1、药品的微生物学检查药品的微生物学检查 pptppt课件课件一、目的要求一、目的要求 1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备 2、了解空气、皮肤细菌检查方法、了解空气、皮肤细菌检查方法 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容1.药品的微生物限度检查（一）药品的微生物限度检查（一） 1）口服药物的检查）口服药物的检查: 药品的预处理：药品的预处理： 大肠杆菌的检查：大肠杆菌的检查： 细菌总数的检查：细菌总数的检查： 2）外用药物的检查）外用药物的检查: 药品的预处理：药品的预处理： 绿脓杆菌的检查：
2、绿脓杆菌的检查： 金黄色葡萄球菌的检查：金黄色葡萄球菌的检查：2.空气、皮肤细菌检查方法空气、皮肤细菌检查方法(验证验证)3.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备：微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备： 高压蒸汽灭菌锅、消毒煮沸器、高压蒸汽灭菌锅、消毒煮沸器、G6玻璃滤菌器装置、洁净工作台、玻璃滤菌器装置、洁净工作台、 移动式移动式 紫外光灯、鼓风式干烤箱、紫外线杀菌标本。紫外光灯、鼓风式干烤箱、紫外线杀菌标本。实验一实验一 药品的微生物限度检查（一）药品的微生物限度检查（一） 实验室常用消毒灭菌设备实验室常用消毒灭菌设备 空气和皮肤细菌检查方法（综合实验空气和皮肤细菌检查方法（综合实验+基础实验
3、）基础实验） 通过实验了解药品微生物限定检查法的通过实验了解药品微生物限定检查法的意义、设计方法、细菌检查常用的基本技术意义、设计方法、细菌检查常用的基本技术和程序，结果分析方法。和程序，结果分析方法。药品的微生物限度检查药品的微生物限度检查实验目的实验目的药品的微生物限度检查药品的微生物限度检查实验程序实验程序 一、药品的预处理一、药品的预处理二、药品的增菌培养、结果分析二、药品的增菌培养、结果分析三、细菌分离鉴定、结果分析三、细菌分离鉴定、结果分析口服药口服药外用药外用药药品的微生物限度检查药品的微生物限度检查实验方法实验方法（一）（一） 1.药品的预处理药品的预处理2克药品加克药品加20
4、毫升生理盐水，毫升生理盐水，研磨制成悬液研磨制成悬液 2.细菌培养细菌培养外外用药用药口口服药服药药品混悬液药品混悬液10毫升加入毫升加入胆盐乳糖胆盐乳糖增菌液中增菌液中药品混悬液药品混悬液10毫升加入毫升加入胆盐乳糖胆盐乳糖增菌液中增菌液中药品混悬液药品混悬液10毫升加入毫升加入亚碲酸钠亚碲酸钠增菌液中增菌液中37,24小时小时37,24小时小时 将剩余将剩余口服药口服药以以10-1 10-2 10-3 10-4 进行稀释进行稀释( (以生理盐水稀释以生理盐水稀释) ) 3.细菌总数测定细菌总数测定从上述四个稀释管中各取从上述四个稀释管中各取1ml混入混入溶化的琼脂培养基溶化的琼脂培养基中，
5、中，混匀，冷却后置混匀，冷却后置37恒温培养箱培养恒温培养箱培养24小时小时 。取四个中试管取四个中试管各加各加9ml生理盐水生理盐水从剩余从剩余10ml悬液中悬液中取取1ml加入上述四个稀释管中加入上述四个稀释管中1ml1ml10-110-410-210-39ml生理盐水生理盐水一、目的要求一、目的要求: 1、了解细菌培养接种技术、了解细菌培养接种技术 2、掌握细菌基本形态、掌握细菌基本形态 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容1.药物的微生物限度检查（二）药物的微生物限度检查（二）2.空气、皮肤细菌检查结果测定。空气、皮肤细菌检查结
6、果测定。3.讲授基础培养基的制备方法讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。（营养琼脂、营养肉汤）。4.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能基本技能)液体培养基液体培养基 平板培养基平板培养基斜面培养基斜面培养基 双糖含铁半固体斜面培养基双糖含铁半固体斜面培养基5.显微镜下观察显微镜下观察 细菌的基本形态细菌的基本形态: 球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。 特殊结构：特殊结构： 肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。6.培养基的种类和用途培养基的种类和用途 普通培养基、营养培养基、厌氧培养
