1、荧光定量PCROutlineOutline 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR应用PCR 反应过程5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353延延 伸伸53535353353TaqTaq55重重 复复退退 火火5353535355335353循环循环24个拷贝个拷贝循环循环38个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353Cycle #TheoreticalReal LifeLog Target DNAPCRPCR反应模式反应模式 同一样品96复孔的实验结果荧光定量PCR 原理缺憾
2、u无法对初始模板精确定量u无法实时监测扩增情况u跑胶繁琐、易污染常规常规PCR 电泳鉴定电泳鉴定 荧光定量PCR 在体系中引入荧光染料 实时检测扩增阶段： 指数期 平台期荧光定量PCR 原理荧光定量PCR 原理Threshold lineC(t) value 阈值阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准 C(t)C(t)值值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数荧光定量PCR 原理X=X0(1+Ex)nlog X=log X0 (1+Ex)nlog X0= (- log(1+Ex) )*n+ log Xlog X0= (- log(1+Ex) )*C(t) + log Xc(t)n
3、：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率初始模板的初始模板的LogLog1010值与值与CtCt值呈线性关系！值呈线性关系！ 设定标准品，绘制标准曲线荧光定量PCR 原理荧光强度荧光强度-循环数循环数曲线曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标循环数标准曲线准曲线10410310610510210unknown104103Ct值通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量荧光定量PCR 原理荧光定量PCR 原理两种定量方法 绝对定量 标准曲线法 相对定量 双标准曲线法 2 2 -c(t)-c(t) 法法 荧光定量PCR 原理 精确定量 大范围拷贝数样品同时
4、检测 100 1010 省时有效 通过浓度梯度标准品，绘制标准曲线 样品结果与标准曲线比对得到精确的浓度临床检测，转基因检测，环境监测等绝对定量绝对定量荧光定量PCR 原理 设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因 对靶基因进行均一化：靶基因拷贝每一个内标基因拷贝l 双标准曲线法 含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线； 样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理； 标本间靶基因的表达水平分析l 2 -c(t) 法法 标本内靶基因与内标基因Ct值比较：C(t) =C(t)m C(t)n 标本间标本间C(t)C(t) 比较： c(t) C(t)1 C(t) 2 2 2 -c
5、(t) -c(t) 计算计算相对定量相对定量 无需制备标准品(2 -c(t) 法法)，需要内参照基因，注意扩增效率(内参与目的基因扩增效率相近）差异表达分析，芯片结果验证等相对定量相对定量荧光定量PCR 原理 插入染料法 SYBR Green I 杂交探针法 TaqMan荧光定量PCR 原理5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353插入染料方法的原理SYBR Green ITaqIDl延延 伸伸53535353检测激发的荧光检测激发的荧光535355TaqTaq353TaqTaq55退退 火火IDIDIDIDID
6、IDIDIDIDIDllllln插入染料法相对成本低n不需要设计探针，通用性强n对引物的设计要求较高（注意非特异性扩增）n不能做多重PCRMelting Curve analysis 逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线荧光值的关系曲线温度温度荧光强度荧光强度Tm-dIdTTmSolve the non-specific productMelting curve 优化条件 更换引物 权宜之计 95 10sec 60 15sec 72 30sec 80 10sec detection 40 cycles杂交探针方法 TaqMan TaqMan
7、探针探针 分子信标探针（Molecular Beacons）荧光定量PCR 原理TaqMan探针5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应体系变 性535353535353Taql53RQProbe53RQ535353RQ退 火531. 链取代Taq3QR5533QTaqR52. 水 解3. 聚 合53QTaqR354. 检测荧光533QTaqR5l 扩增特异性强 可以做多重检测 成本较高Molecular Beacon发夹结构退火时与靶片段结合引物延伸时被切断More 医疗领域的应用 科学研究方面的应用 公安系统内的应用 动植物检疫 考古学方面的应用 荧光
8、定量PCR 应用医疗方面的部分应用（医疗方面的部分应用（1）：）：q临床检测：临床检测：疾病的临床早期诊断疾病的临床早期诊断 如各种肝炎、性病、遗传性疾病、与优生优育相如各种肝炎、性病、遗传性疾病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等关的疾病以及肺结核等等疗效考评疗效考评 指导制订感染性疾病合理治疗方案指导制订感染性疾病合理治疗方案 了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况医院、血站及防疫站的确诊医院、血站及防疫站的确诊 荧光定量PCR 应用医疗方面的部分应用（医疗方面的部分应用（2）：）：q遗传病诊断遗传病诊断 ：等位基因检测等位基因检测 多基因遗传病的突变
9、检测多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测基因表达异常所致遗传病检测 荧光定量PCR 应用医疗方面的部分应用（医疗方面的部分应用（3）：）：q肿瘤诊断肿瘤诊断 ：肿瘤相关基因表达的检测肿瘤相关基因表达的检测 ：包括癌基因：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因肿瘤标志物肿瘤标志物 如癌胚抗原、同功酶、抗体、如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等激素、细胞因子、受体等肿瘤耐药基因（肿瘤耐药基因（MDRMDR） 荧光定量PCR 应用研究方面的部分应用（研究方面的部分应用（1）：）：分子生物学方面：分子生物学方面：研究各种处理对细胞研
