1、液体活检在胰腺癌中的应用 袁袁 周周上海交通大学附属第六人民医院上海交通大学附属第六人民医院 普外科普外科1胰腺癌流行病学胰腺癌发病率和死亡率逐年升高2008年世界癌症死亡统计2012年世界癌症死亡统计1.CA CANCER J CLIN 2011;61:69902.CA CANCER J CLIN 2015;65:8710822011年中国胰腺癌流行病学研究近年来上海市胰腺癌流行学研究11.13/10万万17.28/10万万9.91/10万万14.04/10万万1.中国肿瘤, 2015, 24(1): 1-102.Cancer Letters 346 (2014) 2732773液体活检-胰
2、腺癌诊疗新思路1. Cancer Discov; 6(5); 113 DOI: 10.1158/2159-8290.CD-15-14832. Oncol Rep 2016;35(3):1237-444肿瘤筛查和早期诊断实时监控治疗反应评估转移复发及预后指导靶向治疗指导治疗干预措施CTC 和ctDNAExosomes胰腺癌CTC研究5预后判断预后判断治疗监测治疗监测胰腺癌诊断胰腺癌诊断CTC CTC clustercluster转移机制转移机制耐药性耐药性Int J Cancer 2014; 1;134(1):1-8CTC：胰腺癌诊断6利用数学模型对全基因组测序结果分析表明，胰腺癌发生到最后肿瘤
3、转移死亡过程需要经过数十年1CTC可能在肉眼可见肿瘤形成之前进入外周血，是肿瘤转移的“种子”2IPMN和MCN作为PC癌前病变，这些患者可检测到CTC3通过筛查高危人群CTC，加强随访，CTC阳性COPD患者最后发展为肺癌，能否实现胰腺癌早期诊断需要进一步验证41. Nature. 2010 Oct 28;467(7319):1114-7 2. Cell 2012;148(1-2):349-613. Gastroenterology 2014;146:647-51 4. PLoS One. 2014 Oct 31;9(10):e111597 CTC：胰腺癌治疗监测7动物实验表明：药物有效治疗后
4、CTC数量显著降低胰腺癌患者术后CTC先下降后上升，可能是因为潜伏的disseminated tumor cells 再次被激活 PLoS One. 2014 Feb 19;9(2):e89474Int J Cancer. 2015 Mar 1;136(5):1228-33CTC：胰腺癌预后8CTC阳性患者：总生存时间较差，HR=1.23；无进展生存期更短，HR=1.89Tumor Biol. (2014) 35:24732480CellSearch检测CTC判断预后9 16名b期PC患者，8名检出CTC CTC阳性MST：52.5天 CTC阴性MST: 308.3天J Hepatobilia
5、ry Pancreat Surg (2008) 15:189195 Annals of oncology, 2013, 24(8): 2057-2061 79名局部晚期PC，9名患者在基线或治疗后2月检测出CTC，检出率11% CTC阳性OS较差P=0.01CellSearch联合表面分子标记物更准确判断预后10 经典的CellSearch检测CTC对转移性PC的预后价值判断有限 结合MUC-1更好的对患者进行危险分层 Pancreas. 2016 Mar 10 DOI: 10.1097/MPA.0000000000000619CellSearch检测CTC评估肿瘤转移在PC患者术后2-3年，
6、术中门静脉CTC阳性提示较高的较高肝转移发生率（ 53 vs. 8 %, p=0.038 ）CTC的数量变化辅助判断不同手术方式效果，术前两组门静脉CTC无差异，术后标准手术组CTC升高而非接触术式组CTC不变11(Medicine 95(16):e3407)Tumor Biol. (2015) 36:991996Medicine (Baltimore). 2016 Apr;95(16):e3407. doi: 10.1097/MD.0000000000003407JAMA Surg. 2014 May;149(5):482-5胰腺癌CTC检测-CellSearch12CTC检出率检出率较低较
7、低 晚期PC检出率 5%-42% 检出数量较少检出数量较少 1-10个/7.5ml无法进行后续培养无法进行后续培养在EMT过程中CK、EpCAM等上皮标记物表达减少或消失，上皮表型细胞减少，间质表型细胞增多胰腺癌为乏血供组织，血流量较正常胰腺组织减少约60%CTC通过门静脉系统在肝脏内被清除基于大小的胰腺癌CTC检测13 优势：检出率高，检出数量多；细胞完整性好；不受细胞表面标记物影响；可检出CTM；可进行后续分析 不足：不易检出小于8m的肿瘤细胞 胰腺癌：ISET、ScreenCell等ISET-结合多种表面标记物确定CTC 根据肿瘤细胞形态学确定的CTC对PFS (P=0.85)和OS(P
