1、化学毕业论文化学毕业论文 女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探目录目录摘要摘要.关键词关键词.AbstractAbstract. KeywordsKeywords. 前言.11 实验材料、试剂及仪器.21.1 实验材料. 21.2 仪器.21.3 试剂.22 实验方法.22.1 女贞树根的采集与预处理.22.2 女贞树根黄酮的提取及其定性检验.22.2.1女贞树根黄酮的提取.32.2.2提取液的定性检验.32.3 芦丁标准溶液的配制和标准曲线的绘制. 32.3.1芦丁标准溶液的配制.32.3.2测定方法依据. 32.3.3 芦丁标准溶液最大吸收波长的
2、测定. .32.3.4芦丁标准曲线的绘制.32.4 单因素实验. 32.4.1 乙醇浓度的选择. 32.4.2 料液比的选择. 42.4.3 回流提取温度的选择.42.4.4 回流提取时间的选择.42.5 正交实验. 42.6 比较提取液、芦丁溶液、BHT 溶液对羟基自由基的清除.43.实验结果与分析. 53.1 女贞根黄酮提取液的定性检验.53.2 芦丁和女贞根黄酮提取液最大吸收波长的测定.53.3 标准曲线的绘制及其线性回归方程.53.4 单因素实验. 53.4.1 乙醇浓度的选择. 63.4.2 料液比的选择. 73.4.3 回流提取温度的选择.83.4.4 回流提取时间的选择.93.5
3、 正交实验. 93.6 比较提取液、芦丁溶液、BHT 溶液对羟基自由基的清除.104.结论.11参考文献.12致谢.13I女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探摘要摘要：采用乙醇回流法提取女贞树根中的黄酮，以乙醇浓度、提取温度、提取时间、液料比为考察因素，对女贞树根黄酮的提取工艺进行单因素及正交实验，并探究了提取液清除羟基自由基。结果表明，乙醇回流法提取女贞树根中黄酮的最佳条件为：乙醇浓度 70%，温度 75，料液比 1:15（g/mL） ，提取时间 2.5h，此条件下黄酮提取得率为 3.32%。同体积不同浓度的女贞根黄酮提取液与芦丁溶液和 BHT 溶
4、液清除羟基自由基的能力，在 70200ug/mL 浓度范围内，强弱顺序为芦丁溶液女贞根黄酮提取液BHT 溶液，表明在 70200ug/mL 浓度范围内，女贞根黄酮提取液能较好的清除羟基自由基。关键词关键词：女贞树根；黄酮；提取；清除羟基自由基IIFlavonoids and their scavenging of privet rootsAbstract:The flavonoids in the ethanol reflux method to extract privet roots, ethanol concentration,extraction temperature, extrac
5、tion time, liquid feed ratio for the investigated factors privet roots flavonoidsextraction process of a single factor and orthogonal experiments, andexplore extract Clear the hydroxylradical. The results showed that the extract privet roots, ethanol reflux method flavonoids: 70% of theethanol conce
6、ntration, temperature 75 C, the solid-liquid ratio of 1:15 (g / mL), extraction time 2.5 h,flavonoids mentioned under this condition achieved was 3.32%. The same size but different concentrationsof privet root flavonoid extract and rutin solution and BHT solution to remove the ability of the hydroxy
7、lradical, 70 200ug/mL concentration range, the strength of the order of rutin solution privet rootflavonoids extract BHT solution, indicating that at 70 200ug/mL concentration range, the privet rootflavonoid extract better scavenging.Keywords: privet roots; flavonoids; extract; scavenging1女贞树根中黄酮提取及
