1、硬件篇硬件篇 安捷伦高效液相色谱仪1200由几部分组成,脱气机,泵、进样器、柱温箱和检测器。安捷伦1200HPLC系统采用积木式堆积结构,方便用户按照自己的需要配置不同的的系统,整个系统的流路自上而下设计、连接,减小了系统的死体积和延迟体积。Agilent 1200HPLC系统堆叠方式脱气机 安捷伦1200系列在线脱气机有,微量真空脱气机G1379B、标准真空脱气机G1322A。原理基本相同,就是使用半透膜管路,允许气体分子通过,液体分子无法通过。A型用的是微渗管,B型用的是滤膜。流路A型是左进右出,而B型为下进上出,本科室使用的为A型G1322A。使用真空脱气机可以降低噪声,保证保留时间的重
2、现性,与He脱气相比,更方便,更节省费用。 泵安捷伦1200系列泵有:单元泵:G1310A、四元泵:G1311A、二元泵:G1312A、二元泵SL型:G1212B。 单独一个泵腔泵腔无法满足溶剂传输系统的要求:连续性、稳定性都不符合标准,现在新购仪器中已很少考虑。单元泵,按溶剂的传输系统有两种,一种是并联柱塞泵,另一种是串连柱塞泵。并联柱塞泵由于两个泵的相位不同,可以补偿流量脉冲,但由于单向阀的数量增多,所以容易造成泄漏,增加了维护使用的难度。串连柱塞泵左泵腔的活塞运动速度为右泵腔活塞的2倍,因此,相同时间内,左泵提供的流量为右泵的两倍,左泵提供的溶剂一半直接供给系统,另一半被右泵吸入,稍后供
3、给液相系统,减少了单向阀的用量,可以使用压缩因子补偿。四元泵,其实就是比单元泵多了四元比例阀。由单元泵可以升级到四元泵,除了要加上四元比例阀外,还要更换主板。需要注意的是,当使用盐溶液和有机溶剂时,建议将盐溶液接到四元比例阀下面的通道上,有机溶剂接到上面的通道上。如果经常使用盐溶液,建议定期用水冲洗所有的通道以去除阀口上可能出现的盐沉淀。二元泵,有两个泵头,特点是高压混合,无需脱气;对于有强紫外吸收的流动相,使用静态混合器可以降低基线噪声;可以选择溶剂切换阀自动进行溶剂切换;对于高盐流动相,可选择泵头密封垫清洗装置。所以脱气机不是标准配置,但增加真空脱气机,流量范围可以从0.55ml/min扩
4、展至0.055ml/min;加入静态混合器,使流动相混合更加均匀;如果配置溶剂切换阀,则两个泵头可分别控制两种溶剂,类似四元比例阀,但并不完全一样,只能同时混合两种溶剂,不可实现四种溶剂的同时使用。 二元泵为高压泵,为后混合式,精度更高,而且由于为高压混合,产生的气泡也更少,所以价格也比四元泵贵得多。四元泵为低压泵,流速稳定性相对较差,低压混合容易产生气泡,在实验中常会遇到这样的问题,多元混合中出现流动相不稳定的现象,特别是流动相配比较低的如小于1%,其多元混合效果难以达到我们的要求,造成保留时间漂移,甚至得不到我们预期的色谱峰。明白四元泵的低压混合的道理,实际操作中我们发现问题时,有助于我们
5、对原因的分析。 必要时泵可以拆御,更换密封垫及滤芯。对容易出故障部位及处理方法,比如宝石活塞杆是不能超声的部件,泵头密封垫要成对更换,实验室中至少应备有一付室中至少应备有一付4号泵头密封号泵头密封垫,部件号为:垫,部件号为:5663-6589(用于反相色谱);(用于反相色谱);0905-1420(用于正相色谱)。同时实验室应备(用于正相色谱)。同时实验室应备有有5-10个个PTFE过滤芯,以备日常所需。判断过滤芯,以备日常所需。判断方法为,打开冲洗阀,以水为溶剂,流速方法为,打开冲洗阀,以水为溶剂,流速5ml/min,系统压力大于,系统压力大于10bar就应更换过滤白就应更换过滤白头了。头了。
6、进样器,安捷伦1200系列进样器有:标准自动进样器G1329A、高性能进样器G1367A、高性能进样器SL型G1367B、手动进样器G1328B。 自动进样器的特殊功能,洗针功能可以把样品残留降低到最小限度;多次吸液用于进样量大于100l的情况;程序进样可以非常灵活地执行用户的进样程序要求,如多种样品自动混合,自动进样等高级功能的自由设置,但是,由于进样针的扩散,所以进样量越小,受到扩散的影响也越大,所以自动混合的准确度还是难以达到容量瓶的混合方式。这在做标准由线时得注意的问题,如为定量则不推荐小样量的混合方式。 程序进样方式设置如下图:对于手动进样器,必须了解六通阀的工作原理,应特别注意的是
7、进样量少于定量环的50%或大于定量环的3-5倍量是比较准确的,不过,大家用自动进样器已经习惯了,如果再用回手动进样器会不会有些郁闷?会不会有一种坐惯了宝马又要回到踩单车的感觉? 柱温箱,使用安捷伦柱温箱可以保证柱的稳定性,从而保证了保留时间的重现性。恒定的柱温特别是日温差大的时候更为必要。 检测器,安捷伦1200系列检测器有,可变波长检测器G1314B、二极管阵列检测器G1315B、二极管阵列检测器SL型G1315C、示差折光检测器G1362A、荧光检测器G1321A。本所用的是VWD的G1314B型,DAD型及FLD的就不多说了。对VWD型检测器应了解它的工作原理,氘灯的使用维护及更换。需要
