1、 通过通过DNA重组技术克隆重组技术克隆全套抗体可变区基全套抗体可变区基因因,并在原核系统并在原核系统表达有功能的抗体分子片表达有功能的抗体分子片段段,这种全套抗体基因表达文库称为这种全套抗体基因表达文库称为抗体库抗体库-沈倍奋沈倍奋:重组抗体在蛋白质组学研究中的应用重组抗体在蛋白质组学研究中的应用-细胞与分子免疫学杂志细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2003, 19(2):105-106 抗体库技术的主导思想，是抗体库技术的主导思想，是 将某种动物的将某种动物的所有所有抗体抗体可变区基因可变区基因克隆在克隆在质粒或质粒或噬菌体噬菌体中中表达表达 利用不同
2、的抗原利用不同的抗原筛选筛选出携带特异抗体基因的出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的克隆，从而获得相应的特异性抗体特异性抗体 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗体技术以后抗体领域的又一次革命体技术以后抗体领域的又一次革命 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术又被誉为这次革命中又被誉为这次革命中的革命的革命 该技术的最大优势在于可以使人们该技术的最大优势在于可以使人们绕过杂绕过杂交瘤和免疫交瘤和免疫而建立天然全套噬菌体抗体展而建立天然全套噬菌体抗体展示文库，示文库， 从库中容易地筛选出任一感兴趣从库中容易地筛选出任一感兴趣的抗体的抗体 克隆出抗体全套可变区基
3、因克隆出抗体全套可变区基因 与有关载体连接与有关载体连接 导入受体菌系统导入受体菌系统 利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些基因表达在细菌、噬菌体等表面基因表达在细菌、噬菌体等表面 进行筛选与扩增，建立抗体库进行筛选与扩增，建立抗体库 5.1 5.1 初期的抗体库初期的抗体库 5.2 5.2 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 5.3 5.3 大容量抗体库大容量抗体库 5.4 5.4 抗体库技术的应用抗体库技术的应用 5.1.1 背景背景 5.1.2 初期的抗体库初期的抗体库 DNA重组技术重组技术的发展和的发展和抗体基因结构的阐抗体基因结构的阐明明，促进了，
4、促进了80年代初基因工程抗体的发展年代初基因工程抗体的发展 基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能和扩展了抗体的应用范围和扩展了抗体的应用范围 抗体库技术，通过抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆重组技术，克隆全全套抗体可变区基因套抗体可变区基因，在原核系统表达有功，在原核系统表达有功能的抗体分子片段（即抗体库），从中能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛筛选特异性抗体的选特异性抗体的基因基因。 两项关键技术：两项关键技术： PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋白的可变区基因白的可变区基因 以大肠杆菌以大肠杆菌(或噬菌体或噬菌体
5、)直接表达有功能活性直接表达有功能活性的抗体分子片段的抗体分子片段 噬菌体展示技术（噬菌体展示技术（phage display）应用到）应用到抗体的表达与克隆抗体的表达与克隆 Ward 等等:大肠杆菌大肠杆菌表达表达出出VH段段21 /2，000个克隆个克隆与溶酶体与溶酶体特异性结合的克隆特异性结合的克隆PCR扩增出扩增出VH基因基因脾细胞脾细胞DNA溶菌酶免疫小鼠溶菌酶免疫小鼠 用用逆转录逆转录-PCR技术从淋巴细胞克隆出技术从淋巴细胞克隆出抗体抗体轻链基因库（轻链基因库（repertoire）和和重链重链Fd段基因段基因库库 Repertoire 所有的节目所有的节目 将轻链和重链基因分别