7、基、选择培养基普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基实验二实验二 药品的微生物限度检查（二）药品的微生物限度检查（二） 细菌的形态学检查及培养接种技术细菌的形态学检查及培养接种技术一、一、空气、皮肤细菌培养现象观察空气、皮肤细菌培养现象观察 （一）记录空气微生物培养结果（一）记录空气微生物培养结果 菌落数目、大小、边缘、颜色、粗糙（光滑）菌落数目、大小、边缘、颜色、粗糙（光滑）（二）记录皮肤微生物培养结果（二）记录皮肤微生物培养结果比较消毒前后细菌菌落数，菌落特点。比较消毒前后细菌菌落数，菌落特点。培养基的制备培养基的制备培养基分类培养基分类根据物理性状分类：根据物理性状分类： 液体培
8、养基液体培养基 主要用于增菌主要用于增菌 半固体培养基半固体培养基 用于检测动力及保存菌种用于检测动力及保存菌种 固体培养基固体培养基 用于分离鉴定细菌用于分离鉴定细菌根据用途分类：根据用途分类： 基础培养基基础培养基 普通琼脂培养基普通琼脂培养基 营养培养基营养培养基 血液琼脂培养基血液琼脂培养基 选择培养基选择培养基 SSSS培养基培养基 鉴别培养基鉴别培养基双糖铁培养基双糖铁培养基 厌氧培养基厌氧培养基 庖肉培养基庖肉培养基培养基的制备程序培养基的制备程序调配调配矫正矫正pH（7.0-7.6）分装分装 灭菌（灭菌（121.3，20-30分钟）分钟）放入冰箱冷藏备用。放入冰箱冷藏备用。 因
9、高压之后因高压之后pH值会下降值会下降0.1左右，所以矫正左右，所以矫正pH时应比时应比所需的所需的pH高。高。 鉴定是否有菌可将培养基置于鉴定是否有菌可将培养基置于37 培养培养24小时，然小时，然后观察。后观察。二、细菌的接种技术二、细菌的接种技术材材 料料 普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体斜面培养基普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体斜面培养基大肠埃希菌培养物（套台）大肠埃希菌培养物（套台）方方 法法1.平板划线接种法平板划线接种法（1）平行划线法）平行划线法（2）分区划线法）分区划线法2.琼脂斜面的接种方法琼脂斜面的接种方法3.液体培养基接种法液体培养基接种法4.半固体接种法半固体接种法分
10、区划线法菌落斜面移种技术菌苔液体移种技术穿刺技术穿刺技术 取出前次实验培养物观察：取出前次实验培养物观察： 1.1.口服药物口服药物1)1)细菌鉴定：细菌鉴定： 在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长：在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长： 增菌液变混浊增菌液变混浊有有 -接种在接种在伊红美兰伊红美兰琼脂平板培养基琼脂平板培养基 上面。上面。 方法：分区划线接种。方法：分区划线接种。 2)2)细菌总数测定：细菌总数测定： 选择选择30-30030-300个菌落平板，个菌落平板， 细菌总数菌落数细菌总数菌落数稀释倍数稀释倍数药物的微生物限度检查方法（二）2.2.外用药外用药1)1)判定判定胆盐乳糖增菌液培养物
11、胆盐乳糖增菌液培养物及及亚碲酸钠增菌液培亚碲酸钠增菌液培养物养物有无细菌生长：有无细菌生长： 增菌液变混浊增菌液变混浊有有2)2)细菌鉴定：细菌鉴定：（1 1）将）将胆盐乳糖增菌液培养物胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在无菌接种在1616烷三甲烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基基溴化胺琼脂斜面培养基上面。上面。 方法：斜面化线接种；方法：斜面化线接种；（2 2）将）将亚碲酸钠增菌液培养物亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在，无菌接种在卵黄高卵黄高盐琼脂平板培养基盐琼脂平板培养基上面。上面。 方法：分区划线接种。方法：分区划线接种。 3737恒温孵育箱恒温孵育箱2424小时培养后，观察结果。小时培养后，观察结
12、果。细菌基本形态细菌基本形态球菌球菌杆菌杆菌螺形菌螺形菌葡萄球菌葡萄球菌链球菌链球菌大肠埃希菌枯草杆菌霍乱弧菌细菌特殊结构细菌特殊结构鞭毛荚膜芽孢破伤风梭菌一、目的要求一、目的要求: 1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容1.药物的微生物限度检查（三）药物的微生物限度检查（三）2.细菌的生长现象及代谢产物的观察细菌的生长现象及代谢产物的观察 1）液体培养基）液体培养基-沉淀、浑浊、表面生长现象。沉淀、浑浊、表面生长现象。 2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特
