1、 基因编辑技术 CRISPR/Cas 的研究进程 CRISPR/Cas 的结构、分类及作用机制 CRISPR/Cas 在基因治疗中的应用 存在问题和展望第一部分基因编辑技术基因编辑技术 2016年5月2日河北科技大学副教授韩春雨在自然-生物技术发表论文NgAgo-DNA单链引导的基因编辑工具。基因编辑技术 基因编辑技术是通过人为操作引起特定基因的插入、缺失或替换等，对基因组进行精确修饰和定向编辑的一种技术。 Cre-LoxP重组酶系统：Cre 重组酶是一种具有催化活性的单体蛋白,它与限制酶功能相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被删除或重组。基因编
2、辑技术 RNA干扰：大片段双链RNA小分子干扰RNA二聚体酶DicerRNA+沉默诱导复合体RISC配对影响翻译基因编辑技术 锌指核酸酶 （ZFNs ） 转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs） 基于特制的 DNA-结合特异性的蛋白质系统，通过束缚核酸内切酶的催化区域，调节 DNA 结合蛋白，引起特定位点的靶向双链 DNA 断链。 人工内切核酸酶技术ZFNsTALENs将识别特异DNA序列的TALEN与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALENs基因编辑技术 规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas）：通过一小段与靶向 DNA 碱基互补配对的RNAs 及其引
3、导 Cas 蛋白，引起 DNA 位点特异性靶向双链 DNA 断链，产生靶基因修饰。 人工内切核酸酶技术第二部分研究进程CRISPR/Cas 的研究进程1987年2000年2002年日本Ishino在大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近第一次发现CRISPR串联重复序列。Mojica发现这种串联重复序列在原核细胞中广泛存在。科学家正式命名CRISPR和Cas基因。2005年发现 CRISPR中的间隔序列来源于外源基因，并推测其可能与细菌和古生菌的获得性免疫相关。CRISPR/Cas 的研究进程2007年2008年2009年Barrangou首次实验证实CRISPR系统的获得性免疫作用。Brouns发现间隔
4、序列可以转录形成 crRNAs ，具有指导 Cas 蛋白靶向干扰的作用。Marraffini 发现 CRISPR/Cas系统系统的作用靶点是DNA。Hale 发 现 III 型 B 亚 型 的CRISPR-Cas系统还可以靶向性切割RNA。2011年Deltcheva 发现 II 型 CRISPR-Cas系统中另一个重要组分tracrRNA，它与 crRNA 结合形成二元复合体，指导 Cas9 蛋白的定点剪切。Sapranauskas证实 II 型CRISPR-Cas系统可以异源性地表达在其它物种。CRISPR/Cas 的研究进程2012年2013年2014年珍妮弗杜德娜和艾曼纽夏邦杰首次体外
5、证实 Cas9 蛋白可以与靶DNA 特定位点结合并行使剪切作用。获2015年生命科学突破奖。CRISPR-Cas系统首次被成功应用于真核细胞的基因编辑。解析Cas9蛋白的晶体结构。2015年全新基因编辑系统CRISPR/Cpf1。CRISPR/Cas 的研究进程2016年12月CRISPR/Cas重大进展梳理1.Nature：发现两种新的CRISPR系统：CasX和CasY系统2.Cell：首次发现CRISPR/Cas9基因编辑的“关闭开关”3.Cell：发现两种新的抗CRISPR蛋白：AcrIIA2和AcrIIA4，能阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶活性4.Nat Genet：利用CRISPR
6、鉴定出潜在的HIV治疗靶标5.Science：利用CRISPRi鉴定出细胞生长所需的499个lncRNA6.Nat Methods：开发出自我编辑的CRISPR条形码7.Cell：将CRISPR和单细胞RNA测序结合在一起分析基因功能 第三部分 CRISPR/Cas结构 、分类及作用机制 CRISPR/Cas 的结构 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为规律成簇间隔短回文重复序列，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。CRISPR/Cas
