1、4.3 4.3 亲和色谱亲和色谱( (层析层析) ) Affinity Chromatography, ACAffinity Chromatography, AC 第一节 概述原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、特点 高效、高收率、有浓缩效应，使用局限性 二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质；基于生物功能可把有活性与无活性分开三、基本过程 须找配基（它与底物专一可逆结合如下图）亲和层析过程演示亲和层析过程演示z亲和吸附剂的构成 载体（基质）、配体、连接臂说明：1.偶联用Gel（须是活化偶联介质）2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和
2、吸附剂3.按相互作用力划分：次级键亲和色谱配位键螯合色谱共价键共价色谱疏水键疏水色谱亲和层析的必要条件:z 合适的配体（配基、ligand)z 合适的载体（Matrix)z 合适的吸附和洗脱条件第二节 亲和色谱配基 (ligand L) 作为配体的条件 亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活常用系统酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素: 受体、运载蛋白抗体: 抗原、病毒、细胞外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞亲和层析常用配体配体目标分子配体目标分子5-AMPNAD依赖性脱氢酶、ATP依赖性激酶Poly(U)真核mRNA、Poly(U
3、)结合蛋白ATPATP依赖性激酶凝集素糖蛋白NADNAD依赖性脱氢酶蛋白质A/蛋白质GIgG或IgG对应抗原NADPNADP依赖性脱氢酶苯基硼酸盐糖蛋白钙调蛋白钙依赖性酶Cibacron Blue F3G-ANAD(P)依赖性脱氢酶、激酶、磷酸酶、白蛋白、干扰素肝素某些凝固蛋白、血浆蛋白、脂蛋白、核酸相关酶、受体等Procion Red HE-3BNAD(P)依赖性脱氢酶、干扰素、抑制蛋白、纤溶酶原单克隆抗体特定抗原赖氨酸纤溶酶、纤溶酶原、纤溶酶原激活剂过渡金属离子含组氨酸的多肽或蛋白质 配体的浓度z 一般使用较高的固定化配体浓度一般使用较高的固定化配体浓度z 配体亲和力高，且本身带电则浓度须
4、降低配体亲和力高，且本身带电则浓度须降低z 配体浓度过高引起色谱畸变。配体浓度过高引起色谱畸变。 (与很多物质发生非特异性结合与很多物质发生非特异性结合) 配体的选择配体的选择 1. 考虑亲和势L + S LSKl= LS/LS要求Kl在10-410-8mol/L之间 2. 与L的偶联不破坏L与S的结合 3. 需了解L-S的作用机制 如 z例：酶例：酶 有单底物反应、双底物反应有单底物反应、双底物反应z单单 A P E E EA EP 底物A、产物P或它们的类似物都可以双底物依次双底物依次z A B P Q E E EA EAB EPQ EQ 须选择A、若选B则吸附时须加A双底物随机双底物随机
5、z A（B） B（A） P（Q） Q（P） E E EA EA（B） EPQ A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。第三节第三节 亲和层析载体亲和层析载体一、作为载体的条件一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好二、载体的选择二、载体的选择 1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价
6、，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。 三、手臂（Spacer arm） 在载体和配基间引入适当长度的“手臂”，减少载体的空间阻碍，增加配基的活动度。示意图如下： z连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂疏水性手臂（其长短对吸附的影响大）或具氨基、羧基的亲水性手臂亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大）；z疏水性手臂具体选择应考虑： 分离物质分子量大小 亲和势大小 过长手臂易弯曲、折叠等；z最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3-二氨基二丙胺。 接有连接臂的亲和层析用载体接有连接臂的亲和层析用载体载体连接臂供应商琼脂糖3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基Bio-Rad3,3-二氨
