1、12:15:0712:15:07Stokes 用分光计观察到：荧光的波长比入射光的波长稍微长些五颜六色雨后路面上水珠油膜呈现12:15:07 基态分子吸收基态分子吸收能量能量( (电能、热能、化学能或光能等电能、热能、化学能或光能等) )，电子，电子由基态由基态跃迁跃迁到激发态，当电子由激发态到激发态，当电子由激发态返回返回基态时，以发射基态时，以发射电电磁辐射磁辐射( (即光即光) )的形式释放能量。的形式释放能量。 分子发光：分子发光：分子分子 +电能电能化学能化学能光能光能生物活性参生物活性参与化学发光与化学发光 电致发光电致发光化学发光化学发光光致发光光致发光生物发光生物发光荧光荧光磷
2、光磷光12:15:07分子发光：分子发光：M +能能量量M*M +hv光致发光：光致发光：M + hvM*M +hv光12:15:072.1 2.1 荧光分析法荧光分析法2.1.1 2.1.1 荧光分析法基本概念荧光分析法基本概念2.1.2 2.1.2 荧光强度及影响因素荧光强度及影响因素2.1.3 2.1.3 仪器装置仪器装置2.1.4 2.1.4 定量分析方法定量分析方法2.1.5 2.1.5 荧光分析测定方法、特点和应用荧光分析测定方法、特点和应用12:15:07A A 分子的激发态分子的激发态分子激发态和三线激发态分子激发态和三线激发态激发态：激发态： 基态分子吸收能量后，价层电子跃迁
3、到基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能高能级级的分子轨道上称为电子激发态的分子轨道上称为电子激发态 。是分子的。是分子的亚稳亚稳定状态定状态。基态：基态： 在正常状态下，分子处于在正常状态下，分子处于最低能级最低能级的分子轨的分子轨道上称为基态。是分子的道上称为基态。是分子的稳定状态稳定状态。2.1.1 2.1.1 荧光分析法基本概念荧光分析法基本概念2.1.1.1 荧光及其产生12:15:07l 电子自旋多重度电子自旋多重度 电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可以处在不同的自旋状态可以处在不同的自旋状态, ,常用常用电子自旋多重度电子自旋多重度来描述来
4、描述。M = 2S + 1S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。2.1.1.1 荧光及其产生12:15:07 单重态（单重态（M=1）：）：电子自旋都配对的分子的电电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，子态称为单重态，用用“S”表示。表示。 三重态（三重态（M=3）：）：分子中的电子对的电子自旋分子中的电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态，平行的电子态称为三重态，用用“T”表示。表示。S2 T2 S1 T1 S0 ( (洪特规则洪特规则) ) M = 2S + 1M自旋多重度自旋多重度S总自旋量子数总自旋量子数2.1.1.1 荧光
5、及其产生12:15:082022-3-27S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫分子荧光和磷光发射过程12:15:08 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过通过辐射跃迁辐射跃迁( (发光发光) )和和非辐射跃迁非辐射跃迁( (热热) )等方式失去等方式失去能量。能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫非辐射跃迁非辐射跃迁延迟荧光延迟荧光外转换外转换返回速度快的途径，发生几率大返回速
6、度快的途径，发生几率大!B B 分子去激发过程及荧光的产生分子去激发过程及荧光的产生2.1.1.1 荧光及其产生12:15:08S2S0ehv（1）. 振动弛豫：振动弛豫：同一电子能级同一电子能级内以内以热能量交换热能量交换形形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动时间振动时间10 -11 10 -13 s。1 1、非辐射跃迁、非辐射跃迁2.1.1.1 荧光及其产生12:15:08S2S0S1ehv（2）. 内转换内转换：相同多重度相同多重度的电子能级中的电子能级中, 相等能级相等能级间的非辐射能级交换。发生内转换的时间间的非辐射能级交换。
7、发生内转换的时间10-12 s。2.1.1.1 荧光及其产生12:15:08S2S0S1T1ehv（3）. 系间跨越系间跨越：不同不同多重态在有重叠多重态在有重叠的转动能级的转动能级间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋自旋- -轨道耦合等跃迁。轨道耦合等跃迁。2.1.1.1 荧光及其产生12:15:08（4）. 外转换外转换：激发态分子与溶剂或其他分激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。2.