13、征、溶血环观察。）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。 3）双糖含铁培养基）双糖含铁培养基- 动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。 4）结核杆菌菌落的观察。）结核杆菌菌落的观察。3.中草药、抗生素抑菌试验中草药、抗生素抑菌试验 1）中草药）中草药-大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。 2）抗生素）抗生素-青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。实验三实验三 药品的微生物限度检查（三） 微生物的形态学检查及药物的敏感性试验 1）从）从伊红美兰伊红美兰琼脂平板培养基上琼脂平板培养基上- 挑取挑取黑
14、色带有金属光泽黑色带有金属光泽的的湿润湿润菌落，接种在菌落，接种在普通琼脂斜普通琼脂斜面面培养基上面，进行细菌的培养基上面，进行细菌的纯培养纯培养。 2）观察）观察外用药物外用药物在在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生培养基上生长状况。长状况。 记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。度等。 革兰氏染色镜下观察其菌落形态。革兰氏染色镜下观察其菌落形态。 根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该被检菌的名称。被检菌的名称。 3）从）从卵黄高盐卵黄高
15、盐琼脂平板培养基上生长，挑取琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润黄色的湿润菌落，菌落，接种在接种在普通琼脂斜面普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的培养基上面，进行细菌的纯培养纯培养。药物的微生物限度检查（三）药物的微生物限度检查（三）2.细菌的生长现象及代谢产物的观察细菌的生长现象及代谢产物的观察混浊生长混浊生长菌膜菌沉淀均匀浑浊对照菌膜生长菌膜生长3.中草药、抗生素抑菌试验中草药、抗生素抑菌试验 纸片法六、革兰染色法六、革兰染色法 原理：革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁差异原理：革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁差异 应用应用 方法方法 标本片制备标本片制备 革兰染色革兰染色 结果结果 2.革兰染色革兰
16、染色（1）初染：滴加结晶紫染液）初染：滴加结晶紫染液l2滴，滴，1分钟分钟.水洗水洗（2）媒染：滴加碘液，）媒染：滴加碘液， l2滴，作用滴，作用1分钟后水洗。分钟后水洗。 （3）脱色：滴加）脱色：滴加95酒精数滴，（约酒精数滴，（约1530秒），立即水秒），立即水洗。洗。 （4）复染：滴加稀释复红染液）复染：滴加稀释复红染液12滴，作用滴，作用1分钟后水洗。分钟后水洗。 （5）结果：牙垢标本中革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌）结果：牙垢标本中革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。其中真菌染成红色。其中真菌(白色念珠菌白色念珠菌)染成紫色，而螺旋体等染成紫色，而螺旋体等被染成红色。口腔中脱落的
17、组织细胞及个别白细胞被染成被染成红色。口腔中脱落的组织细胞及个别白细胞被染成红色。其细胞质呈红色，细胞核呈深红色。红色。其细胞质呈红色，细胞核呈深红色。 实验四实验四 药物的微生物限度检查（四）药物的微生物限度检查（四） 病毒和细菌及其他病原微生物病毒和细菌及其他病原微生物一、目的要求一、目的要求 1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容二、实验内容 1、药物的药物的微生物限度检查（四）、药物的药物的微生物限度检查（四） 1）将）将口服药物口服药物中的细菌分别接
