1、中药指纹图谱中药指纹图谱李文娟中药指纹图谱中药指纹图谱简介简介1中药指纹图谱研究方法中药指纹图谱研究方法2中药指纹图谱研究内容中药指纹图谱研究内容3中药指纹图谱的建立与评价中药指纹图谱的建立与评价4中药指纹图谱中药指纹图谱示例示例51. 中药指纹图谱简介中药指纹图谱简介1.1 1.1 指纹图谱的起源与发展指纹图谱的起源与发展 中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的概念，指纹图谱技术应用于植物药质量控制的历史沿革：20世纪70年代 色谱技术的发展，人们大量采用薄层色谱（TLC）方法，将植物中 化学成分展载于由各种担体铺成的薄层板上。根据薄层板上的斑点的位置、 斑点大小、斑点、颜色、斑点数目的多
2、少进行定性鉴别，这种薄层鉴别方 法具备了指纹图谱的特征。20世纪70-80年代出现薄层扫描仪，日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图 作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。20世纪80-90年代高效液相技术得到发展，同时植物药中化学成分的分离鉴定、活性成分的 不断阐明，高效液相广泛应用于定性、定量分析。西方普遍采用高效液相 色谱法对植物药中已知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。目前高高 效液相色谱法效液相色谱法已成为当前研究指纹图谱的主要手段主要手段。 中药化学信息：植物药（包括来源于植物的中药材）的提取物（包括植物药（包括来源于植物的中药材）的提取物（包括中药的汤药）与化学合
3、成药最根本的区别是，它（即使是单味药材）是多种化中药的汤药）与化学合成药最根本的区别是，它（即使是单味药材）是多种化学成分的混合体。这种多种化学成分的综合体构成了学成分的混合体。这种多种化学成分的综合体构成了“中药化学信息中药化学信息”。由于。由于中药的疗效由多种成分的协同作用或中药的疗效由多种成分的协同作用或“相克作用相克作用”，中药中的化学信息有一定，中药中的化学信息有一定的模糊性。只有部分化学信息（包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一的模糊性。只有部分化学信息（包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分）可表征于指纹图谱中。部分未知成分）可表征于指纹图谱中。1.2 1.2
4、中药指纹图谱的定义中药指纹图谱的定义中药指纹图谱，即中药身份证，主要指中药化学指纹图谱，实中药指纹图谱，即中药身份证，主要指中药化学指纹图谱，实际上是一种保证中药质量的措施，是指对某种中药材或中成药际上是一种保证中药质量的措施，是指对某种中药材或中成药等运用现代分离分析科学的手段，得到能够标示该中药的色谱等运用现代分离分析科学的手段，得到能够标示该中药的色谱或光谱的图谱，最终用来对中药质量评价的科学性方式。或光谱的图谱，最终用来对中药质量评价的科学性方式。特点：通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地。通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地。1.1.通过指纹图谱主要特征峰的面
5、积或比例的制定，能有效控制产品的质通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。量，确保产品质量的相对一致。1.3 1.3 指纹图谱在中药评价中的应用指纹图谱在中药评价中的应用 指纹图谱在评价中药质量中的作用主要可以概括为观察指指纹图谱在评价中药质量中的作用主要可以概括为观察指纹图谱的整体特征以鉴别生产前药材的真伪纹图谱的整体特征以鉴别生产前药材的真伪; ; 指纹图谱可以区分植物药材的不同部位指纹图谱可以区分植物药材的不同部位; ; 可以考察商品药材及成药的质量可以考察商品药材及成药的质量; ; 从标准指纹图谱可追踪制剂中某些化学成分的变化从标准指纹图