8、1.1.1 荧光及其产生12:15:08S2S0S1T1（1）. 荧光发射：荧光发射：电子由电子由第一激发单重态的最低振动第一激发单重态的最低振动能级能级基态各振动能级基态各振动能级，发射时间约为发射时间约为10-710-9 s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。 ehvhv2 2、辐射跃迁、辐射跃迁2.1.1.1 荧光及其产生12:15:08（2）. 磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振第一激发三重态的最低振动能级动能级基态各振动能级基态各振动能级。发光时间：。发光时间：10-410s 。S2S0S1T1hvehvS0 激
9、发态激发态振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 S0 2.1.1.1 荧光及其产生12:15:081 1、荧光激发光谱、荧光激发光谱 固定荧光测量波固定荧光测量波长，改变激发光的波长，改变激发光的波长，测量不同波长长，测量不同波长ex激发光照射下荧光强激发光照射下荧光强度的变化，记录荧光度的变化，记录荧光强度强度F F与激发光波长的与激发光波长的关系曲线。关系曲线。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱2.1.1.2 荧光激发光
10、谱曲线和发射光谱曲线12:15:082 2、荧光发射光谱荧光发射光谱 200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 固定激发光波长固定激发光波长和强度，记录在不同和强度，记录在不同波长波长emem下所发射的荧下所发射的荧光强度所得关系曲线光强度所得关系曲线即不同波长下荧光强即不同波长下荧光强度的分布。度的分布。发射光谱的形状与激发波长无关。发射光谱的形状与激发波长无关。2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线12:15:08l 荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关
11、系荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线l 吸收光谱的形状表明了分子第一激发单重态的振动能级；发射光谱表明分子基态的振动能级结构。l 基态与激发态两者的振动能级结构相似，激发与去激发组成相反的两个过程。12:15:08u 分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件1. 具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构的有机分子；性结构的有机分子；2. 具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。2.1.1.3 荧光效率12:15:08=发射荧光的分子数发射荧光的分子数激发分子总数激发分子总数2.1.1
12、.3 荧光效率荧光量子产率（荧光量子产率（）：）： 衡量荧光物质发光能力。衡量荧光物质发光能力。 它表示激发分子发射出荧光它表示激发分子发射出荧光(或磷光或磷光) 的比例。的比例。12:15:08 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：量子产率：ffiiKKK 荧光发射过程的荧光发射过程的速率常数，取决速率常数，取决于分子结构。于分子结构。各种非辐射跃迁过程的速各种非辐射跃迁过程的速率常数之和。取决于分子率常数之和。取决于分子所处的化学环境，同时也所处的化学环境，
13、同时也与化学结构有关。与化学结构有关。2.1.1.3 荧光效率12:15:08 荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度降低甚至荧光消失的现象为降低甚至荧光消失的现象为荧光猝灭荧光猝灭，又称荧光，又称荧光熄灭。熄灭。（1 1）、）、 碰撞猝灭碰撞猝灭-动态猝灭动态猝灭 M* + Q M + Q + 热量热量激发态分子激发态分子猝灭剂猝灭剂2.1.1.4 猝灭12:15:08（2 2）、）、 生成化合物的猝灭生成化合物的猝灭-静态猝灭静态猝灭 M + Q M Q 基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭
14、。化合物，导致荧光的猝灭。2.1.1.4 猝灭（3 3）、）、 能量转移能量转移 M* + Q M + Q* 激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移激发态的分子与猝灭剂作用，能量发生转移，猝灭剂被激发。，猝灭剂被激发。12:15:08（5 5）、）、 自猝灭自猝灭 荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。强度减小。2.1.1.4 猝灭（4 4）、）、 氧的猝灭氧的猝灭 氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，可能包含着多种
15、机理。杂，可能包含着多种机理。 12:15:082.1.2 荧光强度及影响因素荧光强度及影响因素2.1.2.1 荧光强度与溶液浓度的关系2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响12:15:08Epsilon（大写，小写），是第五个希腊字母。汉字读音：艾普西龙朗伯-比尔定律0fbc*303. 2IKIP1512:15:08A A 跃迁的类型跃迁的类型 n * max100 平均寿命平均寿命10-510-7 s；* max104 平均寿命平均寿命10-710-8 s l* 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具是有机化合