8、注意的是,使用中不要频繁的开关氘灯,否则影响氘灯的寿命。 可以利用诊断方式来检测氘灯的能量,当然,发现氘灯能量降低时不要马上得出氘灯应该更换的结论,这也许是流通池脏或有气泡造成的能量降低,所以必须用诊断方式检测流通池。诊断结果大于0.6说明流通池很干净,小于0.2则说明流通池该清洗了。更换氘灯后要在诊断日志中填写更换氘灯,这样氘灯的使用时数便从零开始。 这里还有一点得注意的是流通池的后压力非常重要,一定要使用适当出口连接管,出口管线要使用专用废液管为系统提供适当的后压,不得私自将废液管截短,以防气泡进入流通池。但如果压力过高,流通池的石英窗片可能破裂。 在这里我要说的是,对安捷伦1200高效液
9、相色谱仪正确的操作方法和定期的维护保养的是很重要的。软件篇软件篇 软件部分,这就是1200液相色谱仪的化学工作站。本所安捷伦1200高效液相色谱仪工作站软件版本为B.02.01,现在新的版本为B.03-01的了,但这没有太多的差别,新版本增加的只是一部分我们很少用到的高级功能。 在这里我就和大家一起讨论一些日常使用中遇到的细节问题,也许是我们使用过程中所容易忽略也容易造成操作问题的。 软件方面从数据采集,数据分析至报告格式及打印。 首先我们应该了解,脱机区别于联机是不能对仪器进行控制,不能运行诊断。 数据采集中主要是分析方法和运行控制,这是我们操作中常用的。方法的的概念,方法是一个参和集,它包
10、括分析一个样品所需要的所有参数:数据采集参数、数据分析参数及命令或宏指令等内容。方法的组成:1、方法信息;2、仪器/采集参数;3、数据分析参数;4、运行时选项表。 我想对方法的编辑大家应该都比较常用和熟悉的了,在这里我选一些也许大家不太注意的说一说吧。编辑方法仪器中,方法编辑选项里有四个可选项,1、方法信息(M);2、仪器/采集(I);3、数据分析(D);4、运行时选项表(R)。首先选择所要编辑方法哪一部分内容。需要注意的是,不选择某一部分内容,并不意味着方法中不含有该部分内容,而仅仅意味着本次对该部分内容不进行编辑,使用原方法中设置的参数。还有,仪器参数设置四元泵的参数设置。1、停止时间:是
11、仪器停止采集数据的时间,并不是泵停止工作的时间。本例中工作站仅采集010分钟的色谱图,10分钟后,不再采集数据,但泵仍然继续工作,向系统提供流动相。使用自动进样器 时一定要设置适当的停止时间,以保证连续进样的要求;2、后运行时间:是指一次运行结束后,到第二次进样前的等候时间,该时间用于系统为第二次进样做好准备。例如:将不感兴趣的杂质冲洗出色谱柱,或等待系统中的流动相真正变成下一次进样的初始比例。做梯度洗脱时,一定要设置该数值;3、压力限: 压力的上下限也要合理设置。压力上限不要高于柱子能够承受的压力最大值,一般比正常分析压力高20bar左右;而压力下限的数值一般比正常分析压力低20bar左右;
12、4、时间表:此处可以编辑梯度洗脱程序,规定溶剂比例变化方式。要注意程序时间与停止时间和后运行时间之间的协调关系。单元泵的参数设置界面与四元泵相比少了溶剂选择项,参数设置的要求与四元泵参数设置要求相同,只是此时只有一种溶剂可供选择,也无法进行梯度洗脱实验。二元泵的参数设置要求与四元泵参数设置要求相同,只是此时只有A、B两种溶剂可供选择。二元泵SL的参数设置可以在溶剂类型处的列表中选择本次使用的溶剂,并写入对溶剂描述。 系统将根据你所选择的溶剂自动进行溶剂压缩因子补偿,保证流量、比例更加精确。当选择“使用高级压缩因子校正”选项时,将按照各个方法中泵参数部分选择的溶剂的对应的压缩因子来控制泵,进而保
13、证流动相的流量和比例更加精确。有一个问题,就是在数据采集完毕洗柱的时候是不用开灯的,但如果强行关灯则方法运行时会报错,会提示仪器没有准备就绪。怎么办呢,在方法的运行时选项表中有“运行前命令/宏”和“运行后命令/宏”,我们可不可以在“运行前命令/宏”中设置把灯关了呢?当然可以,而且这是关灯后再洗柱方法中所必须的,但我在前面说过,先关灯,仪器会报错,方法无法运行。其实很简单,这是因为我们有一个细节 没编好,在方法编辑过程中,进入仪器参数设置-检测参数VWD设置,在右下角选“更多信息”,点击进入后点选“特殊设置”,对“当灯关闭时可进行分析(E)”进行勾选,再在“运行前命令/宏”中输入LAMP OFF
14、,这样,就可以实现先关灯后再运行洗柱的方法了。然后在“运行后命令/宏”中设置完成后关泵或关闭闭工作站,工作站, 这就是随你所欲啦。关泵为PUMP OFF,关闭整个系统为STANDBY,这里要说明的是PUMP OFF和STANDBY是有区别的,前者为泵的关闭,后者为停泵至待机状态的。如果选BACK命令,则关闭工作站。 这是关机方法中的一个小技巧,这当然不可用在分析方法上,分析方法中前后宏命令最好慎用, 特别是在VWD设置中更不可选特殊设置中勾选“当关灯时可进行分析”,不然我们的实验操作就没有意义了。这是为什么,大家一想就知道啦。还有,在运行时选项表中要注意的问题是,除非有特殊要求,一般不建议选择