6、谱可追踪制剂中某些化学成分的变化; ; 可以检测原料与成品之间可以检测原料与成品之间, , 成品的批间质量的稳定性。成品的批间质量的稳定性。 由次生代谢产物组成的中药提取物的色谱指纹图谱不仅具由次生代谢产物组成的中药提取物的色谱指纹图谱不仅具备个体的绝对的惟一性，更强调的是物种特征的惟一性与备个体的绝对的惟一性，更强调的是物种特征的惟一性与同种植物中的相似性。同种植物中的相似性。1.41.4中药指纹图谱的分类中药指纹图谱的分类中药指纹图谱按应用对象应用对象分类，根据中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段，可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中
7、药制剂指纹图谱。如分得更细，还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。两种中药原料药指纹图谱应区别对待。对中药饮片指纹图谱的要求基本和中药材指纹图谱相同。对中药配伍颗粒(包括标准提取物)指纹图谱应要求高一点 。 中药指纹图谱按测定手段测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱系指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。光谱最常用的是红外光谱(IR)。色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。其他方法包括波谱和联用技术。中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用中药化学指纹图
8、谱首推色谱方法和联用技术技术。TLC法简便易行，但提供信息量有限，很难反映几十种、上百种化学成分组成的复杂体系。GC适用于挥发性化学成分。HPLC适用于非挥发性成分，中药中大部分化学成分均可用HPLC法得出良好的指纹图谱。CE适用于大部分化学成分，特别是生物大分子肽和蛋白的分离，但其重现性有待提高。1.5 1.5 中药指纹图谱建立的意义与原则中药指纹图谱建立的意义与原则 中药指纹图谱建立的是全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。 中药
9、指纹图谱的建立，应以系统的化学成分和药理学研究为依托，应体现系统性系统性、特征性特征性、重现性重现性三个基本原则。 实现中药指纹图谱的三原则，保证其标准化，做到统一规范，这样才可以使中药指纹图谱得以推广应用。 “系统性系统性”是指指纹图谱所反映的化学成分应包括中药有效部位所含大部分成妥的种类，或指标成分的全部。 “特征性特征性”是指指纹图谱中反映的化学成分信息（具体表现为保留时间或位移值）是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。 “重现性重现性”是指所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图
10、谱，其误差应在允许的范例内，这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备的特征之一。 实现指纹图谱的重现性，除在样品制备方法、分析过程、结果处理待环节规范操作外，还应建立相应的评价机制，对指纹图谱进行客观评价，并公布标准指纹图谱。2.中药指纹图谱研究方法学中药指纹图谱研究方法学2.1 2.1 常用指纹图谱研究的方法与技术常用指纹图谱研究的方法与技术 运用包括光谱、波谱、色谱、核磁共振、运用包括光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术的联用等现代分析技术，将中药化射线衍射及各种技术的联用等现代分析技术，将中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图