16、物产生荧光的主要跃迁类型，具有有* 共轭双键的分子才能发射较强的荧光。共轭双键的分子才能发射较强的荧光。2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系荧光的产生是分子先经历* 或n * 激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生* 或* n 而得到荧光。12:15:08B B 共轭效应共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动移动。化合物化合物量子产率量子产率F ex（nm） em（nm） 苯苯萘萘蒽蒽丁省丁省2052863653902.1.2.2 有机物的荧光与其
17、结构的关系0.110.280.360.5227832140448012:15:08C C 分子共平面效应分子共平面效应芴芴 = 1联苯联苯 = 0.2荧光分子的共平面性增加，则共轭体系大，有荧光分子的共平面性增加，则共轭体系大，有利于利于* 跃迁。跃迁。2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系12:15:09荧光黄荧光黄 = 0.92酚酞酚酞 = 02.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系12:15:09D D 取代基效应取代基效应1. 给电子取代基加强荧光给电子取代基加强荧光-NH2，-NHR ，-NR2，-OH， -OR ，-CN产生产生 p 共轭共轭2. 吸电子取代基减弱荧光吸电子取
18、代基减弱荧光-C=O， -COOH ，-NO2摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱。同样使荧光减弱。 2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系12:15:09D D 取代基效应取代基效应2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系A A 跃迁的类型跃迁的类型B B 共轭效应共轭效应C C 分子共平面效应分子共平面效应12:15:092.1.2.3 金属离子螯合物的荧光（2 2）螯合物中金属离子的发光）螯合物中金属离子的发光（1 1）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光12:15:092.1.2.3 金属离子螯合物的荧光（1 1
19、）螯合物中配位体的发光）螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。 如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。12:15:092.1.2.3 金属离子螯合物的荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。（2 2）螯合物中金属离子的发光）螯合物中金属离子的发光12:15:092 2、溶剂、溶剂3 3、溶液黏度和、溶液黏度和温
20、度温度 4 4、溶液的、溶液的PH值值2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响1 1、激发光源、激发光源12:15:092.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响1 1、激发光源、激发光源激发光强度激发光强度I I0 0大，荧光强度增大，灵敏度增高。大，荧光强度增大，灵敏度增高。2 2、溶剂、溶剂 主要表现为主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键溶剂的极性、氢键、配位键的形成对的形成对化合物的荧光发生变化。化合物的荧光发生变化。 * * 跃迁类型：跃迁类型：溶剂极性增大溶剂极性增大，跃迁能量降低跃迁能量降低，发生红移，发生红移，荧光增强荧光增强。 氢键、配位键的形成主要影响荧光分子的氢键、配位键的形
21、成主要影响荧光分子的存在型存在型体、电离状态体、电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。，荧光强度和形状均发生很大变化。12:15:093 3、溶液黏度和、溶液黏度和温度温度 黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。荧光强度增大。温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。4 4、溶液的、溶液的PH值值不同不同PH值下，荧光分子存在形式不同。值下，荧光分子存在形式不同。2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响12:15:092.1.3 2.1.3 仪器装置仪器装置Cary Eclipse 荧光分光
22、光度计荧光分光光度计荧光、磷光化学荧光、磷光化学/生物发光生物发光美国瓦里安技术中国有限公司美国瓦里安技术中国有限公司12:15:09一、一、荧光分光光度计结构流程荧光分光光度计结构流程 2.1.3 仪器装置仪器装置光源光源样品池样品池激发激发单色器单色器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器组成：组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器、显激发光源、样品池、双单色器、检测器、显示系统。示系统。特殊点：特殊点：两个单色器两个单色器，光源与检测器通常成，光源与检测器通常成直角直角。12:15:091 1、激发光源激发光源 汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等汞灯、碘钨灯、氙弧灯