15、“保存GLP数据”、“将方法和数据保存在一起”选项,GLP 那如何对它进行合理积分以得到比较准确的数据这是个关键,这可以从积分事件中进行设置。斜率灵敏度和峰宽的数值改动要慎重,因为选用不同数值,将影响色谱峰起止点的识别,得到不同的峰面积,进而影响到所得定量结果的准确程度。一定要保证处理同一系列数据(各个标样数据和未知样品数据)时, 这两个参数值是一致的。最小峰面积和最小峰高的数值大小不会影响所得峰面积,仅仅做为是否对该色谱峰进行积分的标准。积分事件表中的积分参数并不是孤立于方法的参数,它们属于方法的一部分内容,所以保存积分参数时应先将积分事件保存到方法中,然后再保存方法,积分参数就会被保存下来
16、。如果自动积分 和利用积分事件表设置积分参数都不能满足用户积分的具体要求,那么退出积分事件表,即可看到上图所示的手动积分工具栏,你可以使用手动积分的功能进行积分条件优化,手动积分不能被直接保存到方法中,也不建议保存手动积分参数。 校正,校正即是利用某个峰的峰高或峰面积来确定其对应组分的浓度或含量,当检测器灵敏度针对不同的组分而变化时需要进行校正,检测器对同一组分不同含量响应值发生变化时需要进行校正。校正分单级校正和多级校正。一、单级校正:即单点校正,单点法。仅有一个浓度的标样,无论进样几针取平均值,只要浓度相同,都相当于只做一次校正。单点校正的两种假设(1、响应曲线必须是直线;2、响应曲线必须
17、通过原点。)都不尽合理,使得单级校正定量结果不准确。但其具有简单、快速的优点,常适用于以下情况:1、做简单的粗定量;2、当未知样品的浓度小于且接近于标样浓度时,变量定量结果较准确;3、主要用于检出实验,即不需要准确定量未知样品含量, 只关心未知样品是否达标。二、多级校正。1、对每一峰需做至少两次校正;2、可以补偿检测器的非线性响应;3、响应曲线可以不通过原点。多级校正纠正了单级校正的缺点,可以进行准确定量。液相色谱里面常用的多级校正为五级校正(即五点法)。建立校正表,它的目的目的是为了得出含量结果。校正表建立是自动计算中必须的,标准曲线制定也必须在校正表建立上。校正表编好后,也要作为方法的一部
18、分存入方法。同时想用批处理来处理数据时首先建立校正表。至于批处理方面的应用,这是高级培训班中的内容,在基础培训班中只提及一下,所以我在这里也就不不多说了。在此提醒注意的是:如果使用内标法或内标百分比法定量,一定要指定内标峰,否则化学工作站会警告内标化合物丢失,无法完成定量。最后是报告处理,工作站提供了一系列的报告格式,如简单报告,性能报告,完整报告等,其中又分为内标法,外标法,百分比法等多 种报告格式。如果你对工作站上给出的格式不满意,可以自定义设置报告,不过,自定义报告的设置是一个令人头痛的问题,要想得到一个较满意的自定义报告,需要你花不少的心神。安捷伦的色谱工作站中的报告功能确实到了人人痛
19、骂的程度。安捷伦公司难道真的这么没文化么?一点没考虑中国国情还一味在中国 吹捧他的的仪器,非也,这是因为安捷伦公司另有打算而已,也可以说他心太黑太狠。用过WATERS工作站么?其报告功能是不是值得称道。特别是令正在用安捷伦的工作站的兄弟姐妹们羡慕不已吧?其实,WATERS的工作站就是安捷伦公司卖给WATERS的,奇怪吧?没什么,这是老外玩的把戏, 安捷伦公司把仪器和软件分开来卖,所以买了他们的仪器,还得买他们的软件,对安捷伦来说,色谱方面的软件分为COM软件和STATION软件,前者有强大的数据处理功能,后者的就是工作站,WATERS就是把买回来的COM和STATION整合在一起,明白么?所以
20、要想拥有强大的数据处理功能就得花钱去买安捷伦的COM数据处理软件吧,不然你只好将就着用啦。 维护篇1、为什么溶剂和样品要过滤? 溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保护作用,消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型:30mm内径:适用于大进样量的过滤,由0.2m和0.45m两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50l。13mm内径:适用于范围广的过滤,由0.2m和0
21、.45m两种规格,材料为纤维素。3mm内径:适用于小进样量的过滤,由0.2m和0.45m两种规格。处理样品体积为7l。滤膜类型滤膜类型:聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐,并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶液,推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜:具有蛋白吸收低,同样适用水溶性样品和有机溶剂。 2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项? HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石