8、其清除羟基自由基初探女贞树根中黄酮提取及其清除羟基自由基初探前前言言黄酮类化合物（flavonoes compounds）泛指两个苯环(A 与 B)通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物1。 黄酮类化合物广泛存在于植物中,而且生理活性多种多样,在花、 叶、 果等组织中,一般多以苷的形式存在2。黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化，抗衰老，抗菌，抗肿瘤等，此外，黄酮类化合物还具有降压、降血脂增加冠脉流量、强心、抗心律不齐等药理作用3。女贞（L igu strum lucidum）是木犀科女贞属常绿乔木, 广泛分布于亚洲国家。查阅相关资料，知目前提取黄酮的方法有水提法有机溶剂提取法碱性水或
9、碱性稀醇提取法微波提取法超声波提取法酶解法超临界流体萃取法双水相萃取分离法4。有研究表明用乙醇水溶液提取女贞子中的黄酮，浸出率高, 且能够回收乙醇,极大降低了成本5。故本实验采用乙醇水溶液提取女贞根中黄酮含量的提取。刘晓庚等对女贞果实进行了抗氧化性研究6，但对女贞根中黄酮类化合物的提取及清除羟基自由基研究尚未有报道，为了充分利用女贞资源，本论文从两方面进行探究：一通过单因素及正交实验，确定最佳提取条件；二初步探究女贞根黄酮提取液清除羟基自由基的能力，为进一步开发和利用作一些参考。21 1 实验材料、试剂及仪器实验材料、试剂及仪器1.11.1 实验材料实验材料女贞树根（采集于楚雄师院老校区实验室
10、后）1.21.2 仪器仪器仪器：722-S 型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司） ；HH-S2S 恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂） ；CP214C 电子天平（奥豪斯仪器有限公司制造） ； SHZ-A 型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司） ；新型密封式粉碎机（广州市大祥电子机械设备有限公司） ；回流冷凝装置。1.31.3 试剂试剂芦丁（USP） 、BHT、无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、三氯化铁、三氯化铝、浓盐酸、锌粉、水杨酸、过氧化氢（30%） （以上均为国产分析纯） ，实验室自制的蒸馏水和超纯水。2 2 实验方法实验方法2.12.1 女贞树根的采集与预处理女贞树根
11、的采集与预处理女贞根洗净晒干粉碎2.22.2 女贞树根黄酮的提取及其定性检验女贞树根黄酮的提取及其定性检验2.2.1 女贞树中根黄酮的提取称取 3.0g 女贞根粉置于 100mL 的圆底烧瓶中， 加入 60mL70%的乙醇溶液， 在 80的恒温水浴锅中回流 2h，过滤，用 70%的乙醇溶液反复洗涤圆底烧瓶，将滤液定容至 100.00mL，制得提取液。2.2.2 提取液的定性检验（1）盐酸镁粉反应：取 1.0mL 提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸 5 滴，观察其泡沫颜色。若提取液中含有黄酮类化合物，则显橙红色7。（2）三氯化铝反应：用胶头滴管滴 3 滴提取液在滤纸上，滴加 2 滴 1%
12、的三氯化铝乙醇溶液，观察颜色变化。若提取液中含有黄酮类化合物，则显黄色7。（3）三氯化铁反应：用胶头滴管滴 3 滴提取液在白色点滴板上，加 2 滴 1%的三氯化铁乙醇溶液，观察颜色变化。若提取液中含有黄酮类化合物，则显墨绿色7。（4）氢氧化钠反应：用胶头滴管滴 3 滴提取液在滤纸上，滴加 2 滴 4%的氢氧化钠溶液，观察颜色变化。若提取液中含有黄酮类化合物，则显黄色7。32.32.3 芦丁标准溶液的配制和标准曲线的绘制芦丁标准溶液的配制和标准曲线的绘制2.3.1 芦丁标准溶液的配制将芦丁置于干燥箱中，在 120下干燥 1.5h，冷却后准确称取芦丁标准品 10mg，用 70%的乙醇溶液溶解，并定
13、容至 50.00mL,制得浓度为 0.20mg/mL 的芦丁溶液。2.3.2测定方法依据以芦丁标准液为对照品测定女贞树根中总黄酮的提取得率，黄酮与 Al3+进行络合反应，在碱性条件形成络合物8，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰，吸光度值与黄酮浓度服从朗伯比尔定律，可通过比色法进行测量9。2.3.3 芦丁标准溶液最大吸收波长的选择用移液管精确移取芦丁标准溶液 0.50mL,置于 25.00mL 的比色管中， 加入 0.30mL 5%的亚硝酸钠溶液,混匀，放置 6min；再加入 0.30mL 10%的硝酸铝溶液，混匀，放置 6min；再加入 4.00mL 4%的氢氧化钠溶液，混匀，放置 6min；