7、基丙基和琥珀酰二氨基丙基Bio-Rad1,2-二氨基乙烷, 1-二氨基己烷, 3,3-二氨基二丙胺ICN1,6-己二胺, 6-氨基己酸Pharmacia3,3-二氨基丙基胺, 对苯甲酰基-3,3-二氨基丙基胺Serva氨基烷基(2,4,6,8,10)Miles聚丙烯酰胺-琼脂糖1,6-己二胺, 6-氨基己酸IBF多孔玻璃氨基丙基, 氨基己基Merck 第四节第四节 亲和吸附剂的制备亲和吸附剂的制备 一、要求 . L与基质结合，对L-S结合无干扰； . L为小分子有的需“手臂”，使L-S结 合更有效； . 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。 二、二、 偶联用偶
8、联用GelGel的选择的选择 需考虑： . L上可供偶联的基团 . “手臂” . L的稳定pH 三、三、 由由CNBr活化型活化型Sep.4B制备制备 商品名：CNBr-Sepharose一般步骤：一般步骤：冻干粉 溶胀洗涤 混合反应 掩蔽 溶解L 洗去L（未结合） 成品 . 溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子 . 偶联条件注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH. 掩蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。. 洗去未结合L用高-低交叉pH来洗（45次） 亲和吸附剂的制备过程 封闭未反应的活化基团z 载体上活化基团浓度
9、525mol/ml z 偶联上的配体浓度 110mol/mlz 封闭试剂 pH8.0，1mol/L乙醇胺 甘氨酸 巯基乙醇 室温反应1h配体浓度评估配体浓度评估z 差示分析法 z 直接测定法 z 放射分析法 z 水解法 连接臂的连接连接臂的连接z 连接臂先接配体后偶联至载体z 连接臂先偶联至载体后接配体 四、四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-SepSep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）： 琼脂糖等多糖类载体z溴化氰法 最常使用，简单温和，活化效率高，速度快；反应可逆，剧毒，可能带上电荷z双环
10、氧法(p140-145) 产生亲水连接臂，不带电荷，稳定，偶联配体数量少于溴化氰法z二乙烯砜法反应性能强，适合于偶联羟基配体；剧毒，昂贵zN,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯法 稳定，不带电荷z有机磺酰氯法 对甲苯磺酰氯、三氟代乙磺酰氯 可释放生色基团，可用于监测偶联反应z碳化二亚胺交联法其他方法z羰基二咪唑（CDI）法z高碘酸盐法z磺化氟甲基吡啶鎓法zN-羟基琥珀酰亚胺法其他亲和吸附剂z聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固定到其活化基团上;z硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载体引入氨基或环氧基团.z戊二醛法 OHC(CH2)
11、3CHO 与载体酰胺基团结合，并与配体氨基结合 简单、便宜、稳定，引入连接臂，有中等毒性z肼解法 -CONH2 CONHNH2 CON3 CONH-LNH2NH2NaNO2L-NH2 类专一性亲和吸附剂 . 固定化凝集素（本质是蛋白质）可用来分离糖、糖蛋白 如 . 固定化多聚核苷酸可用来分离NA、核蛋白 如 . 染料亲和吸附剂以染料为配基，用来分离酶类、干扰素等 第五节第五节 一般实验方法一般实验方法是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无 选L 选偶联Gel 偶联L 装柱安装仪器安装仪器 平衡（平衡（23Vt） 加样吸附加样吸附 洗去非吸附物洗去非吸附物亲和柱亲和柱 洗脱液洗脱液 再生再生 脱