11、）等方式进行表达；并且对指纹图谱经过学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；并且对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。研究对象的不同，指纹图谱研计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。研究对象的不同，指纹图谱研究的方法与技术也不同，并都随着现代科技技术的发展而发展，中药指纹图谱研究所采用的方法大致究的方法与技术也不同，并都随着现代科技技术的发展而发展，中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为：分为：色谱法色谱法：薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（CE）；光谱法光谱
12、法：紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、近红外光谱法（NIR）；核磁共振法（NMR）等。色谱联用技术色谱联用技术：将色谱良好的分离能力与光谱或波谱特有的结构鉴别能力相结合并借助近年来发展起来 的化学计量学技术和己有的光谱波谱标准库，是完全可能对大部分中药的化学成分进行定性 和相对定量分析的。目前色谱光谱联用技术如:GC-MS 、HPLC-MS已经在中药指纹指纹图谱研 究领域内获得了一定的成功。薄层色谱薄层色谱( (TLC)TLC)特点特点：由于操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色 彩斑澜的彩色图像，直观易辨，在中药鉴别中应用频率最高。采用合格材料和标准操作，可得到高质量
13、的色谱图像，于同板同时比较鉴别多个样品，配合数码成像和数据处理，还可瞬间形成轮廓图谱，并给出各峰积分值，加大信息量，从而提高综合分析能力，比较适合原料药材指纹图像分析。应用：应用：TLC作为主要的鉴别方法被多国植物药典收载。中国药典)2000年版一部采用薄层色谱法作鉴别的品种已达602种，占所收载的中药材的60以上。近年来TLC指纹图谱的研究也较多，谢培山等对人参、西洋参、三七，在优化的规范操作条件下得到的薄层色谱荧光彩色图像，在同一板上形象地比较了3个样品的异同。颜玉贞等对黄连TLC指纹图谱研究发，其荧光及紫外扫描轮廓图可用以鉴别黄连。李彩君等对高良姜中黄酮类成分进行了薄层色谱指纹图谱研究，
14、可有效地鉴别高良姜。薄层色谱可同时鉴别多个样品。缺点：缺点：存在着效能低、灵敏度差的缺点。而且其层析系统是一开放体系。要想得到稳定、重现性好的图谱，必须严格控制实验条件。其提供的信息有限对于成分复杂的中药及其复方制剂难以用TLC指纹图谱来鉴别及评价质量。 气相色谱气相色谱( (GC)GC)特点：特点：以气体为流动相，对于含挥发性成分中药的鉴别具有一定优势。由于裂解气相色谱具有操作简便、样品无须化学前处理、提供信息量大等优点而格外引人注目。该方法将样品故人裂解器内，在一定的条件下将样品加热使其瞬间裂解，生成可挥发性的小分子物质，立即被载气带人气相色谱系统的分析柱上，分离后得到具有指纹性质的裂解气
15、相色谱图。如果将气相色谱与质谱、傅立叶变换红外光谱联用，则不但可以知道不同中药中挥发性成分的差别，而且可以对这些成分进行鉴定。应用：应用：气相色谱适用于药物中挥发性成分的分析，实际应用中常与质谱联用。凌大奎等用规范化的色谱分离油成分的GC的保留指数(GCRI)，利用GC-MS和GC-傅利叶变换红外光谱(FTIR)对各主要成分进行了定性鉴别。钱浩泉等用GC-MS联用的方法，对高良姜及其近缘植物进行鉴别，发现它们的指纹特征明显不同，各自特有的色谱图谱具有特征代表性。 高效液相色谱高效液相色谱( (HPLC)HPLC)特点：特点：具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、方法重现性好、选择性高、适用的样
16、品类型广泛等特点。与薄层色谱相比，它是封闭系统色谱，受外界影响小，色谱稳定性、重现性好，其分离、鉴别能力远远高于薄层色谱。HPLC所分析的中药中，有相当部分为次生代谢产物，而这些产物的组成和含量不仅和药材本身的种属有关，同时还与植物后天所处的地域环境、生长条件、采摘时间和炮制方法有很大的关系。对于中成药来说，与产品的加工过程也有很大的联系。不同的加工过程与方法都将对所得的指纹图谱有相当影响，表现在峰高、峰面积、保留时间以及峰数量上的变化等。因此，HPLC不仅可以用来对生药的真伪、优劣进行鉴定，同时还可以对中药的加工过程进行监测，可以有效地分析鉴定经过不同的炮制、加工的中成药。 应用：应用：已经