18、种：蛋白胨水培养基；中的细菌分别接种：蛋白胨水培养基； 葡萄糖蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基； 枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。 同时接种同时接种产气杆菌产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。试验。 2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物外用药物中细菌进行中细菌进行血浆凝固酶血浆凝固酶检测检测,依依 据据 其反应结果其反应结果,确定该菌的性质及名称。确定该菌的性质及名称。2 、抗酸染色、抗酸染色3 、真菌培养物的观察、真菌培养物的观察-黑曲霉、木霉黑曲霉、木霉 、青霉菌菌落，白色念珠菌假
19、菌丝，、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝， 酵母菌菌落的观察。酵母菌菌落的观察。4 、记录中草药、抗生素抑菌试验结果、记录中草药、抗生素抑菌试验结果 5 、观察鸡胚的结构、观察鸡胚的结构-试验试验培养基培养基加试剂加试剂试验结果试验结果大肠埃希菌大肠埃希菌产气杆菌产气杆菌蛋白胨水蛋白胨水2管管11葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水水2管管11葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水水2管管11枸橼酸盐枸橼酸盐2管管11实验四实验四 药物的微生物限度检查（四）药物的微生物限度检查（四） 病毒和细菌及其他病原微生物病毒和细菌及其他病原微生物 取接种在普通琼脂斜面培养基上面的取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物外用药物中
20、细菌进行中细菌进行血浆凝固酶血浆凝固酶检测检测,依依 据据 其反应结果其反应结果,确定该菌的性质及名称。确定该菌的性质及名称。二.血浆凝固酶试验 原理：原理：非致病性葡萄球菌不产生血浆凝固酶而致非致病性葡萄球菌不产生血浆凝固酶而致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使含有枸橼病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的兔或人等血浆发生凝固。酸钠或肝素抗凝剂的兔或人等血浆发生凝固。 方法：方法：1.取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中一个滴加取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中一个滴加生理盐水另一个滴加兔血浆。生理盐水另一个滴加兔血浆。2.接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，接种环
21、烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理盐水中研匀在生理盐水中研匀混悬，另混悬，另1/2在兔血浆中研匀混悬，静止片刻，观察结在兔血浆中研匀混悬，静止片刻，观察结果。果。 结果：结果： 凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（+），）， 呈均匀混浊状不凝集判定为（呈均匀混浊状不凝集判定为（-） 方法：方法：1.取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中一个滴加生理盐水另一个滴加兔血浆。一个滴加生理盐水另一个滴加兔血浆。2.接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理盐在生理盐水中研匀混悬，另水中研匀混悬，另
22、1/2在兔血浆中研匀混悬，静在兔血浆中研匀混悬，静止片刻，观察结果。止片刻，观察结果。 结果结果： 凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（+），）， 呈均匀混浊状不凝集判定为（呈均匀混浊状不凝集判定为（-）制片（涂片、干燥、固定）；制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸复红初染石炭酸复红初染（加温、加温、 盖滤纸片） 5min - -水洗；水洗；3盐酸酒精脱色盐酸酒精脱色 （ 15S,15S,水洗）；水洗）；美兰复染（美兰复染（1min，水洗 ）- -滤纸吸干滤纸吸干镜检。镜检。抗酸染色步骤抗酸染色步骤结核杆菌抗生素体外抑菌试验（二） 记录纸片法结果记录纸片法结果测量抑