12、盐脱盐 一、亲和吸附柱的预备 . 亲和吸附剂选择或制备 效能小试：据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t . 用10Vt始缓洗，若目的物未流出，说明吸附性能好，0.9 . 不断加样到目的物流出，确定吸附容量 . 柱 H/D 高度专一 短 类专一 长 平衡 一般23Vt始缓 二、二、 加样吸附 . 样品平衡（透析或SephadexG-25）. 样品体积Vs（一般5%） 若结合紧密，Vs可较大；不紧，Vs要小. 洗去非吸附物（10Vt始缓洗） 三、洗脱（以S不变性为前提） 类专一：选择性洗脱、有分级分离要求、梯度或阶式洗脱。 样品准备 加样前样品应当澄清，不含颗粒状物质，有适当的pH值、离子强度
13、以利于目标分子的结合z离心（10000rpm）或过滤（0.45或0.22m滤膜）除去不溶物z对复杂样品如组织细胞、植物材料、发酵产物，应预处理，如超声破碎、溶解、均质、抽提、过滤、离心等z盐析、离子交换层析z透析或凝胶过滤完成脱盐、缓冲液交换加样吸附z目标分子与配体形成复合物而吸附在层析柱上z起始缓冲液的选择：配体-目标分子作用类型 疏水键，提高离子强度，不要采用低温操作；离子键，降低离子强度z流速：低压亲和层析，流速50cm/h；高效液相亲和层析，流速50125cm/h。若结合力弱，应降低流速z加样量：不超过亲和吸附剂的吸附容量洗去杂蛋白z5倍床体积的起始缓冲液洗去未吸附物质，直至紫外纪录曲
14、线回到基线z亲和柱上存在较多的非特异性吸附，而目标分子结合牢固，可选用介于起始缓冲液和洗脱缓冲液之间的条件洗杂蛋白z例：起始缓冲液 0.05mol/L磷酸缓冲液 洗脱缓冲液 含1mol/L NaCl的磷酸缓冲液可用含0.5 1mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗去杂蛋白洗脱z专一性洗脱和非专一性洗脱非专一性洗脱z改变缓冲液的离子强度 配体与目标分子间如果是 离子作用：升高离子强度 疏水作用：降低离子强度 离子强度变化方式：阶段式、梯度式z改变缓冲液的pH值 改变表面带电基团的电性和电量，从而破坏离子键 阶段式为主 z改变缓冲液的极性 配体和目标分子依靠较强的疏水作用结合时，可以往洗脱液中添加一定
15、比例的有机溶剂z使用洗涤剂 极端疏水性蛋白质，如：膜蛋白 最好使用在280nm附近无吸收的非离子型洗涤剂，如NP-40, Lubrolz使用促溶盐（chaotropic salt） 促溶盐能破坏水的结构，降低配体-蛋白质间疏水作用的强度 亲和层析洗脱时常用的促溶剂有13mol/L硫氰化钾、13mol/L碘化钾、4mol/L MgCl2z使用蛋白质变性剂 8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍 蛋白质沉淀（盐析）效应增加阴离子：PO43, SO42, CH3COO, Cl, Br, NO3, ClO4, I, SCN阳离子：NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, C
16、a2+, Ba2+蛋白质促溶（盐溶）效应增加 Step elution Gradient elution z专一洗脱(亲和洗脱) 使用配体，如：用不同的核苷酸将脱氨酶从染料柱上洗脱 使用能与配体结合的分子，如：用游离糖将糖蛋白从凝集素柱上洗脱 优点：洗脱条件温和，目标分子不会变性 缺点：价格昂贵，配体与目标分子结合后需要进一步分离Competing binding substance in solutionElution of glycoproteins from Con A Sepharose by a-D-methylmannosideSpecific eluents+Competing
17、ligand in solutionElution of enzymes from Blue Sepharose by free NADH+洗脱方式总结洗脱方式总结: . pH变化（破坏静电引力） . I变化 （减弱静电引力、范德华力） . 亲和洗脱 L的类似物L，S的类似物S *采用酶促反应的多元专一性洗脱 . 表面活性剂 减少疏水作用、范德华力 种类常有：曲通X100 1%（V/V）、乙二醇等 . 解离试剂主要破坏氢键，如尿素、盐酸胍等. 降低温度t较高t吸附、较低t洗脱、减少疏水力. 电泳解吸 +在柱两端连上电极进行电泳 四、脱盐 - 五、再生 再生和保存再生和保存 z再生的目的是除去所