17、普遍应用于中药材及制剂的分析检测，特别是三维高效液相色谱法近年来发展很快，非常适合构建中药指纹图谱。在中药指纹图谱中首推高效液相色谱指纹图谱。粟晓黎等运用HPLC指纹图谱法对中药鬼臼的毒性成分进行分析，指出利用鬼臼的HPLC指纹图谱可以鉴别鬼臼(桃儿七)、龙胆、威灵仙。高增平等以人参皂苷，为对照，建立了三七药材的HPLC的指纹图谱。翟为民等建立了人参、西洋参及三七的HPLC指纹图谱用以鉴别区分三者。 高速逆流色谱指纹图谱高速逆流色谱指纹图谱( (HSCCCHSCCC) )特点：特点：HSCCC利用动态液-液分配原理分离样品，其分离度和重现性与HPLC类似，但样品前处理简单。具体地说它是一种基于
18、液-液多级逆流萃取建立的色谱体系，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作分离柱，在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、分离过程；无固相载体，避免了待分离样品与固相载体表面发生化学反应而变成不可逆吸附；分辨率高，可分离纯品；可采用正向或反向的连续洗脱、步级洗脱、梯度洗脱等方式；可采用多种多样的溶剂系统实现物质的对流分配；能在一个流程中分离复杂样品中极性差异极大的各个组分，特别是能有效地分离强极性的组分；仪器及试剂成本明显低于高效液相色谱，应用：应用：适用于制备高纯度、高附加值的化合物。沈平孃研究了HSCCC在中草药分离、分析方面的应用。超临界流体色谱法超临界流体色谱法( (SFC)SFC)特点：特点：以超
19、临界流体作流动相，它通过控制压力调节流动相的密度实现对溶解度的调节，从而使不同物质分别进行溶解与分离。超临界流体溶解能力强，流动性好，传质速率快，融合了HPLC和GC的优点而部分地避免了它们的缺点。SFC比GC应用范围更广，比HPLC定量效果更好，分离的时间更短，样品的前处理更简单，更易与大型分析仪如质谱仪、傅里叶变换红外光谱仪和核磁共振谱仪等联用。应用：应用：SFC适用范围很广，理论上，能够用HPLC分离和测定的化合物，都可以用SFC来分离和测定，某些用HPLC不能分离的物质用SFC也能得到较好的效果。高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术( (HPCE)HPCE)特点：特点：是近10多年来发
20、展很快的一种高效分离分析技术，以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现分离。具有灵敏度高、柱效高、分析速度快、所需样品量少、溶剂消耗少和抗污染能力强等优点。应用：应用：不仅适用于小分子酸碱、盐及中性分子和生物大分子如核酸、多肽、蛋白质等的分析，在中药有效成分分析方面也显示出一定优势。中国药典2000年版已将其定为法定定性定量方法。孙毓庆等以毛细管电泳指纹图谱研究了冬虫夏草与蛹虫草、人工蛹虫革、伪品及次品的区别。 紫外光谱紫外光谱( (UV)UV)和红外光谱和红外光谱( (IR)IR) UVUV特征的差异，在定程度上反映了中药化学成分的差异。某些情况下，伪
21、品虽可在外观上以假乱真，但其化学成分的组成和含量与正品必有差异，这种差异在紫外光谱上必有所反映。如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。IRIR一直是药品鉴定的权威方法，但这是对纯物质而言的。中药提取液是复杂的混合物体系，这一混合物的红外光谱在本质上与纯化合物的红外光谱不同，它是混合物中各组分红外光谱的叠加。中药各种化学成分只要质和量相对稳定，并且样品的处理方法按统一要求进行，则其红外光谱应是相对稳定的。这样得到的混合物红外光谱应该具有一定的客观性和可重复性。据此原理，不必将混合物红外光谱各主要吸收峰进行归属，只要在4000-400cm-1范围内比较光谱的差异即可。