8、=0.36) 无判断作用 利用表面标记物研究CTC Epithelial CTC： CK+/CD45-/15m（78%），提示预后不良 Mesenchymal CTC：CK+/Vim+/ CD45-/15m（52%），提示术后复发更多标记物值得去探究，如EMT过程中表达不下调的Plastin3 14British Journal of Cancer (2012) 106, 508 516 Ann Surg. 2016 Jan 7, DOI: 10.1097/SLA.0000000000001600Cancer Res. 2013 Apr 1;73(7):2059-69ScreenCell-结合
9、KRAS突变鉴别CTC15 联合细胞形态和KRAS突变检测胰腺癌CTC，KRAS突变可以作为判定CTC分子学特征 可在不同分期PC患者检测到，检出率较高，分别为73%-86% 67%-73%的CTC检出KRAS突变 KRAS突变CTC与预后有关Pancreas 2015;44: 547550Tumour Biol 2016; 37(6):7547-54SE-iFISH方法检测CTC16 SE-iFISH：差相富集技术联合免疫荧光染色及染色体荧光原位杂交技术CTC鉴定方法 CK是上皮细胞来源标记物，免疫染色为绿色 CD45白细胞表面的共同抗原，免疫染色为红色 DAPI用于标记细胞核，染色呈现蓝色
10、 8号染色体多倍性是胰腺癌一个重要特征，FISH染色为橙色 CTC 的表型： CK+/CD45-/DAPI+/CEP8=2， CK+/CD45-/DAPI+/CEP82，CK-/CD45-/DAPI+/CEP82 白细胞的表型为CK-/CD45+/DAPI+/CEP8=2； 未定性细胞表型为CK-/CD45-/DAPI+/CEP8=217典型细胞图像白色箭头所示为CTC，红色箭头所示为白细胞，绿色箭头所示为未定性细胞18CTC计数诊断胰腺癌ROC曲线ROC曲线下面积0.954当CTC计数临界值为2个/7.5ml，约登指数最大，为1.78CTC2个/7.5ml 定义为CTC阴性，CTC2个/7.
11、5ml 定义为CTC阳性19CTC阳性率与临床病理学参数关系20联合CTC计数与CA19-9诊断胰腺癌21CTC计数与胰腺癌生存时间关系本组患者中位时间生存时间为10.2月（3.9-21.6月）CTC3个/7.5ml的患者中位生存时间15.2月（8.4-21.2月）CTC3个/7.5ml的患者中位生存时间10.2月（3.9-16.4月）22Cox比例风险回归模型CTC3个/7.5ml（HR=4.547；P=0.016）和-期肿瘤（HR=2.742；P=0.012）是胰腺癌不良预后的独立判断因素J Exp Clin Cancer Res. 2016 Apr 12;35(1):66 23CTC：肿
12、瘤耐药性 在NSCLC中，CDX小鼠模型 (CTC derived xenograft)对化疗药物反应类似提供CTC的患者，便于检测化疗耐药性 在乳腺癌中，培养CTC细胞系，进行药敏试验，难治性肿瘤的提供新治疗药物，进行个性化治疗方案 通过对接受和未接受AR (androgen receptor)抑制剂治疗的前列腺癌患者CTC，发现非经典Wnt信号通路激活，Wnt5a异常表达抑制药物疗效241.Nat Med. 2014 Aug;20(8):897-9032. Science. 2014 Jul 11;345(6193):216-203. Science. 2015 Sep 18;349(62
13、54):1351-6CTC在肿瘤转移发中的作用25Nature. 2016 Jan 21;529(7586):298-306CTC：肿瘤转移机制 在前列腺癌中，CTC全外显子组测序揭示70%的CTC突变与肿瘤组织一致 在乳腺癌CTC中分离出MIC（ metastasis-initiating cells ），证实EPCAM+/CD44+/CD47+/MET+类型细胞具有肿瘤干细胞特性 在胰腺癌中，利用RAN-Seq分析鉴定出非经典Wnt途径在胰腺癌中的作用，抑制Wnt2基因有可能抑制转移 肿瘤可以通过CTC进行自我种植（self-seeding），进而促进肿瘤增大，血管生成等261. Nat