10、究各种处理对细胞mRNAmRNA含量变化的影响含量变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种比较染病组织与正常组织中各种mRNAmRNA含量差异含量差异DNADNA或或RNARNA的转染量与实验结果关系的研究的转染量与实验结果关系的研究 荧光定量PCR 应用研究方面的部分应用（研究方面的部分应用（2）：）：植物学方面：植物学方面：转基因植物中基因拷贝数与性状的关系转基因植物中基因拷贝数与性状的关系 监测转基因植物中基因拷贝数的变化监测转基因植物中基因拷贝数的变化转基因植株早期的筛选转基因植株早期的筛选 监测农作物病虫害抗药性变化监测农作物病虫害抗药性变化荧光定量PCR 应用研究方面的部分应用（研
11、究方面的部分应用（3）：）：动物学方面：动物学方面：动物疫情监测动物疫情监测 新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究 转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研究及早期筛选究及早期筛选 荧光定量PCR 应用其他方面的部分应用（其他方面的部分应用（1）：）：q进出口检验相关进出口检验相关 ：动物检疫，如各种动物流行病动物检疫，如各种动物流行病植物检疫，如各种植物流行病植物检疫，如各种植物流行病有害动物，特别是昆虫有害动物，特别是昆虫食品检测，如各种有害病原微生物，如食品检测，如各种有害病原微生物，如病毒、细菌、支原体
12、病毒、细菌、支原体转基因植物检验，如转基因大豆、西红转基因植物检验，如转基因大豆、西红柿等柿等荧光定量PCR 应用其他方面的部分应用（其他方面的部分应用（2）：）：q公安系统相关公安系统相关 ：个人身份鉴定个人身份鉴定物证的各种鉴定物证的各种鉴定人种的鉴定人种的鉴定q考古方面考古方面q物种分类物种分类荧光定量PCR 应用l据统计，目前中国有1015%的人感染有HBV病毒l 人工受精前男性HBV检测l患者血清、精液的HBV检测荧光定量PCR 应用乙肝病毒HBV检测检测方法荧光定量PCR 应用患者血清、精液 DNA的提取酚/氯仿、试剂盒抽提50C C 5min95C C 10min95C C 15
13、sec60 C C 40sec40cyclesTaqMan Probe 0.25uMPrimer 0.9uMPCR buffer 1Template 50200ng扩增HBV核心抗原core 基因含core gene不同浓度梯度质粒为标准品统计分析荧光定量PCR 应用检测结果Amplification of standards特异性强：使用了Taqman probe 灵敏：检测下限达到了10 copies，荧光定量PCR 应用检测结果血清中HBV含量比精液中高出两个数量级使用TaqManTaqMan探针进行双通道荧光定量qFamFam标记目标基因探针标记目标基因探针qVICVIC标记看家基因探
14、针标记看家基因探针荧光定量PCR 应用ERBB2 的表达（正常组织vs. 肿瘤组织）q 目标基因：目标基因：ERBB2 oncogene ERBB2 oncogene q 看家基因：看家基因：GAPDHGAPDHq 模板模板q从从 正常乳腺组织中提取的正常乳腺组织中提取的 Total RNA Total RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 Total RNA Total RNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线的质粒用于生成标准曲线荧光定量PCR 应用荧光定量PCR 应用荧光定量PCR 应用ERBB2ERBB2 扩增曲
15、线扩增曲线PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH荧光定量PCR 应用HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copies ng/ l Total RNA荧光定量PCR 应用ERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180
16、.011 / 0.018GraphCopies ng/ l Total RNA荧光定量PCR 应用00.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表达差异荧光定量PCR 应用荧光定量PCR 应用胃癌早期诊断之 SOCS-1高甲基化的检测l 肿瘤抑制基因高甲基化而引起基因沉默是胃肿瘤发生的一个重要机制l 甲基化一般发生在基因的启动子区CpG中的C核苷酸l SOCS-1 (suppressor of cytokine signaling-1)高甲基化与胃肿瘤的发生具有密切联系荧光定量PCR 应用
17、研究方法 胃癌患者血清DNA提取（蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、乙醇）亚硫酸氢钠处理DNA template SYBR supermix Primers定量PCR 体系l 以 In vitro methylated DNA(IVD)为阳性对照（标准品）l 以非甲基化的胃癌细胞系KATO III为阴性对照l 以6个年龄、性别匹配的正常人血清做统计学分析 修饰非甲基化CpG为UpG 甲基化位点不修饰针对未经修饰改变的启动子序列荧光定量PCR 应用研究方法 亚硫酸氢钠处理的血清DNA94C 6min94C 10sec64C 25sec72C 25sec77C 10secMelting curve an
18、alysis40cycles 定量PCR (SYBR)结果统计、临床意义分析荧光定量PCR 应用研究结果Melt curve of real time MSP analysis of SOCS-1 geneThe standard curve of (in vitro methylated DNA, IVD) determined at 77C荧光定量PCR 应用研究结果a In vitro methylated DNAb Results from duplicate experimentc Amount of methylated SOCS-1 as determined by Ct val
19、ue荧光定量PCR 应用 癌症患者血清中SOCS-1高度甲基化 此方法诊断具有非侵入人体优点 SOCS-1可作为胃癌早期诊断的指标之一 基因表达水平研究 基因的绝对表达量（微生物检测、环境监测） 标本间基因的差异表达（病理相关、芯片验证） 基因型研究 基因单碱基变化（SNP、mutant） 基因的碱基修饰（甲基化等）荧光定量PCR 应用MoreWe need to decide what to start? 决定实验方案（绝对定量？相对定量？）实验目的 决定选用实验方法 (SYBR green？TaqMan?) 检测基因数、样本数成本核算 We need Kits? 定量定量PCR试剂试剂 SYBR Green I Mix TaqMan Mix 配套耗材配套耗材 Tubes Strips Plate