22、 应该指出，紫外和红外光谱都具有加和性，对于混合物来说，其鉴别专属性差，分辨率低。需借助计算机模式识别技术或模糊数学方法进行处理。核磁共振波谱核磁共振波谱( (NMR)NMR)特点：特点：植物中药特征性化学成分往往不限一种，多表现为特征性成分组。因此，其特征性标准提取物的NMR谱是其中各种成分图谱的叠加。在混合物的NMR图谱上，除每个信号在磁场中的共振数据外，信号的相对强弱反映了混合物中各组分的相对含量。当图谱不太复杂时，也可观察到某些信号的偶合关系。通过对各化合物进行结构鉴定和NMR研究，可实现植物中药NMR指纹图谱的解析。应用应用：它是鉴定有机化合物结构的常规方法和重要手段。根据核磁共振谱
23、图上吸收峰的位置和强度，可获得化合物的各类质子的化学位移、数量、偶合关系等结构信息。1HNMR图谱具有良好的重现性和特征性，适用于中药的品种鉴别和中药特征总提取物的鉴定。秦海林等对人参、天麻、黄连、虎杖、何首乌等的特征总提取物的1HNMR指纹图谱进行了研究，结果表明，所研究的各种植物的1HNMR指纹图谱具有高度的特征性和很好的重现性，同一品种不同产地的样品的1HNMR指纹图谱也有很好的一致性。 多维多息特征谱即联用技术多维多息特征谱即联用技术特点：特点：将色谱法良好的分离能力与波谱法特有的结构鉴别能力相结合。所谓多维是指采用多种分析仪器联用的模式，所谓多息是指中药的特征谱应包括化学和药效两方面
24、的信息。单一的分析方法难以反映中药的复杂性，近年来采用多种现代分析仪器联用方式得到的多维多息特征谱的应用在增加，已成为非常有效的分离、鉴定手段。例如：GC/MS、LC/MS、HPLC/MS、HPLC/NMR、CE/MS等联用技术为中药指纹图谱的研究应用提供大量的信息。应用：应用：目前最常用的是高效液相色谱(或毛细管电泳)二极管阵列检测器质谱质谱联用方式(HPLC或CE/DAD/MS/MS)得到的指纹图谱。如利用液质技术对样品进行指纹图谱的确定，应用质谱中质荷比(M/Z)值及HPLC图峰响应比值比较两者差异；利用LC-MS联用技术对样品组分进行多维多息化学特征谱的指认，通过质谱中质荷比(M/Z)
25、值及HPLC中的峰保留时间的相互对照，主要成分进行归属。 3.3.中药指纹图谱研究内容中药指纹图谱研究内容 针对中药材(炮制品、饮片)以及各类中药复方制剂，研究不同的样品制备方法及有效组分的分离方法。运用包括色谱、光谱以及多维、联用分析技术，全面开展指纹图谱测试，建立具有普适意义的、规范化的中药指纹图谱。 主要包括以下内容: 1)1)中药有效组分提取及分离方法研究及其规范化。中药有效组分提取及分离方法研究及其规范化。 2) 2)色谱分离分析条件优化技术研究。色谱分离分析条件优化技术研究。 3) 3)多维、联用分析新技术方法学研究。多维、联用分析新技术方法学研究。 4) 4)指纹图谱中活性成分分
26、析与鉴定。指纹图谱中活性成分分析与鉴定。 5) 5)中药指纹图谱分析方法规范化研究。中药指纹图谱分析方法规范化研究。 3.13.1指纹图谱鉴别方法指纹图谱鉴别方法 指纹图谱鉴别方法研究主要包括指纹图谱鉴别方法研究主要包括: : 中药指纹图谱化学特征信息的提取方法研究。 同一分析方法不同检测方式及不同分析方法获得的多源检测数据间的相关性。 指纹图谱相似度计算方法。 中药指纹图谱的快速处理方法。 建立中药指纹图谱鉴别计算方法体系。中药指纹图谱质量控制主要包括中药指纹图谱质量控制主要包括: 1)中药指纹图谱在中药材的真伪鉴别及质量评价中的应用。 2)中药指纹图谱在中药制剂生产工艺全过程的质量控制和最
27、终产品的质量评价，提出采用中药指纹图谱来实现从药材、半成品到最终产品的全过程质量控制方法。 3)中药指纹图谱在中药新药创制中的应用研究。3.33.3研研究指究指纹图谱纹图谱的一般流程的一般流程步骤步骤1：供试品收集，获取中药或中药材(供试品)并编号，标明产地、来源等等(收集不少于10批)。步骤步骤2：鉴定，即委托有关部门对其进行鉴定(如:基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定，得到鉴定结果(如：真伪，优劣等)。步骤步骤3：通过实验手段获取各中药或中药材的色谱指纹图谱。步骤步骤4：色谱峰指认，即人为标定出该中药或中药材的一组共有指纹峰，并在实验所得的每张色谱指纹图谱中将它们找出来。步骤步骤5：以