14、Biotechnol. 2014 May;32(5):479-842. Nat Biotechnol. 2013 Jun;31(6):539-443. Nature. 2012 Jul 26;487(7408):510-34. Cell. 2009 Dec 24;139(7):1315-26CTC：肿瘤转移机制27胰腺癌CTC的RNA-Seq 分析发现：CTC高度表达间质来源的 胞外基质蛋白SPARC促进胰腺癌的转移前列腺癌CTC的RNA-Seq分析发现CTC中的相关信号通路1. Cell Rep. 2014 Sep 25;8(6):1905-182. Science. 2015 Sep 18
15、;349(6254):1351-6CTC cluster 在乳腺癌中，CTC cluster 转移能力大约是单个CTC的50倍， plakoglobin(斑珠蛋白)在形成中其关键作用，表达降低后肿瘤转移能力显著下降 CTC cluster与血小板、白细胞、成纤维细胞及内皮细胞共同构成特有微环境，可以抑制失巢凋亡 CTC cluster提示患者预后较差 281. Cell. 2014 Aug 28;158(5):1110-222. Trends in Cancer, 2015, 1(1): 44-52ctDNA：临床应用前景广泛29早期诊断，检测残余病灶动态监测治疗反应；指导靶向用药判断预后Cl
16、in Chem. 2015 Jan;61(1):112-23ctDNA：检测方法日新月异30数字PCR计数提高稀有突变检出率，提高检测的深度深度NGS计数可以性检测多个靶基因，尤其是靶向深度测序，提高检测广度广度J Clin Oncol. 2014 Feb 20; 32(6): 579586Kras基因为胰腺癌重要驱动基因31Trends in biochemical sciences, 2014, 39(2): 91-100液体活检检测KRAS对PC预后有更强的判断能力32KRAS来源来源液体活检液体活检肿瘤组织肿瘤组织总突变总突变新鲜肿瘤组织新鲜肿瘤组织FFPE风险比3.161.371.6
17、22.011.29Med Oncol(2016)33:61 DOI 10.1007/s12032-016-0777-1 ddPCR检测ctDNA 105例PDAC手术患者，肿瘤组织KRAS突变率82%，ctDNA 突变率33%，与肿瘤在组织符合率100% 肿瘤组织KRAS突变无判断预后作用（P=0.18），ctDNA的KRAS突变可判断预后（13.6月 vs 27.6月，P0.001） 不同KRAS突变亚型的患者OS无显著差别33Br J Cancer. 2016 Jun 28;115(1):59-65ctDNA动态监测病情变化 ctDNA与CA19-9水平有 很好的相关性(Spearmans
18、 rho=0.786, P=0.021) ctDNA较影像学平均提前 6.5月发现肿瘤进展34Mol Oncol. 2016 Apr;10(4):635-43Nat Commun. 2015 Jul 7;6:7686ctDNA指导靶向用药35Sci Rep. 2015 Dec 16;5:18425Nat Commun. 2015 Jul 7;6:7686 ctDNA反映胰腺癌突变基因类型，可使更多患者有可能得到靶向治疗 大约三分之一患者有可用靶向药胰腺癌靶向深度测序Panel36基于ctDNA的靶向用药结果 EGFR外显子19缺失与厄洛替尼敏感有关 ctDNA提前检测到该突变，后经活检证实，予
19、以厄洛替尼治疗 结果CA19-9正常，肿瘤缩小，病情缓解37Cancer Discov. 2015 Oct;5(10):1040-8基于ctDNA的靶向药物试验 BRAF V600E突变在胰腺癌中比例3%，不与KRAS突变共存，是Vemurafenib批准用于治疗黑色素瘤的靶点 取BRAF V600E突变患者肿瘤细胞进行培养，结果发现和黑素偶细胞系MNT-1对Vemurafenib有类似敏感性，而KRAS突变细胞系PL-45则无反应38Nat Commun. 2015 Apr 9;6:6744世界范围内的精准医疗热潮澳大利亚针对晚期胰腺癌患者进行The Individualized Molec
20、ular Pancreatic Cancer Therapy (IMPaCT) 试验， 帅选出HER2 扩增; KRAS野生型; DNA修复通路基因突变 (BRCA1, BRCA2,PALB2, ATM)患者进行靶向治疗，有可能通过液体活检辅助精准靶向治疗美国NCI正在组织进行MATCH (Molecular Analysis for Therapy Choice) 试验，计划帅选3000名实体肿瘤患者，最终根据突变类型给予靶向药物治疗39 Clin Cancer Res. 2015 May 1;21(9):2029-37Semin Oncol. 2014 Jun;41(3):297-9我们开