14、再用浓度为 70%的乙醇定容至 10.00mL，摇匀，放置 6min 后，以试剂空白做参比，在 450570nm 的波长范围内，每隔 10nm 测定吸光度,确定最大吸收波长（此后的吸光度均在该波长下测定） 。用同样的方法测定女贞根黄酮提取液的吸光度。2.3.4 芦丁标准曲线的绘制精确吸取芦丁标准溶液 0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.503.00 mL 于 7 支 25.00mL 的比色管中，显色方法同 2.3.3，在波长为 510nm 处测定吸光度（以第一支为空白溶液）。以芦丁溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2.42.4 单因素实验单因素实验2.4.1 乙
15、醇浓度的选择各称取 3.0g 女贞根粉置于 5 个 100mL 的圆底烧瓶中，分别加入 60mL 不同浓度的乙醇溶液，在80的恒温水浴锅中回流 2h， 过滤， 用相应浓度的乙醇溶液反复洗涤圆底烧瓶， 滤液定容至 100.00mL。然后用移液管精确移取女贞根黄酮提取溶液 0.50ml,置于 25.00mL 的比色管中，显色方法同 2.3.3，在波长为 510nm 处测定吸光度，平行实验三组。再把吸光度值带入芦丁标准曲线的线性回归方程，计算出提取液的黄酮浓度。最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。总黄酮提取得率的计算公式：提取得率（CnV）m100%其中：C 为稀释以后提取液的浓度(mg/mL)，n
16、为稀释倍数，V 为提取液定溶后的体积(mL)，m为样品质量（mg） 。42.4.2 料液比的选择各称取 5 份不同质量的女贞根粉置于 5 个 100mL 的圆底烧瓶中，分别加入 60mL70%的乙醇溶液在，80的恒温水浴锅中回流 2h，提取液的处理方法同 2.4.1，显色方法同 2.3.3，在波长为 510nm处测定其吸光度，平行实验三组，最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。2.4.3 回流提取温度的选择称取 3.0g 女贞树根粉置于 5 个 100mL 的圆底烧瓶中圆底烧瓶中， 分别加入 60mL70%的乙醇溶液在不同温度下恒温提取 2h,提取液的处理方法同 2.4.1，显色方法同 2.3.3
17、，在波长为 510nm 处测定其吸光度，平行实验三组，最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。2.4.4 回流提取时间的选择称取 3.0g 女贞树皮粉置于 5 个 100mL 的圆底烧瓶中圆底烧瓶中圆底烧瓶中， 分别加入 60mL70%的乙醇溶液， 在80的恒温水浴锅中回流不同的时间， 提取液的处理方法同2.4.1， 显色方法同2.3.3，在波长为 510nm 处测定其吸光度，平行实验三组，最后计算出女贞树根总黄酮提取得率。2.52.5 正交试验（四水平三因素）正交试验（四水平三因素）在单因素实验基础上，进行 L9（34）正交实验，确定最佳提取条件。2.62.6 比较提取液、芦丁溶液、比较提取液、芦
18、丁溶液、BHTBHT 溶液对羟基自由基的清除溶液对羟基自由基的清除参照Fenton反应的方法建立反应体系模型。利用H2O2与亚铁离子反应生成OH自由基，即Fe2+H2O2Fe3+OH+OH-，由于自由基一般存活时间比较短，而且具有较高活性的特点，水杨酸能有效的捕捉OH 自由基且产生有色产物10，该产物在波长为510nm处有强吸收，若加入具有清除OH功能的黄酮类化合物时，黄酮类化合物便会与水杨酸竞争OH，从而使有色产物生成量减少11。采用固定反应时间法，在波长为510nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，通过计算便能得出被测物对OH的清除率。反应体系为：在 10mL 比色管中加入 2
19、.00mL 9mmol/L 的 FeSO4溶液，2.00mL 9mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液，2.00mL 8.8mmol/L 的 H2O2启动反应，最后分别加入 1.00mL 不同浓度的的提取液，加蒸馏水定容，让反应体系在 37的水浴中反应 30min，以蒸馏水为参比，以试剂空白作比较，在 510nm处测定吸光度，考虑到提取液本身的吸光度，在 10mL 比色管中加入 2.00mL 9mmol/L 的 FeSO4溶液，2.00mL 9mmol/L 的水杨酸-乙醇溶液，不同浓度的提取液，加蒸馏水定容，让反应体系在 37的水浴中反应 30min,作为提取液的本底吸收。均重复实验三次，以 1.0