18、有仍然结合在柱上的物质 几个床体积的起始缓冲液再平衡 采用高浓度盐溶液，如2mol/L KCl 根据配体的稳定性升高和降低pH值、加入洗涤剂、使用尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶 z保存时应加抑菌剂，如0.02%W/V叠氮钠 第六节第六节 其它亲和色谱简介 一、 共价色谱 利用形成和破坏共价键能力的差异分离其共价键常为二硫键S-S 主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽 基本层析过程 二、金属螯合色谱二、金属螯合色谱 原理 His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。 固定方法： 将环氧活化型Sepharose6B与金属螯合剂偶联成配基
19、，再用金属离子处理。如 洗脱：采用增加I或降低pH或加入EDTA 原理原理原理z蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物 金属螯合亲和层析材料金属螯合亲和层析材料 z载体 Sepharose 4B或6B，亲水树脂z配体 亚氨基二乙酸（IDA）：3个配位基团 三（羧甲基）乙二胺（TED）：5个配位基团z金属离子 Cu2+ Ni2+ Zn2+ Co2+ Ca2+, Mg2+ 金属螯合亲和层析实例金属螯合亲和层析实例z纯化带六聚组氨酸（6xHis）末端的基因重组酶NAD激酶z样品准备 重组NAD激酶表达菌离心，分散于起始缓冲液，超声破碎细胞，离心提
20、取上清得粗酶液 z层析材料 Ni-chelating，以亚氨基二乙酸作为配体的环氧乙烷活化琼脂糖凝胶，螯合离子为镍离子 z装柱 10Vt 50mmol/L EDTA-0.5mol/L NaCl除去杂质，5Vt蒸馏水清洗，0.6Vt 0.1mol/L NiSO4固定金属离子 z起始缓冲液 20mmol/L KPB, pH7.5、0.1mmol/L NAD、0.5mmol/L二硫苏糖醇、0.5mol/L NaCl、10mmol/L咪唑 z加样、吸附、洗去杂质z洗脱液 10mmol/L0.5mol/L咪唑梯度缓冲液解吸 z清洗和再生 强螯合剂0.05mol/L EDTA ,0.5mol/L NaCl
21、再生亲和柱，5Vt蒸馏水洗涤，储存于20%乙醇 00.511.522.533.5010203040elution tubeNAD kinase activity(/min/ml)00.511.522.533.54A280A280NAD kinase activityA280 of imidazole gradient0蛋白质(mg)NAD激酶活性(U)回收率(%)比活(U/mg)纯化倍数()细胞提取液880111000.01251Ni-亲和层析4.66.353.681.3679107 四、有机染料亲和色谱 有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对
22、这些染料具一定亲和力。 Dye-stuffsCibacron Blue 3G-A mimics NADHMatrixSO3NaNNNOONHNH2NHONHRSO3Na染料配体亲和层析z以仿生染料，主要是三嗪染料作为配体的亲和层析 z常用的染料有Cibacron blue F3GA（多芳香环的磺化物）和Procion Red HE3B，多以Sepharose作为载体，前者称蓝色Sepharose，后者称红色Sepharosez具有一定的阳离子交换作用，应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附作用 原理原理 z蓝色染料Cibacron blue F3GA在结构上与NAD+和NADP+很相似，用
23、于纯化NAD+、NADP+依赖性酶，如各种激酶、磷酸酶、脱氢酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等z红色染料Procion Red HE3B用于纯化NADP+依赖性酶，如某些脱氢酶，以及其他非相关蛋白质，如干扰素、抑制蛋白、羧肽酶G、血纤蛋白溶酶原等，结合不仅依赖于特定基团，还依赖于离子键或疏水相互作用 材料材料 z制备：偶联到6%交联琼脂糖（Sepharose CL-6B）z商品化染料亲和吸附剂 Red Sepharose CL-6B染料配体亲和层析实例染料配体亲和层析实例z从Candida utilis中分离NADP+依赖型酶 吸附缓冲液：中性pH缓冲液 洗脱缓冲液： 专一性洗脱：含NAD+