6、将轻链和重链基因分别组建到噬菌体组建到噬菌体表达表达载体中，得到轻链基因库和重链载体中，得到轻链基因库和重链Fd段段基因基因库库 通过通过DNA重组技术将轻链基因和重组技术将轻链基因和Fd段基因段基因随机配对随机配对重组于一个表达载体中重组于一个表达载体中，形成，形成组组合抗体（基因）库合抗体（基因）库 P109 感染感染大肠杆菌，噬菌体形成大肠杆菌，噬菌体形成噬菌斑噬菌斑 相应噬菌体载体上的相应噬菌体载体上的链基因和链基因和Fd段基因得段基因得到到表达表达，形成有功能的，形成有功能的Fab段，释放于噬菌段，释放于噬菌斑内斑内 将噬菌斑转印到硝酸纤维素膜上将噬菌斑转印到硝酸纤维素膜上 用标记的
7、抗原用标记的抗原筛选筛选产生特异性抗体的克隆，产生特异性抗体的克隆，得到其得到其Fab段的基因，段的基因， 建立了建立了完整的完整的抗体库技术抗体库技术 1. 省去了细胞融合的步骤省去了细胞融合的步骤 2. 扩大了容量，扩大了容量， 106 以上个克隆以上个克隆 3. 直接得到抗体的基因，不丢失，便于进直接得到抗体的基因，不丢失，便于进一步构建抗体一步构建抗体 4. 利用原核表达系统的优势利用原核表达系统的优势 5.可制备难于制备的抗体可制备难于制备的抗体 噬菌体展示技术噬菌体展示技术 （phage display technology）的应用）的应用 将肽段的基因将肽段的基因克隆克隆到丝状噬
8、菌体的基因组到丝状噬菌体的基因组DNA中中 与噬菌体的外壳蛋白形成与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白融合蛋白 呈现于噬菌体表面呈现于噬菌体表面特点：将特定分子的特点：将特定分子的基因型和表型基因型和表型统一在同一病毒颗粒内统一在同一病毒颗粒内 M13 fd f1 复制型复制型DNA被用来做基因克隆的载体被用来做基因克隆的载体 基因组为单链环状基因组为单链环状DNA 基因中有一段基因中有一段基因间隔区基因间隔区（intragenic region）,含有病毒合成的起始和终止信号，含有病毒合成的起始和终止信号，以及子代噬菌体生成组装的信号以及子代噬菌体生成组装的信号 基因组共编码基因组共编码10种蛋白
9、质种蛋白质，包括结构蛋白，包括结构蛋白和和DNA 合成和子代噬菌体的包装释放所需合成和子代噬菌体的包装释放所需蛋白蛋白 管状蛋白外壳，蛋白管状蛋白外壳，蛋白（2 700-3 000个），个）， 蛋白质蛋白质 和和，蛋白质，蛋白质和和 1.通过通过蛋白质蛋白质对细菌表面性菌毛的识别对细菌表面性菌毛的识别感感染细菌染细菌 2.感染后其基因组感染后其基因组DNA 进入细菌进入细菌 3.DNA 转变为转变为双链双链DNA 4.在噬菌体蛋白的作用下，在噬菌体蛋白的作用下，复制复制大量单链大量单链DNA 5.与细胞膜上的噬菌体外壳蛋白与细胞膜上的噬菌体外壳蛋白组装组装成完整成完整噬菌体。噬菌体。 蛋白蛋白
10、：50个氨基酸，中央一段疏水，可个氨基酸，中央一段疏水，可先先镶嵌在细菌内膜上；可多价表达。镶嵌在细菌内膜上；可多价表达。 当当外源蛋白的基因与基因外源蛋白的基因与基因融合，融合，就会在就会在噬菌体表面表达噬菌体表面表达 蛋白蛋白：406个氨基酸，在感染的细菌内，个氨基酸，在感染的细菌内，羧基端羧基端固定在内膜上，固定在内膜上，氨基端氨基端朝向质周腔朝向质周腔 每个噬菌体有每个噬菌体有3-5个副本个副本，氨基端与大肠杆，氨基端与大肠杆菌的性毛结合，介导感染；羧基端与子代菌的性毛结合，介导感染；羧基端与子代噬菌体的释放有关噬菌体的释放有关 可可低价表达外源蛋白低价表达外源蛋白，有利于高亲和性配，