28、共有指纹峰为指标进行聚类分析，得到聚类分析结果，并与鉴定结果进行比较，比较结果应当相互符合，如果不符合就要从步骤1-5中找出不符合的原并因加以修正。步骤步骤6 ：从鉴定和聚类分析都认为品质比较好的中药或中药材中选取一部分 (一般为十个或十个以上)，以他们的色谱图为依据建立对照色谱指纹图谱。步骤步骤7 ：以对照色谱指纹图谱为标准图谱，检验所有供试品，并与鉴定结果进行比较，比较结果应当相互符合，如果不符合就要从步骤1-7中找出不符合的原因并加以修正。步骤步骤8 ：将对照色谱指纹图谱发放到厂家或相关部门试用。步骤步骤9 ：国家有关部门对色谱指纹图谱的校验和复核。步骤步骤10 ：指纹图谱质量标准的书写
29、。3.4 3.4 现现行中行中药药色色谱谱指指纹图谱研纹图谱研究工作的一般流程：究工作的一般流程：3.5 3.5 研究指纹图谱的关键技术研究指纹图谱的关键技术p 研究对象的确定研究对象的确定 植物药或中药的成分可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄酮类皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、挥发油等。 当研究某个注射剂品种的指纹图谱时，首先必须调研相关的文献、新药申报资料（质量部分和工艺部分）及其它研究结果， 尽可能详尽地了解药材、中间体及成品中所含水量成分的种类及其理化性质，经综合分析后找出成品中的药效成妥或有效成分，作为成品或中间体指纹图谱的研究对象，即分析检
30、测目标。p 研究方法的选择研究方法的选择 主要采用色谱法。各种色谱法是互补的，应根据研究对象的实际需要和可能以及按照不同色谱的 特点和优势而定，目的是保证方法的重现性和确能反映产品质量的主要化学成分。 一个中药制剂指纹图谱应可以同时采用两种或更多种方法进行研究。 指纹图谱研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择，大多数方法可采用HPLC法。通常挥发油类采用GC。一些难以检测或采用上述方法得不到较理想的分离效果时，可采用TLC或CE。p 研究内容研究内容 根据国家药品监督管理局下发的中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）的规定，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂的指纹图谱，涉及样品名称、来
31、源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等研究项。4.中药色谱指纹图谱的建立与评价中药色谱指纹图谱的建立与评价 按技术要求分析/抽检成品，并与对照色谱指纹图谱及技术参数比较，判别检测产品是否合格，是实施中药指纹图谱的最终目的。 实现中药指纹国库券谱技术革新，除了研究中药色谱指纹图谱，还包括对照指纹图谱及其技术参数的建立与指纹图谱评价等过程。4. 1 4. 1 对照指纹图谱的建立与指纹图谱评价对照指纹图谱的建立与指纹图谱评价 目前对中药材、中间体及成品（主要为注射剂）的指纹图谱研究大多采用图谱法，经分析检测得到了大量的色谱数据。按中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行），需对以上色谱数据进行处理，
32、才能得到指纹图谱技术参数。 如：相对保留时间、峰面积比值、相对标准偏差等。 目前多采用人工手动计算的方法或借助于Microsoft Excell等应用软件计算这些参数，繁琐，易出差错，计算操作的过程了也不规范。现在已对计算公式及计算过程要求规范。有关技术参数的计算公式有关技术参数的计算公式（1）相对保留时间RTR TR（i） TR（S）TR（i）各色谱峰的保留时间TR（s）参考峰的保留时间（2）积分相对比值RA A（i） RA= A（s）A（i）为各色谱峰积分面积； A（s）为参考峰积分面积。（3）相对标准偏差）相对标准偏差RSD% （ Xi X ）2 n - 1RSD%= XXi为样品相应参
33、数；X为均值；n为样品数量（个）。4.2 4.2 中药色谱对照指纹图谱的建立与中药色谱中药色谱对照指纹图谱的建立与中药色谱指纹图谱评价的原则指纹图谱评价的原则中药指纹图谱及技术参数一旦建立，就可以作为“标准”或“对照”/“参照”，所起作用如同对照药材，样品的色谱图谱可与对照指纹图谱进行比较。在对照指纹图谱建立及与中药指纹图谱评价过程中须综合考虑以下原则。整体性整体性 对照指纹图谱的建与评价应注意指纹特征的整体性。 一个品种的对照指纹图谱是由各个具有指纹意义的峰组成的完整图谱构成的，各个有指纹意义的峰（或薄层色谱的斑点）其位置（保留时间或比移值）、大小或高你（积分面积或峰高）、各峰之间相对的比例