7、 的结构 Cas 基因主要编码核酸酶和 DNA 解旋酶等切割修饰核酸的相关的 Cas 蛋白。前导序列保守的重复序列区长度为2148bp含有回文序列，可形成发夹结构。间隔区由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆。富含AT长度为300500bpCRISPR/Cas 的分类间隔区俘获外援DNACRISPR/Cas 的分类CRISPR/Cas9 的作用机制PAM：（protospacer adjacent motif）间隔相邻基序，该序列由NGG3个碱基组成，位于 DNA 结合区域上游并且紧邻结合区域处。帮助 crRNA 识别和获取靶位点片段; 在干扰过程中帮助该核糖核蛋白复合物区分自身的 DNA 和外
8、援入侵的DNA。CRISPR/Cas9 的作用机制PAM：（protospacer adjacent motif）间隔相邻基序，该序列由NGG3个碱基组成，位于 DNA 结合区域上游并且紧邻结合区域处。CRISPR/Cas9 的作用机制tracrRNA ：(反式激活CRISPR RNA) 与CRISPR重复序列互补的一段25 bp 的核酸序列pre-crRNA：整合后的间隔序列首先被转录为CRISPR前体RNAcrRNA：pre-crRNA在RNase作用下进一步加工形成 成熟的CRISPR源性小RNACRISPR/Cas9 的作用机制 将crRNA 与部分 tracrRNA融合成一条约 10
9、0 bp 的单链向导链( single guide RNA，sgRNA) ，使其同时具有crRNA 和 tracrRNA 的特性，并且在随后的实验中发现，sgRNA同样可以引导 Cas9 切割目标 DNA。由于靶位点与 g RNA 特异互补的区域最多只有 20 nt 长度因此，在设计g RNA 结合区域时也只能在 20 bp 的长度内。 sgRNACRISPR/Cas9 的作用机制Cas9 核酸酶中存在一种晶体结构识别瓣叶 （REC）：核酸酶瓣叶 （NUC）HNHRuv C PAM 区域（5-GG-N18-NGG-3）RuvC：Cas9氨基末端，剪切crRNA非互补链。HNH：Cas9蛋白质中
10、部，剪切crRNA的互补DNA链。识别并结合 g RNA 和目标 DNA 的复合体。CRISPR/Cas 的作用机制将CRISPR/Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：Cas酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段；导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。CRISPR/Cas9 的作用机制CRISPR系统介导的免疫机制的3 个阶段新的间隔序列的获取；CRISPR/ Cas 系统的表达，包 括 转 录 和 转 录 后 的 加 工； CRISPR/ Cas 系 统 对 外 源 基 因 的 干 扰。易错配的非同源性末端连接高保真性的同源重组修复 先从同源D
11、NA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，再用新合成的序列补上母链空缺。CRISPR/Cas9 对 DNA 损伤的修复 为了避免DNA或染色体断裂的滞留，强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。第四部分在基因治疗中的应用CRISPR/Cas 在基因治疗中的应用 对于功能缺失型突变引起的基因遗传病，可利用CRISPR/Cas9 将功能基因片段插入，改正引起疾病的突变体; 对于显性基因遗传病，可利用 CRISPR/Cas9引起 NHEJ 使显性致病基因切除; 对于基因重复复制所引起的疾病，CRISPR/Cas9用多个 sgRNA 同时引起多个 DSB 切除重复区域
12、。 CRISPR/Cas9 也可直接用于体细胞定向基因编辑，将细胞在体外进行定向编辑，再融入患者体内，定向修饰基因。CRISPR/Cas9 在 HIV-1 病毒治疗中的应用 HIV-1基因的表达由长末端重复序列(LTR) 启动子和增强子活性调控。构建敲除LTR 的 CRISPR/Cas9 系统破坏 HIV-1 基因组中长末端重复序列( LTR) 启动子，从而大大地降低了 HIV-1 在感染细胞内的表达。利用CRISPR鉴定出潜在的HIV治疗靶标 利用CRISPR对源自HIV敏感性的CD4阳性T细胞的一种细胞系进行筛选，研究人员描述了如何利用CRISPR 筛选HIV感染但不是细胞存活所必需的人基