24、或NADP+的缓冲液 非专一性洗脱：增加离子强度至2M NaCl 或1M KCl A：非吸附蛋白，B：6-磷酸葡萄糖脱氢酶，C：谷氨酸脱氢酶，D：谷胱甘肽还原酶，E： 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶五五 凝集素亲和层析凝集素亲和层析z凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合z不同的凝集素结合不同的糖分子z用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等凝集素分子量亚基数目特异性洗脱糖类所需离子伴刀豆球蛋白A550002/4-D-甘露糖-D-葡萄糖-甲基甘露糖-甲基葡萄糖Ca2+ Mn2+扁豆凝集素490002-D-甘露糖-D-葡萄糖-甲基甘露糖-
25、甲基葡萄糖Ca2+ Mn2+豌豆凝集素490004()-D-甘露糖-甲基甘露糖蓖麻凝集素1200004-D-半乳糖乳糖，半乳糖蓖麻凝集素600002-D-N-乙酰半乳糖胺-D-N-乙酰半乳糖胺麦芽凝集素360002N-乙酰葡糖胺N-乙酰葡糖胺Ca2+ Mn2+ Zn2+大豆凝集素1100004-D-N-乙酰半乳糖胺-D-N-乙酰半乳糖胺半乳糖植物血球凝集素1280004-D-N-乙酰半乳糖胺-D-N-乙酰半乳糖胺Ca2+ Mn2+凝集素亲和吸附剂的合成z据待分离物质所带糖基选择适当的凝集素作为配体z选择载体 一般选用商品化的活化载体，如CNBr-活化的Sepharose-4B，CDI-活化的S
26、epharose等z偶联z封闭活性位点凝集素亲和层析实例凝集素亲和层析实例z人细胞表面抗原的纯化 吸附剂：ConA Sepharose-4B ConA：伴刀豆球蛋白A，是从刀豆中分离出的四聚体金属蛋白，与-D-甘露糖，-D-葡萄糖结合 吸附缓冲液：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1mM MnCl2，1mM CaCl2，pH7.4 洗脱缓冲液：0.10.5M 甲基-D-葡萄糖或甲基-D-甘露糖z填充层析柱，用10Vt的吸附缓冲液清洗并平衡柱子z以15cm/h的流速加样z用5-10 Vt的吸附缓冲液洗去杂蛋白，直至洗脱液中不含任何杂质分子（用A280监测）z用5 Vt的洗脱缓冲液进
27、行洗脱操作步骤第七节 应用 （p161-166)抗体和抗原的纯化 酶的纯化酶的纯化 糖蛋白和脂蛋白的纯化 其它蛋白质 细胞的纯化分离酶蛋白分离酶蛋白z利用酶的底物、底物类似物、产物、辅助因子、激活剂、抑制剂等作为配体，采用亲和层析可以分离多种酶z层析材料 大多制备 商品化吸附剂（NAD、GSH等作为配体）z分离胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase） 10g预活化Sephadex LH20浸入100mL饱和胆固醇乙醇溶液充分溶胀装入2.610cm层析柱 35Vt pH7.5, 5mM磷酸钾缓冲液平衡，使胆固醇完全结晶加入15mL待分离样品15Vt 缓冲液洗去杂质含不同浓度Trit
28、on X-100的缓冲液洗脱不同表面活性剂浓度下胆固醇氧化酶的亲和层析分离图谱 z分离谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs） GST是机体内一组具有解毒作用的同工酶家族，由两个亚基组成的二聚体z亲和层析介质Sepharose 4B-GSH的制备 Sepharose 4B在碱性条件下，加入环氧氯丙烷和二氧六环活化，将GSH偶联到载体上z样品的准备 4g兔肝剪碎，加入约10倍重量的Buffer A，用组织捣碎机匀浆，低速离心10min，弃沉淀，上清再次离心（4C，100 000g，40min），弃沉淀，滤纸过滤上清液z结合缓冲液（Buffer A）：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mM二硫苏糖醇（DTT），1mM EDTA，0.2M NaClz洗脱缓冲液（Buffer B）： 0.025M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mM GSH，2mM DTT上样平衡洗脱兔肝匀浆液及纯化样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 思考思考1、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。2、亲和层析吸附剂制备时，为何常引入 “手臂”？3、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。4、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围。 课后报告课后报告 实例分析新型亲和层析的应用价值和发展趋势