22、活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项。清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下,不能干涸。3、为什么、为什么Agilent 1200LC的流动相管路非常细的流动相管路非常细? 在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响,由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量级,液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此,样品
23、进入色谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、连接管、检测器)中,样品分子的扩散和滞留,都会引起色谱峰的展宽,而使柱效降低 。为使柱外效应减之最小,获得理想的分析结果,Agilent 1200LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。 毛细管线分类:0.17mm内径绿色 ;0.12mm内径红色。 PEEK 管线:内径 0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。 毛细管线优点: 柔韧性好. Agilent 公司同时备有1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。 4、流动相使用前为什么要脱气?、流动相使用前为什么要脱气? 流动
24、相使用前必须进行脱气处理 ,以除去其中溶解的气体(如O2),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度下降,甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,可能会造成荧光猝灭。 常用的脱气方法比较:常用的脱气方法比较: 氦气脱气法:氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低,连续吹氦脱气,效果较好,但成本高。加热回流法:加热回流法:效果较好,但操作复杂,且有毒性挥发污染。抽真空脱气法:抽真空脱气法:易抽走有机相。超声脱气法:超声脱气法:流动相放在超声波容器中,用超声波振荡10-1
25、5min,此法效果最差。在线真空脱气法:Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术, 在线脱气,智能控制,无需额外操作,成本低,脱气效果明显优于以上几种方法,并适用于多元溶剂体系。 5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞,以及堵塞后的处理? 溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器,从而影响泵的运行,尤其水溶液或磷酸盐缓冲液(PH=47)。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。A:请严格执行溶剂过滤。B:请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 。C:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。D:避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下,尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐
26、缓冲液。堵塞后的处理法方法:将过滤头从组件中取下,在浓硝酸(35%)中浸泡1h,然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。6、Agilent 1200LC泵如何维护?Agilent 1200LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相,及时合理的维护非常重要。A:流动相使用前请必须脱气、过滤。B:使用缓冲盐时,要加在线Seal-wash选项。C:关机前,用 100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如甲醇),然后关泵,(适于反相色谱柱)。正相色谱柱用适当的溶剂冲洗 D:及时更换Purge Valve内的过滤芯。(当打开Purge Valve时,压力高于10bar,表明过滤芯已