20、0mL 不同浓度的芦丁溶液和 BHT（二丁基羟基甲苯）溶液作为对照，比较清除羟自由基的能力。清除率计算公式:OH 清除率/%=A0-(Ax-Ax0)/A0100%5式中：A0为空白对照溶液吸光度；Ax为提取液吸光度；Ax0为不加 H2O2提取液的本底吸光度。3 3 实验结果与分析实验结果与分析3.13.1 女贞根黄酮提取液的定性检验女贞根黄酮提取液的定性检验按 2.2.2 所述的内容进行实验，结果如表 3-1 所示：表表 3-13-1 女贞根黄酮提取液的定性检验结果女贞根黄酮提取液的定性检验结果反应盐酸镁粉反应三氯化铝反应三氯化铁反应氢氧化钠反应现象橙红色淡黄色墨绿色淡黄色表 3-1 中女贞根
21、提取液与各物质反应产生的现象和黄酮类化合物与这些物质反应产生的现象相吻合，表明女贞根提取液中含有黄酮类化合物。3.23.2 芦丁标准液和女贞根黄酮提取液最大吸收波长的测定芦丁标准液和女贞根黄酮提取液最大吸收波长的测定按 2.3.3 所述的内容进行实验，测定的吸光度结果如图 3-1 所示：4404604805005205405605800.040.050.060.070.080.090.100.110.120.13吸光度波 长 （ nm） 芦丁 女贞根黄酮图 3-1 芦丁和女贞根黄酮的吸收曲线从图 3-1 可看出， 芦丁溶液和女贞根黄酮提取液在波长为 510nm 处有最大吸收峰， 故选择 510
22、nm为最大吸收波长，此后吸光度均在该波长下测定。3.33.3 芦丁标准曲线及其线性回归方程芦丁标准曲线及其线性回归方程按 2.3.4 所述的内容进行实验，在 510nm 处测定其结果如表 3-2 所示：6表表 3-23-2 芦丁浓度与吸光度的关系芦丁浓度与吸光度的关系浓度C（mg/mL） 0.000.010.020.030.040.050.06吸光度 A0.000.1090.2180.3250.4430.5610.666以表 3-2 中芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制得的标准曲线如图 3-2 所示：0.000.010.020.030.040.050.06-0.10.00.10.20.30
23、.40.50.60.7吸光度浓 度(mg/mL) 吸光度图 3-2 芦丁标准曲线根据标准曲线得线性回归方程：A= 11.16786 C -0.00332，相关系数 R = 0.99986，结果表明，芦丁溶液在 0.00 0.06 mgmL 范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系。3.43.4 单因素实验单因素实验3.4.1 乙醇浓度的选择按 2.4.1 所述内容进行实验，在 510nm 处测不同浓度的乙醇提取女贞根中总黄酮，其提取得率如图 3-3 所示：750607080901.82.02.22.42.62.8提取得率（ %）乙醇浓 度（ %）图3-3乙醇浓度与吸光度的关系由图3-3可以看出
24、，当其他影响因素一定的条件下，女贞根中黄酮提取得率随乙醇浓度的增大而增大，当乙醇浓度到达70%时提取得率最大，此后随着乙醇浓度的增大，女贞根中总黄酮提取得率反而减小。这主要是由黄酮类物质的相对极性决定的，黄酮类化合物一般具有酚羟基和糖苷链，有一定的极性和亲水性，用较大极性的溶剂提取效果较好。另外，大量的水有效地膨胀了女贞根组织，增大了溶质与溶剂的接触面积， 降低了溶剂的黏度， 加速了溶质的扩散。 当乙醇体积分数超过70 时，高浓度的乙醇反而会导致女贞根细胞膜性状改变而使得总黄酮难以从细胞中提出，从而导致黄酮提取得率降低12。选择浓度为70%的乙醇为宜。3.4.2 料液比的选择按 2.4.2 所
25、述内容进行实验，在 510nm 处测不同料液比提取女贞根中总黄酮，其提取得率如图3-4 所示：81:101:121:151:201:302.32.42.52.62.72.82.9提取得率料液比 (mg/mL)图 3-4 料液比与吸光度的关系由图3-4可以看出，当其他影响因素一定的条件下，女贞树根总黄酮提取得率随料液比的增大而增大，当料液比达到1:20（mg/mL）时提取得率最大，此后提取得率缓慢减小，这可能是当提取剂的量（60mL）一定的情况下，随和加入的女贞根粉增多，女贞根粉的溶解达到平衡，故此后提取得率逐渐减少。3.4.3 提取温度的选择按 2.4.3 所述内容进行实验，在 510nm 处