34、是指纹图谱的综合参数，建立和评价时从整体的角度综合考虑，注意各有指纹意义的峰相互的依存关系。 中药色谱指纹图谱在一定程度上与临床疗效的稳定性及用药安全性方面有相关性，因此对照指纹图谱中所有色谱峰在样品指纹图谱中均应体现且可追溯。只有在对照指纹图谱中所有色谱峰的稳定体现，才是保证产品真正稳定可控的前提。为保证色谱指纹图谱在整体上相似，在建立对照指纹图谱时： 应尽可能包含所有具有指纹意义的特征峰，尤其是含量少面指纹意义显著的色谱峰、指纹特征区、共有特征区； 排除溶剂峰及其他可以追溯的杂质峰，供试品的制备应与工业生产相似，并尽可能采用流动相来溶解。 通过比较指纹图谱在整体上的相似，楞以判断出样品的真
35、实性. 模糊性模糊性 在实际过程中由于受到各种因素的影响，样品指纹图谱中有可能出现个别色谱峰的增加/减少，色谱峰图谱行为可能发生改变，如峰形、峰宽、峰高发生变化及保留时间发生偏移等，不可机械性地通过色谱图的叠加来评价反指纹色谱图和相似。 增加/减少的色谱峰对指纹图谱整体相似的贡献，不是单纯性的降低，有可能出现相互消长的现象。对于难以把握的色谱峰，建议由软件去进行判别评价，尽可能避免人为判别评价。4.34.3指纹图谱评价方法指纹图谱评价方法指纹图谱相似性的评价从两个方面考虑： （1） 色谱的整体“面貌”，即有指纹意义的峰的数目、峰的位置和顺序、各峰之间的大致比例（薄层色谱还有斑点的颜色）等是否相
36、似，以判断样品的真实性。 （2） 以样品与对照样品或“标准图谱”之间或不同批次样品指纹图谱之间总积分值作量化比较。如总积分面积相差较大（如+20%），则说明同样量的样品含有的内在物质上有明显差异，这种差异是否允许，应视具体品种、具体工艺的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。 能比较应在同一台仪器平行进行测定，评价的结果可能陈致误判或不同评价者得到不同的评价结果，建议通过计算机辅助指纹图谱相似度评价软件来进行。 评价指标评价指标 采用相似度作为指纹图谱评价的指标。 引用变量引用变量 根据中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）之规定，与中药指纹图谱有关的技术参数如下：保留时间（RT）；峰高（h
37、eight）；峰面积（area）；峰面积比（A%）；相对保留时间（RRT）；积分面积相对比值（RA）。 相对保留时间（RRT）和积分面积相对比值（RA）是中药指纹图谱的两个核心参数，可作为指纹相似度评价的重要变量。 参照国外实验室的做法，现选择积分面积相对比值（RA）作为计算指纹图谱相似度的变量。参参考文献献1 中药指纹图谱研究综述.李强,李超,齐鲁药事. 2010 ,29 (3)2 中药指纹图谱的应用,吕春平,关铭.天津药学2004,4, 16(2)3 中药指纹图谱的分类和发展. 罗国安,王义明.中国新药杂志. 2002,11(1) 4 中药指纹图谱的建立方法和作用 .杨桂芳, 王鹏.时珍国
38、医国药,2004 ,15(1). 5 中药指纹图谱及其对中药发展的影响 .李克,王曙东,宋炳生.中草药, 2002，33(11) 6 中药质量标准与中药指纹图谱.郑恒,魏日胞,陈香美 .中国医院药学杂志.2003,23(2)7 中药指纹图谱学体系的构建.孙国祥,雒翠霞,任培培,时存义.中南药学,2007,5(1)8 多维检测在中药指纹图谱中的应用.冯启余 .江南大学 .20089 高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析.孙波,孙涛.时珍国医国药 ,2006,17(1) 10 中药的毛细管电泳指纹图谱研究 .孙毓庆,阮婧华,马欣.色谱,2003,21(4)11 药用植物挥发物指纹图谱研究.浙江大学.倪士风.200312 中药色谱指纹图谱辅助分析系统 .赵青。沈阳药科大学.2006 请老师批评指正！请老师批评指正！ 谢谢！谢谢！