27、堵)。E:使用合适的密封圈。7、如何选择合适的泵头活塞密封圈?、如何选择合适的泵头活塞密封圈? 泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用,但使用正相溶剂(如正己烷),不适合使用标准活塞密封圈,特别是长时间使用时,需更换另一种不同的密封圈,我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。*注意:聚四氟乙烯密封圈的压力范围为:0200bar;建议在泵的压力限制中,将最大压力设为200bar。8、使用梯度比例发时要注意那些事项?、使用梯度比例发时要注意那些事项? 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时,盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶,而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点,重力作用使盐颗粒沉淀下来,通常,阀A接水相/盐溶液,D接有
28、机溶剂,此法连接可有效使盐回落到盐溶液中,并被溶解。若颠倒过来,盐可能落在有机溶剂中,出现问题。强烈建议:强烈建议:当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时,推荐将缓冲盐通道接在A通道上,有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上;定期用水冲洗所有的通道,以除去阀口上可能出现的盐沉淀。 9、在线真空脱气机使用要注意那些事项?、在线真空脱气机使用要注意那些事项? 一般来说,Agilent 1100LC 的真空脱气机无需过多维护,只需注意几个注意事项就可以了。A:第一次使用,要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体;更换不同类型的溶剂时,要先抽空,再抽满。B:不用的通道要充满溶剂或密闭起来。10、更换色谱柱时要注意
29、什么事项、更换色谱柱时要注意什么事项?在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应柱外效应”对分析结果的影响,由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量级,液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此,样品进入色谱柱后,在柱子以外的任何死体积死体积(进样器、柱接头柱接头、连接管、检测器)中,样品分子的扩散和滞留,都会引起色谱峰的展宽,而使柱效降低 。为使柱外效应减之最小,获得理想的分析结果,仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent 1200LC 在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了,一般柱
30、子入口接头为不锈钢卡套接头,柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头,当完成第一次安张后,不锈钢卡套已固定死,当接不同的柱子时,要注意柱子接头处的形状和长度,否则会产生一个非常大的死体积。11、手动进样阀需做那些维护,使用时要注意什么?、手动进样阀需做那些维护,使用时要注意什么?对于手动进样器,当使用缓冲溶液后,或者进浓度差异比较大的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口,同时搬动进样阀数次,每次数毫升。注意事项:注意事项:安装时六通阀的5,6出口要与注射器在同一水平线上,以防止虹吸现象的发生,导致进样量的重复性变异。进样量的多少要根据定量管的LOOP体积决定。当样品量少时:
31、 进样体积由注射器的进样体积决定,但最大进样体积 要小于1/2loop体积。当样品量较多时:进样体积由定量管的体积决定,为保证样品完全把定量管的流动相置换干净,需注射56倍的LOOP体积。C:要使用专用的液相注射器进样,绝对不可以用气相的注射器。 结束语结束语 这次培训讲课的是一位年轻的工程师,叫尹怡,她的授课方式是每讲一个内容,讲完后作个小结,每天作个总结,第二天讲新内容前都要回顾一下前天的内容,这种讲课方式让所学内容印象深刻,加上每个内容都留点时间为大家答疑,有什么理解不清或在实验操作中遇到的难点都可以提出来,由老师一一解答。经过系统的培训学习,我对仪器的工作原理进一步理解,也解决了以前实验操作中遇到的问题,重新认识了许多应用方法,对仪器的操作使用维护有了新的认识,为以后的工作中更好地使用、养护仪器提供了更多理论依据。在此我对尹怡老师表示衷心的感谢,更感谢本所领导 、同事们对我的关心和支持,给我一个如此好的学习机会,在此一并致谢!