26、测不同温度提取女贞树根中总黄酮提取得率，其结果如图 3-5 所示：6065707580851.41.51.61.71.81.92.02.1提取得率（ %）提取温度（ ）图 3-5 提取温度与提取得率的关系由图3-5可以看出，当其他影响因素一定的条件下，女贞树根总黄酮提取得率随提取温度的升高而增大，当温度达到80时提取得率最大，此后随着温度的升高，女贞树根总黄酮提取得率反而减小。这是因为在适当的温度范围内，黄酮类化合物在乙醇中的溶解度随温度的升高而增大，9故提取得率增大13，但是温度过高，一些蛋白质、糖类等物质大量溶出,导致提取液粘性加大，杂质溶出量增加，从而导致提取率下降5，故选择80为回流提
27、取温度较为适宜。3.4.43.4.4 回流提取时间的选择回流提取时间的选择按 2.4.4 所述内容进行实验，在 510nm 处测不同回流时间提取女贞树根中总黄酮提取得率如图3-6 所示：0.51.01.52.02.53.03.51.881.901.921.941.961.982.002.022.042.06提取得率（ %）回流 提取时 间（ h）图 3-6 提取时间与提取得率的关系由图3-6可以看出，当其他影响因素一定的条件下，女贞树根总黄酮提取得率随提取时间的增加而增大，当提取时间达到2.0h时提取得率最大，此后随着时间的延长提取得率反而减小。这可能是由于提取时间过长,造成了部分黄酮糖苷类物
28、质的水解,导致黄酮检出量减少,从而提取率下降5，因此选择2.0h的提取时间较为适宜。3.53.5 正交实验正交实验按2.5所述进行L9(34)正交实验，正交因素水平表如表3-2所示：表3-2正交因素水平表水平A乙醇质量分数（%）B提取温度（）C料液比（g/mL ）D提取时间（h）160651:151.5270701:202.0375751:302.5按 L9(34)进行正交实验，所得结果如表 3-3 所示10表3-3正交实验提取黄酮的结果序号A温度（）B时间（h）C乙醇浓度（%）D料液比(g/mL) E提取得率（%）1751.5601:152.982752.0701:203.143752.58
29、01:302.664801.5701:302.305802.0801:152.656802.5601:202.997851.5801:202.348852.0601:302.109852.5701:153.23K12.9272.5402.6902.953K22.6472.6302.8902.823K32.5572.9602.5502.353R0.3700.4200.3400.600由表 3-3 可以看出，乙醇回流法提取女贞树根的黄酮中料液比的影响最大，其次是时间，再次是温度，最后是乙醇浓度，最佳提取条件为 A1B3C2D1，即温度 75，提取时间 2.5h，乙醇浓度 70%,料液比 1:15（
30、g/mL） 。在最佳提取条件提取女贞树根中的黄酮，平行测定三次，所得的总黄酮提取得率如表 3-4 所示：表表3-43-4最佳提取条件平行测定结果最佳提取条件平行测定结果序号黄酮提取得率（%）平均黄酮提取得率（%）13.4223.253.3233.28由表 3-4 可得在最佳提取条件下提取女贞树根中的黄酮，其提取得率为 3.32%。3.63.6 比较提取液、芦丁、比较提取液、芦丁、BHTBHT 对羟基自由基的清除对羟基自由基的清除11按2.6所述内容进行实验，提取液、芦丁、BHT对羟基自由基的清除结果如图3-7所示：050100150200010203040清除率（ %）浓 度（ ug/mL）
31、芦丁溶液清除率 提取液清除率 BHT溶液清除率图 3-7 芦丁，女贞根黄酮提取液，BHT 溶液，芦丁溶液对羟基自由基的清除率由图 3-7 可以看出，同体积不同浓度的女贞树根提取液与芦丁溶液和 BHT 溶液，在 070ug/mL的浓度范围内， 清除羟基自由基能力的强弱顺序为芦丁溶液BHT 溶液女贞根黄酮提取液； 在 70200ug/mL 的浓度范围内，清除羟基自由基能力的强弱顺序为芦丁溶液女贞根黄酮提取液BHT 溶液，表明在此浓度范围内，女贞根黄酮提取液能较好的清除羟基自由基。4 4 结论结论实验研究表明， 采用乙醇回流提取女贞树根中的总黄酮， 最佳提取条件为： 温度 75， 时间 2.5h，乙
32、醇浓度 70%,料液比 1:15（g/mL） ，在该条件下女贞树根中黄酮的提取得率为 3.32%。同体积不同浓度的女贞树根提取液与芦丁溶液和 BHT 溶液，在 70200ug/mL 的浓度范围内，清除羟基自由基能力的强弱顺序为芦丁溶液女贞根黄酮提取液BHT 溶液，表明在此浓度范围内，女贞根黄酮提取液能较好的清除羟基自由基。12参考文献参考文献1肖崇厚,杨松松,洪筱坤等.中药化学(第二版)M.上海科学技术出版社.2文廷刚,杜小凤,郭宇等.女贞子总黄酮的测定及其提取工艺J.江苏农业科学,2008（2）:186-188.3魏朝良,于德红,安利佳等.黄酮类化合物及清除自由基机制的探讨.中成药,2005
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