐氧厌氧菌： 厌氧菌厌氧菌 ( (专性专性) )厌氧菌：厌氧菌： （三）、氧气（三）、氧气 1、好氧菌（、好氧菌（strict aerobe） 必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧 作为最终氢受体，细胞含有超氧歧化酶（SOD，superoxide dismutase） 和过氧化氢酶。 在生长过程中不需要氧！ 对于严格厌氧菌来说，分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑 制其生长甚至致死。生命活动所需能量通
45、过发酵、无氧呼吸、循环光合 磷酸化或甲烷发酵提供；严格厌氧菌细胞内缺乏SOD和过氧化氢酶，不 能消除氧化产生的超氧基、OH自由基和过氧化氢，而这些物质在体内可 产生极大的毒害作用。 微好氧菌（微好氧菌（microaerophilic bacteria） 只能在较低的氧浓度（210%）才能正常生长，通过呼吸链并以 氧为最终氢受体而产能。 3、厌氧菌（、厌氧菌（anaerobe） 耐氧厌氧菌（耐氧厌氧菌（aerotolerant anaerobe） 可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需 要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵 获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过
46、氧化氢 酶。大多数乳酸菌是耐氧厌氧菌 3、兼性厌氧菌（、兼性厌氧菌（facultative anaerobe） 在有氧或无氧条件下以不同的代谢方式进行生长。如酵母菌 在有氧时进行有氧呼吸，在无氧时进行乙醇发酵；伊氏螺菌 和脱氮小球菌等硝酸盐还原细菌，在有氧的条件下进行有氧 呼吸，在无氧条件下以NO3-为最终电子受体进行无氧呼吸。 第三节 抑菌、灭菌和化学治疗 防腐或抑菌：阻止或抑制微生物生长的方 法。 消毒：消除物品上病原微生物的方法。 灭菌：杀灭物品上所有微生物的方法。 抑菌只是抑制微生物的生长，并不一定把 它杀死，消毒和灭菌都必须把微生物杀死， 消毒后的物品上不应有病原微生物的存活， 但可
47、以有其他微生物的存活，灭菌后的物 品上不应有任何微生物的存活。 1 1、高温灭菌（消、高温灭菌（消 毒）法毒）法是最常是最常 用的物理方法。高用的物理方法。高 温可引起蛋白质、温可引起蛋白质、 核酸等活性大分子核酸等活性大分子 氧化或变性失活而氧化或变性失活而 导致微生物死亡。导致微生物死亡。 一、抑菌、灭菌的物理因子一、抑菌、灭菌的物理因子 火焰灼烧法 烘箱热空气灭菌法 干热灭菌法 巴氏消毒法 煮沸消毒法 间歇灭菌法 高压蒸汽灭菌法 湿热灭菌（消毒）法 高温灭菌（消毒）法 （一）温度（一）温度 高温灭菌 致死时间在某一温度下杀死细胞所需 要的最短时间。 致死温度在一定时间内（一般为10分 钟
48、）杀死细胞所需要的最低温度。 在同一温度下，湿热杀菌力比干热杀菌力 要强，如肉毒棱状芽孢杆菌在干热条件下 的致死温度为18010分钟，湿热条件下为 121 10分钟。 各种灭菌方法比较各种灭菌方法比较 干热灭菌法（干热灭菌法（dry heat sterilizationdry heat sterilization） 焚烧灭菌法（焚烧灭菌法（incinerationincineration）：）：是将被灭菌物品在火焰中 燃烧，使所有的生物质碳化。此法灭菌彻底、迅速、简单可靠，但 对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌如污染物 品、实验后的动物尸体，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、
49、 试管或三角瓶口的灭菌等。 干热灭菌法干热灭菌法(hot-air oven)(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温 至150170 ，维持12小时。适用于玻璃器皿、陶瓷和金属 等耐热物品的灭菌，是实验室常用的灭菌方法。此法不适合液体样 品、橡胶类物质的灭菌。 特点：特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以 温度高、时间长。 操作要点：操作要点：视情况可适当延长时间；灭菌温度不得超过180 ， 当温度降致60 以下时方可打开箱门。 湿热法湿热法(moist heat sterilization)(moist heat sterilization) ： 特点：温
50、度低、时间短、灭菌效果高特点：温度低、时间短、灭菌效果高 原因：原因： 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低；菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热；蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强；饱和水蒸汽穿透力强； 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。性，主要破坏氢键结构。 常用的湿热灭菌法有四种常用的湿热灭菌法有四种 湿热灭菌法一 煮沸消毒法煮沸消毒法 物品在水中加热至物品在水中加热至100，煮沸，煮沸15min 30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，可杀死所有营养细胞和部分芽孢， 达到消毒物的目的