23、、激光等。2 2、样品池样品池 I0ItIf样品池四面透光。样品池四面透光。2.1.3 仪器装置仪器装置12:15:094 4、检测器检测器 一般采用硒光电池。一般采用硒光电池。 检测器的方向与激发光的方向成直角，以消检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中除样品池中透射光和杂散光的干扰透射光和杂散光的干扰。 3 3、单色器单色器 激发单色器：激发单色器：选择激发光波长，选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。用以分离出所需用的激发光。发射单色器：发射单色器：选择荧光发射波长，选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。拉曼光和杂质所发
24、射的荧光。 2.1.3 仪器装置仪器装置12:15:09二、二、磷光分光光度计结构流程磷光分光光度计结构流程 光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器斩波器（磷光镜）利用荧光和磷光发射利用荧光和磷光发射寿命的差别寿命的差别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。来测定低温磷光。12:15:092 2、定量方法定量方法 1 1、定量依据定量依据 2.1.4 定量分析方法定量分析方法12:15:091 1、定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If 正比于吸收的光强度正比于吸收的光强度 Ia 和荧和荧光量子产率光量子
25、产率 ：faII 001 10bCatIIII由朗伯由朗伯- -比耳定律得：比耳定律得：2.303001 101bCbCfIIIe 荧光强度荧光强度 If ：2.1.4 定量分析方法定量分析方法12:15:09对于稀溶液，当对于稀溶液，当 2.303 bC 0.05时：时：02.303ffIIbC If -荧光强度荧光强度I0 -入射光强度入射光强度f -荧光量子产率荧光量子产率b - 吸收光程吸收光程 - 摩尔吸光系数摩尔吸光系数C - 物质浓度物质浓度fIKC2.1.4 定量分析方法定量分析方法12:15:092 2、定量方法定量方法 标准曲线法：标准曲线法：FCsFxCx2.1.4 定量
26、分析方法定量分析方法12:15:09A A 无机化合物的荧光分析无机化合物的荧光分析如如MgMg、AlAl、CaCa等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成荧光配合物进行定量测定；荧光配合物进行定量测定； 直接法直接法：如：如8-8-羟基喹啉与羟基喹啉与AlAl离子反应生成荧光配合物离子反应生成荧光配合物 安息香，安息香，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇， 二苯乙醇酮二苯乙醇酮 2.1.5 荧光分析测定方法、特点和应荧光分析测定方法、特点和应用用12:15:10荧光熄灭法12:15:10B B 有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析本
27、身发射荧光的，如罗丹明本身发射荧光的，如罗丹明B B、荧光素等可直接测定；、荧光素等可直接测定；不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行测定；测定；12:15:10C C：蛋白质的荧光分析：蛋白质的荧光分析1.蛋白质的基本结构，有的氨基酸自身可以发荧光，例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸12:15:102.荧光胺和氨基反应生成具有荧光的产物3.邻苯二甲醛（OPA）在一定的条件下可与伯胺、多胺生成具有荧光的产物12:15:11D D 核酸检测生命物质核酸检测生命物质常选用一些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光常选用一些荧光分子作为探针
28、，通过探针标记分子的荧光变化来研究脱氧核糖酸变化来研究脱氧核糖酸(DNA)(DNA)与小分子及药物的作用机理，与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。化合物对DNA的安全性电泳后点样处abcdpUC19 (2686bp) 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，buffer: 50mM Tris-HCl/50mM NaCl (Ph 7.4) ，化合物2.0uM浓度下的损伤测试 （37 1h）a: DNA空白对照 b:巯基乙胺(12.0uM)+DNA c:DNA+2.0uM化合物 d:巯基乙胺+DNA+2.0uM化合物12:15:1
29、1分子磷光分析法特点 发光速率慢 寿命比荧光长10-410s 辐射的波长比荧光的长 磷光的发光寿命和辐射强度对重原子及其敏感（使用含碘甲烷的混合溶剂） 受温度影响大，低温强度大 12:15:11稠环芳烃和杂环化合物稠环芳烃和杂环化合物 具有较大的致癌性具有较大的致癌性12:15:11DDT等52种农药植物生长激素（0.001mg/mL）血液和尿中的阿司匹林、苯巴比妥可卡因、致幻剂、抗凝剂精品课件精品课件！精品课件精品课件！12:15:11作业作业 1. 激发态分子去激发的过程有哪些激发态分子去激发的过程有哪些?荧光荧光发射和磷光发射经过哪些过程发射和磷光发射经过哪些过程?为什么磷光为什么磷光发射比荧光发射慢发射比荧光发射慢? 2. 为什么有的分子能够发射荧光为什么有的分子能够发射荧光,有的不能有的不能?有机物的荧光与其结构的关系是怎样的有机物的荧光与其结构的关系是怎样的? 3.根据所学知识，写出根据所学知识，写出2个可能发出荧光的个可能发出荧光的化合物，并阐明为什么有可能发出荧光化合物，并阐明为什么有可能发出荧光