11、有利于高亲和性配体的筛选体的筛选 筛选过程：筛选过程： 优越性：优越性： 简便易行简便易行 筛选能力强筛选能力强 可直接得到特异克隆编码可直接得到特异克隆编码DNADNA 将多样性可变基因组装到表达载体内，表将多样性可变基因组装到表达载体内，表达到噬菌体表面得到多样性噬菌体抗体的达到噬菌体表面得到多样性噬菌体抗体的集合，即集合，即噬菌体抗体库（噬菌体抗体库（phage antibody library） 通过吸附通过吸附-洗脱洗脱-扩增的富集过程，可有效地扩增的富集过程，可有效地从噬菌体抗体库中筛选到特异性抗体的可从噬菌体抗体库中筛选到特异性抗体的可变区基因变区基因 1. 噬菌体抗体表达的分子
12、片段噬菌体抗体表达的分子片段 表达表达 FabFab时时，将轻链基因和，将轻链基因和Fd基因组合在基因组合在同一个表达载体内，或不同载体导入同一同一个表达载体内，或不同载体导入同一个大肠杆菌细胞内，一个基因与外壳蛋白个大肠杆菌细胞内，一个基因与外壳蛋白形成的融合蛋白链固定在细胞内膜上，另形成的融合蛋白链固定在细胞内膜上，另一链分泌到质周腔，二者可形成有活性的一链分泌到质周腔，二者可形成有活性的抗体抗体 表达表达ScFvScFv时时，通过重叠延伸拼接法，通过重叠延伸拼接法（replicing overlap extension, ROE）用）用PCR直接将直接将轻链和重链可变区基因组合在轻链和重
13、链可变区基因组合在一起一起；构建；构建ScFv时用可变区时用可变区3端做引物，端做引物，不受重链同种型的限制，有更好的多样性。不受重链同种型的限制，有更好的多样性。 重叠延伸重叠延伸PCR技术技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称简称SOE PCR)由于采用具有由于采用具有互补末端的引物互补末端的引物,使使PCR产物产物形成了形成了重叠链重叠链,从而在随后的扩增反应中通从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段将不同来源的扩增片段重重叠拼接叠拼接起来起来. 此技术利用此技术利用PCR技术能够在体外进行有效技术能够
14、在体外进行有效的的基因重组基因重组,而且不需要内切酶消化和连接而且不需要内切酶消化和连接酶处理酶处理 表达表达dsFVdsFV： 将可变区与将可变区与基因基因融合，可在融合，可在噬菌体表面表达出噬菌体表面表达出dsFv 表达表达 Diabody:与基因与基因融合，可在噬菌体融合，可在噬菌体表面表达出双链抗体表面表达出双链抗体 2. 噬菌体抗体的表达载体噬菌体抗体的表达载体 丝状噬菌体载体丝状噬菌体载体 将抗体基因克隆在将抗体基因克隆在基因基因5端前导序列的下端前导序列的下游，融合蛋白可表达游，融合蛋白可表达 噬粒噬粒为基础载体为基础载体 质粒质粒含有含有丝状噬菌体基因间隔区丝状噬菌体基因间隔区
15、 在在丝状噬菌体蛋白丝状噬菌体蛋白存在时，介导噬菌体存在时，介导噬菌体DNA的复制、包装和释放，产生子代噬菌的复制、包装和释放，产生子代噬菌体颗粒。体颗粒。 噬粒噬粒 (phagemid或或phasmid) 是由质粒载是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的体和单链噬菌体载体构建成的 它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的复制起点复制起点 在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链质质粒分子粒分子进行复制，生成双链进行复制，生成双链DNA 当宿主细胞受到当宿主细胞受到辅助噬菌体辅助噬菌体感染后，噬粒感染后，噬粒载体便按单链噬菌体的方式进行