13、因的方法鉴定出5个基因。当让它们失活时，会让细胞免受HIV感染，同时不会影响细胞存活。 除了CD4和CCR5之外，这种筛选方法鉴定出编码两种酶的基因-TPST2和SLC35B2：它们对CCR5进行修饰以便HIV结合。 另一个被鉴定出的基因是ALCAM，它参与细胞间粘附。当CD4阳性T细胞接触低水平HIV病毒时，ALCAM缺失与显著地抵抗HIV感染相关联。CRISPR/Cas9 与 iPS 技术共同用于基因治疗 DNA 甲基转移酶 3B( DNA-Methyltransferase 3B，DNMT3B) 基因突变引起免疫缺陷，着丝粒不稳定，面部异常综合征( ICF) 。 Cas9 载体定向打靶
14、DNMT3B 基因的 sgRNA 载体 诱导性多能干细胞 (iPS) 细胞 成功破坏 DNMT3B 等位基因的 iPS 细胞共转染CRISPR/Cas9移除细胞中的HAT酶增加胰岛素产生 组蛋白乙酰转移酶（HAT）在调节基因TXNIP中发挥着至关重要的作用。在高血糖水平情形下，TXNIP导致细胞死亡，并且降低胰岛素产生。 研究人员对来自2型糖尿病患者和来自健康人的产生胰岛素的胰岛进行比较，结果发现糖尿病细胞中的HAT基因活性比健康细胞高出2倍。 利用CRISPR/Cas9，瑞典隆德大学糖尿病中心的研究人员移除遗传密码中控制来自大鼠的产生胰岛素的细胞中的HAT酶功能的序列。这导致TXNIP基因活
15、性下降，因而降低细胞死亡和增加胰岛素产生。第五部分存在问题和展望CRISPR/Cas 脱靶效应及改进方法 脱靶效应是由于 Cas9 蛋白可容忍 sgRNA 和靶向DNA在 5端的错配。Cas9进入细胞后，有可能在非目标位点进行酶切，从而导致脱靶。降低 Cas9 和sgRNA在细胞内的表达浓度减少sgRNA 5端的互补序列，与没有减短的 sgRNA 打靶活性相同，但大大降低了脱靶位点引起的突变效应，同时提高了 sgRNA DNA 错配的敏感性，从而降低突变效应。改造 Cas9 蛋白结构。Cas9 突变体 Cas9n 切口酶切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径( base-excisi
16、on repair，BER) 修复，不会在基因DNA 上造成突变。通过两个 Cas9n 产生两个单链 DNA断裂( single-strand break，SSB) 或在不同 DNA 链上产生缺口以造成双链 DNA 断裂的策略，可有效避免脱靶突变。CRISPR/Cas 脱靶效应及改进方法脱氨基反应形成去嘧啶位点（AP位点）糖苷水解酶能特异性切除受损核苷酸的N-糖苷键AP核酸内切酶切开受损核苷酸的糖苷-磷酸键，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNACRISPR/Cas 的安全隐患 借助病毒载体把编码Cas9的DNA带入细胞。在Cas9完成切割任务之后细胞仍会继续生产这种蛋白，机体可能会对其产
17、生免疫反应。 基因编辑的细胞会死亡，患者需要进行多次治疗。 基因导入和编辑途径都会受病毒载体可携带DNA量的限制。目前必须使用两种不同的病毒载体将CRISPR组件导入到细胞中，这比使用单个载体效率更低。CRISPR/Cpf12015 年 9 月，张锋等又找到了一种新型的 CRISPR系统CRISPR/Cpf1，与Cas9相比，Cpf1有以下三大优势：Cpf1剪切DNA只需要一个小RNA分子，Cpf1酶比标准的SpCas9要小，更容易进入组织和细胞。Cpf1剪切后形成两个不同长度的链，粘性末端让DNA插入更可控。Cpf1剪切时离识别位点很远，在编辑位置的选择上有了更多的选项。CRISPR/Cpf
18、1 CRISPR/Cpf1系统能够克服Cas9靶向多个基因位点的限制。研究表明，Cpf1加工自身CRISPR RNA (crRNA)的能力可用于简化多重基因组编辑。使用单个定制的CRISPR阵列（array），研究人员实现了在哺乳动物细胞中同时编辑多达4个基因，在小鼠大脑中同时编辑3个基因。基因编辑涉及的伦理问题 Cas9 蛋白识别的 PAM 序列 ( 5 AGG 3) 在人类基因组中平均每 8 个碱基就会出现一个。 2015 年3月，我国中山大学的研究小组利用CRISPR / Cas9 基因编辑技术对人类胚胎中导致 型地中海贫血症的基因进行修饰。 他们针对致病基因设计和生成了 3 个 gRN
19、A，并将其与 CRISPR /Cas9 基因一起重组进表达载体中，然后注入收集到的 86 个三原核胚胎，结果获得 71 个存活胚胎，并对其中的54 个进行遗传检测。 检测结果显示: 有 28 个获得了成功的剪切。这是人类首次对自身胚胎进行基因编辑的尝试。基因编辑涉及的伦理问题234 被改造的基因和其他基因的关系搞清楚了吗? 改造某个基因，产生的影响有多大? 聪明等基因呢? 能否被改造? 这种改造是不可逆的，而且会随着生殖而遗传，一旦出现了不合适的改造，如何来纠错? 致病基因可以被改造，那么其他诸如高矮、胖瘦、聪明等基因呢? 能否被改造? 改造必然影响人类基因的多样性，这会影响人类的进化吗? 1