23、菌环直径测量抑菌环直径 病毒的分离培养鸡胚接种 动物接种 鸡胚培养 组织细胞培养病毒的培养方法：病毒的培养方法：病毒的分离培养鸡胚接种病毒名称病毒名称接种部位接种部位鸡胚胚龄（天）鸡胚胚龄（天）痘类病毒痘类病毒绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜10101313流感、副流感、腮腺流感、副流感、腮腺炎病毒炎病毒尿囊尿囊9 9 1111嗜神经病毒嗜神经病毒卵黄囊卵黄囊5 58 8初次分离标本初次分离标本羊膜腔羊膜腔10101212病毒的分离培养鸡胚培养实验五实验五 药物的微生物限度检查（五）药物的微生物限度检查（五）一、目的要求一、目的要求掌握药品的微生物学检验程序和方法掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内
24、容二、实验内容以生化反应（以生化反应（IMViC）检测口服药中细菌的性质。）检测口服药中细菌的性质。-试验试验培养基培养基加试剂加试剂试验结果试验结果大肠埃希菌大肠埃希菌产气杆菌产气杆菌吲哚吲哚(I)蛋白胨水蛋白胨水2管管苯甲醛试剂苯甲醛试剂0.5ml(5滴滴)红红阳性（阳性（+）无色变无色变阴性（阴性（-）甲基红甲基红(M)葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水水2管管甲基红甲基红5滴滴红色红色阳性（阳性（+）黄色黄色阴性（阴性（-）VP葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水水2管管培氏乙培氏乙6滴滴萘酚试剂萘酚试剂6滴滴无色变无色变阴性（阴性（-）红色红色阳性（阳性（+）枸椽酸盐枸椽酸盐(C )枸橼酸盐枸橼酸盐2
25、管管绿无色变绿无色变阴性（阴性（-）绿绿蓝色蓝色阳性（阳性（+）IMViC结果吸哚试验：取出后每管滴加柯氏试剂吸哚试验：取出后每管滴加柯氏试剂0.5ml，静止片刻，观察有无颜色，静止片刻，观察有无颜色改变。大肠埃希菌能够分解色氨酸产生吲哚，加入对二甲基氨基苯甲醛改变。大肠埃希菌能够分解色氨酸产生吲哚，加入对二甲基氨基苯甲醛后形成红色的玫瑰吲哚，则为阳性反应；产气杆菌不产生吲哚，添加试后形成红色的玫瑰吲哚，则为阳性反应；产气杆菌不产生吲哚，添加试剂后无颜色变化，为阴性反应。剂后无颜色变化，为阴性反应。甲基红试验：取出后各管内滴加甲基红试剂数滴。大肠埃希菌分解葡萄甲基红试验：取出后各管内滴加甲基红
26、试剂数滴。大肠埃希菌分解葡萄糖产酸较多，培养基的糖产酸较多，培养基的pH值在值在4.5以下，加入甲基红试剂后呈红色反应，以下，加入甲基红试剂后呈红色反应，为阳性结果。产气杆菌分解葡萄糖产生的是乙酰甲基甲醇，酸类较少，为阳性结果。产气杆菌分解葡萄糖产生的是乙酰甲基甲醇，酸类较少，培养基内培养基内pH值较高，加入甲基红试剂后呈黄色反应是为阴性。值较高，加入甲基红试剂后呈黄色反应是为阴性。V-P试验：葡萄糖蛋白胨水中滴加数滴培氏试剂。大肠埃希菌不产生试验：葡萄糖蛋白胨水中滴加数滴培氏试剂。大肠埃希菌不产生乙酰甲基甲醇，加入培氏试剂后无颜色反应，为乙酰甲基甲醇，加入培氏试剂后无颜色反应，为V-P试验阴
27、性试验阴性 ；产气杆；产气杆菌产生的乙酰甲基甲醇能氧化成二乙酰，并和培养基中的精氨酸的胍类菌产生的乙酰甲基甲醇能氧化成二乙酰，并和培养基中的精氨酸的胍类衍生物生成红色化合物。加入培氏试剂后促进反应呈红色为阳性。衍生物生成红色化合物。加入培氏试剂后促进反应呈红色为阳性。 枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验 ：枸橼酸盐琼脂斜面，：枸橼酸盐琼脂斜面， 大肠埃希菌不能利用枸橼大肠埃希菌不能利用枸橼酸盐作碳源，故不生长，培养基仍为绿色。产气杆菌能够利用枸橼酸盐，酸盐作碳源，故不生长，培养基仍为绿色。产气杆菌能够利用枸橼酸盐，故生长良好，而使培养基变碱性。培养基中的指示剂溴麝香草酚蓝在故生长良好，而使培养基变碱性。培养基中的指示剂溴麝香草酚蓝在pH6.07.6时颜色由黄时颜色由黄绿绿蓝蓝)由黄变蓝，故为阳性。由黄变蓝，故为阳性。吲哚试验吲哚试验左：产气肠杆菌（左：产气肠杆菌（），右：大肠埃希菌（），右：大肠埃希菌（+）甲基红试验：甲基红试验：左：产气肠杆菌（左：产气肠杆菌（）；右：大肠埃希菌（）；右：大肠埃希菌（+）VP试验试验 左：大肠埃希菌（左：大肠埃希菌（）；右：产气肠杆菌（）；右：产气肠杆菌（+）菌 丝大分生孢子小分生孢子白念珠菌 新型隐球菌青霉烟曲霉黄曲霉曲霉