16、复制，然载体便按单链噬菌体的方式进行复制，然后由辅助噬菌体提供的后由辅助噬菌体提供的外壳蛋白外壳蛋白包装成噬包装成噬菌体颗粒菌体颗粒 辅助噬菌体辅助噬菌体是一类自身是一类自身DNA复制效率极低复制效率极低的突变型，但可为宿主细胞的质粒的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提提供复制和包装所需的供复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白蛋白酶和外壳蛋白 用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的用辅助病毒超感染，辅助病毒提供所有的丝状噬菌体蛋白丝状噬菌体蛋白，将，将噬粒噬粒DNA 以单链的形以单链的形式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗式包装在噬菌体外壳蛋白内，形成病毒颗粒，可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助粒，
17、可以感染大肠杆菌，但不产生（辅助噬菌体）子代噬菌体。噬菌体）子代噬菌体。 噬粒载体中插入抗体分子片段与基因噬粒载体中插入抗体分子片段与基因或或基因基因 融合蛋白将嵌在细菌内膜融合蛋白将嵌在细菌内膜 辅助病毒感染细菌后辅助病毒感染细菌后 融合蛋白融合蛋白与与野生型的蛋白野生型的蛋白或蛋白或蛋白共同共同组装组装到生成的噬菌体表面到生成的噬菌体表面 3噬菌体抗体的价噬菌体抗体的价 在筛选在筛选低亲和力低亲和力噬菌体抗体时可选用噬菌体抗体时可选用多价多价的噬菌体抗体的噬菌体抗体 筛选筛选高亲和力高亲和力噬菌体抗体时应选用噬菌体抗体时应选用单价单价的的噬菌体抗体噬菌体抗体 蛋白蛋白，2 700个亚基，个
18、亚基，多于多于10肽肽会影响蛋会影响蛋白白功能，不能用噬菌体载体表达蛋白功能，不能用噬菌体载体表达蛋白-抗体融合分子抗体融合分子 噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的噬粒做表达载体，来源于辅助病毒的野生野生型蛋白型蛋白和和蛋白蛋白-抗体融合蛋白抗体融合蛋白共同组装共同组装到噬菌体表面，各自的到噬菌体表面，各自的表达数目取决于两表达数目取决于两者的相对数量者的相对数量 每一个噬菌体表面可表达每一个噬菌体表面可表达24个个左右的抗体左右的抗体分子分子 基因基因(蛋白蛋白 )： 用用噬菌体载体噬菌体载体产生产生多价多价抗体分子抗体分子 用用噬粒噬粒表达，所产生的噬菌体抗体颗粒中表达，所产生的噬菌体抗体颗
19、粒中10%表达有抗体分子片段，单价表达有抗体分子片段，单价 4 膜型和可溶性抗体分子的表达膜型和可溶性抗体分子的表达 膜型表达膜型表达 在表达载体中基因在表达载体中基因或或的两端设计两的两端设计两个适当的个适当的限制性内切酶位点限制性内切酶位点，以除去外壳，以除去外壳蛋白的基因蛋白的基因 在抗体基因和外壳蛋白基因之间设计一在抗体基因和外壳蛋白基因之间设计一个琥珀密码子（个琥珀密码子（TAG）：）： a 在含有在含有琥珀抑制基因的宿主菌琥珀抑制基因的宿主菌中，可翻译中，可翻译为酪氨酸、色氨酸等，表达为抗体为酪氨酸、色氨酸等，表达为抗体-外壳蛋外壳蛋白融合分子白融合分子 b 在在无抑制基因的宿主菌