21、展的研究 验证CTC对PC诊断和预后判断作用 探究CTC监测PC的病情变化和治疗反应CTC ctDNA、CTC、肿瘤组织的基因突变比较 利用ctDNA研究PC诊断、治疗反应、病情监测和预后判断情况ctDNA 全外显子组检测胰腺癌肿瘤的突变 研究新发突变的分子流行病学情况 进行相关的靶向药物的临床试验NGS40部分检测结果41Sanger法ddPCR法部分检测结果42ARMS法外泌体组成43外泌体是一种直径为 30 100 nm 的膜性小囊泡，可由机体中的多种细胞分泌，并广泛分布于唾液、血浆和乳汁等体液中。相关研究登记在http:/www.exocarta.org/Annu Rev Cell D
22、ev Biol. 2014;30:255-89外泌体分离方法离心法离心法：收集细胞培养液以后依次在300 g、2 000 g、10 000 g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100 000 g离心得到外泌体过滤离心过滤离心：利用不同截留相对分子质量 (MWCO)的超滤膜离心分离外泌体密度梯度离心密度梯度离心：将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区，分为连续和不连续梯度离心法免疫磁免疫磁珠珠：包被有单克隆抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合色谱法色谱法：利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法44胰腺癌外泌体研究Land
23、mark45德克萨斯大学M. D.安德森癌症中心外泌体早期诊断46PKT小鼠模仿人类胰腺癌发展过程，4.5周时形成PanIN，8周时死于PDACGPC1+ 外泌体的比例随着肿瘤体积增大和组织学分化变差而不断升高外泌体的浓度与大小同样与病情进展相关系较差外泌体含有KRAS突变且在胰腺癌早期阶段升高，可以作为理想的胰腺癌早期诊断标记物Nature. 2015 Jul 9;523(7559):177-82外泌体用于胰腺癌诊断47GPC1+ 外泌体比例在鉴别胰腺导管腺癌与胰腺良性疾病和正常人群的灵敏度和特异度为100%。GPC1+ 外泌体比例对于不同分期（原位癌、和期肿瘤的灵敏度和特异度均为100%）
24、外泌体浓度及大小无法有效鉴别外泌体提示肿瘤负荷4828/29的PDAC和全部PCPL术后GPC1+ 外泌体均下降19/29的PDAC和0个PCLC患者术后CA19-9水平下降外泌体变化判断胰腺癌预后49 GPC1+ 外泌体下降大于中位水平的OS和disease-specific survival 水平高于低于中位水平者（OS: 26.2月 vs 15.5 月; DSS: 27.7 月vs 15.5月） CA19-9水平现将无法判断预后该项研究提出的问题 GPC1不是胰腺癌特有标记物，在乳腺癌中的表达为75%，如何能够与其他肝胆胰肿瘤鉴别需要进一步研究 能否用于胰腺癌高危人群的筛选，如胰腺癌家族
25、史，Peutz-Jeghers 综合征，慢性胰腺炎患者 GPC1与CA19-9联合用于胰腺癌诊疗效果如何 外泌体检测过程需要简化和规范化50外泌体介导胰腺癌肝转移51外泌体抑制巨噬细胞游走Kupffer细胞吞入外泌体后导致TGF-分泌TGF-促进肝脏星形细胞产生纤连蛋白促进巨噬细胞和粒细胞聚集到肝脏肝转移形成Nat Cell Biol. 2015 Jun;17(6):816-26外泌体导致胰腺癌相关糖尿病52 含有肾上腺髓质素的外泌体被细胞通过内吞或胞饮作用摄入 肾上腺髓质素造成内质网应激和蛋白折叠障碍，抑制胰岛素分泌，导致细胞功能障碍最终死亡Clin Cancer Res. 2015 Apr 1;21(7):1508-10Clin Cancer Res. 2015 Apr 1;21(7):1722-33外泌体的深度测序通过Illumina HiSeq 2500 sequencer对PDAC whole genome, exome and transcriptome sequencing，检测到CNV、点突变、InDel、融合基因等信息外泌体全外显子组测序覆盖95%99%靶基因，很好代表肿瘤DNA在外泌体DNA样本中检测到多个可治疗靶点，如NOTCH1 和BRCA2可以53Annals of Oncology 27: 635641, 201654 谢谢