20、无抑制基因的宿主菌中则中则UAG为终止为终止密码子，抗体分子表达为可溶性蛋白密码子，抗体分子表达为可溶性蛋白 1. 用于筛选的抗原用于筛选的抗原 能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开能够将结合与非结合形式的噬菌体分离开的方法均可用于筛选的方法均可用于筛选 a 可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯）可溶性抗原包被于酶标板（聚苯乙烯） b 将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱将抗原固定化到琼脂糖微珠上，亲和柱层析层析 C 生物素生物素-抗原抗原+ 抗体库抗体库 生物素生物素-抗原抗原-抗体抗体+ 磁珠磁珠-链亲和素链亲和素 磁珠磁珠-链亲和素链亲和素-生物素生物素-抗原抗原-抗体抗体 磁场磁场 特异性抗
21、体分离特异性抗体分离 复杂抗原复杂抗原-细胞，可获得与天然状态下膜分细胞，可获得与天然状态下膜分子结合的抗体。子结合的抗体。 体内筛选，抗体从尾静脉注入小鼠体内，体内筛选，抗体从尾静脉注入小鼠体内，2hr后取胸腺，回收结合的噬菌体抗体。后取胸腺，回收结合的噬菌体抗体。 2. 回收与筛选策略回收与筛选策略 （1）结合抗体的回收）结合抗体的回收 酸碱洗脱，最常用酸碱洗脱，最常用 Genenase 酶切部位的引入酶切部位的引入 .（2）利用特异性增加回收率）利用特异性增加回收率 减差法：减差法：P114,anti-CD55 single-chain Fv 抗原遮蔽法抗原遮蔽法:：遮蔽优势抗原，筛选缺
22、乏选：遮蔽优势抗原，筛选缺乏选择优势的抗体择优势的抗体 路标选择法（路标选择法（pathfinder selection） P115 （3）功能性筛选）功能性筛选 抗体酶催化噬菌体抗体与固相基质产生共抗体酶催化噬菌体抗体与固相基质产生共价结合价结合 利用噬菌体蛋白利用噬菌体蛋白的结构功能特点，使只有和特的结构功能特点，使只有和特定抗原结合的噬菌体抗体能感染细菌得到扩展。定抗原结合的噬菌体抗体能感染细菌得到扩展。 蛋白蛋白3各功能区：各功能区： 氨基端氨基端N1：68Aa,与噬菌体传入病毒有关与噬菌体传入病毒有关 中间中间N2：131Aa,涉及与细菌表面菌毛的结合涉及与细菌表面菌毛的结合 羧基端
23、羧基端CT：149Aa,含有穿膜锚定区，参与病毒颗含有穿膜锚定区，参与病毒颗粒的形成。粒的形成。 只有具备只有具备N1和和N2的噬菌体才有充分的感染力。的噬菌体才有充分的感染力。 原理：原理： 构建抗体基因构建抗体基因-蛋白蛋白 CT基因，噬菌体不基因，噬菌体不能感染细菌能感染细菌 抗原抗原-蛋白蛋白 N1和和N2融合蛋白融合蛋白 选择性感染回收特异性抗体选择性感染回收特异性抗体 P117 5.3.1 总抗体库的容量总抗体库的容量 5.3.2 总抗体库的多样性总抗体库的多样性 自学自学 相关概念：相关概念： 库容库容 亲和力亲和力10-7-10-8/mol/L,解离常数解离常数 5.4.1 制
24、备人源抗体制备人源抗体 5.4.1.1 从免疫后个体制备人源抗体从免疫后个体制备人源抗体 5.4.1.2 不经免疫制备人源抗体不经免疫制备人源抗体 5.4.2 应用抗体库技术改良抗体性能应用抗体库技术改良抗体性能 5.4.2.1 改善改善ScFv接头的性能接头的性能 5.4.2.2 提高抗体的表达量提高抗体的表达量 5.4.2.3 改善抗体的特异性改善抗体的特异性 5.4.2.4 提高抗体亲和力提高抗体亲和力 突变策略突变策略 高亲和力克隆的选择高亲和力克隆的选择 名词解释名词解释 抗体库技术：抗体库技术： phage antibody library phage display techno
25、logy 选择型感染（选择型感染（selectively infective phage,SIP） 回答问题回答问题 1. 较细胞融合杂交瘤技术较细胞融合杂交瘤技术,抗体库技术有何优越性？抗体库技术有何优越性？ 2. 选择一种方法，从抗体库中筛选出你想要的抗体选择一种方法，从抗体库中筛选出你想要的抗体人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。
