1、第五章第五章蛋白质的通性、纯化和表征蛋白质的通性、纯化和表征n目的要求目的要求1、掌握蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。、掌握蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。2、熟悉蛋白质分离纯化的一般原则，掌握蛋白、熟悉蛋白质分离纯化的一般原则，掌握蛋白质分离纯化方法。质分离纯化方法。3、掌握蛋白质的含量测定与纯度鉴定。、掌握蛋白质的含量测定与纯度鉴定。n重点难点重点难点1、蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。、蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。2、蛋白质的分离纯化方法。、蛋白质的分离纯化方法。一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质1. 1. 蛋白质分子的可解离基团蛋白质分子的可解离基团 2. 2
2、. 等电点：等电点：使蛋白质分子所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零的溶液pH。（与AA相同）蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数目以及溶液的pH。 每种蛋白质都有特定的等电点，这是鉴别蛋白质的指标之一。每种蛋白质都有特定的等电点，这是鉴别蛋白质的指标之一。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系: :等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。3. 3.
3、等离子点等离子点蛋白质的等电点在有中性盐（蛋白质的等电点在有中性盐（Ca2+Ca2+，Mg2+Mg2+，Cl-Cl-，SO42-SO42-）存在下可）存在下可以发生明显的变化。以发生明显的变化。等离子点：等离子点：蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中，蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的体基团结合的质子数相等时的溶液的pHpH值。值。等离子点是一个特征常数等离子点是一个特征常数 二二 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质溶液中，蛋白质分子的直径介于蛋白质
4、溶液中，蛋白质分子的直径介于1100nm，该分散系统为胶体溶液系统。，该分散系统为胶体溶液系统。布郎布郎运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。胶体系统保持稳定的三个因素胶体系统保持稳定的三个因素 颗粒大小在颗粒大小在1 1100nm100nm范围内范围内颗粒表面带有同种净电荷颗粒表面带有同种净电荷与水形成水化层与水形成水化层（一）胶体性质 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出的蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀。现象称为蛋白质的沉淀。应用应用:(1)蛋白质分离纯
5、化蛋白质分离纯化(2)解毒解毒(3)临床检验临床检验（二）蛋白质的沉淀（二）蛋白质的沉淀 n 引起蛋白质沉淀的原因1、加入脱水剂以除去它的水化层。、加入脱水剂以除去它的水化层。2、改变溶液的、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失达到蛋白质的等电点使质点失去携带相同净电荷。去携带相同净电荷。3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大的质点而沉淀。集成大的质点而沉淀。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化层水化层+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的
6、蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用 蛋白质的聚沉蛋白质的聚沉蛋蛋白白质质胶胶体体溶溶液液沉沉淀淀作作用用示示意意图图(1) 盐析法盐析法( salting out)向蛋白质溶液中加入大量中性盐向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。使蛋白质沉淀称为盐析。常用的中性盐：常用的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。硫酸铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钠、 氯化钠等氯化钠等使蛋白质沉淀的方法使蛋白质沉淀的方法特点：特点：作用原理作用原理:盐离子与水的亲和力极强，可脱去蛋白盐离子与水的亲和
7、力极强，可脱去蛋白分子表面的水化层；盐离子中和蛋白分分子表面的水化层；盐离子中和蛋白分子表面的电荷，最终蛋白质聚集沉淀。子表面的电荷，最终蛋白质聚集沉淀。(2) 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层，又能降低溶液的介电常使蛋白质脱去水化层，又能降低溶液的介电常数，增强异性电荷间的相互作用而使蛋白质分数，增强异性电荷间的相互作用而使蛋白质分子聚集沉淀。子聚集沉淀。 必须在低温下操作必须在低温下操作注意事项注意事项:尽量缩短处理的时间尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇甲醇、乙醇、乙醇、丙酮丙酮缺点：缺点： 原理原理:常用有机溶剂常用有
8、机溶剂:常会使蛋白质变性常会使蛋白质变性重金属离子如重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀白盐而沉淀。(3) 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法常使蛋白质变性失活。常使蛋白质变性失活。若溶液若溶液pH大于蛋白质的大于蛋白质的pI，沉淀更易发生，沉淀更易发生缺点：缺点：原理原理:生物碱试剂生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等酸和硝酸等)与带正电
9、的蛋白质结合生成与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀。不溶性的盐而沉淀。(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法反应溶液的反应溶液的pHpI，确保蛋，确保蛋白质以阳离子形式存在白质以阳离子形式存在 缺点：缺点： 原理原理:常引起蛋白质变性常引起蛋白质变性注意事项注意事项:（5）加热变性）加热变性n几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固n当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速。n原理： 1、蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了蛋白质的水化层 2、破坏电荷情况n（一） 纯化的目标 n（二） 蛋白质分离纯化的一般原则 （一）目标（一）目标 n蛋白质在生物体中一般都是以复杂
10、的混合物形式存在，在实际工作中，要研究或应用某种蛋白质，必须将其分离提纯到一定的水平。n 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的均一的甚至是晶体的蛋白质样品；n 研究活性蛋白质的生物功能，不但需要把样品提纯到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要尽量避免因变性而失活；n 在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。1、总目标 n（1）增加制品的纯度（purity）或比活性（specific activity）即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性；n（2）并且使目标蛋白质的产量达到最高值。（二）一般原
11、则（二）一般原则 2、分离提纯的一般程序 含有目标蛋白质的动植物组织、细胞或微生物体 前处理 可溶性蛋白质混合物抽提液 粗分级分离已除去大量杂质的蛋白质浓缩液 细分级分离高纯度的蛋白质制品 电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、抽提、差速离心破碎、抽提、差速离心选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析四 蛋白质的分离纯化方法 分离提纯蛋白质的各种方法主要是利用分离提纯蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间的各种特异性的差异，包括：蛋白质之间的各种特异性的
12、差异，包括： （1）分子大小分子大小； （2）溶解度溶解度； （3）电荷不同电荷不同； （4）选择性吸附选择性吸附； （5）对配体分子的生物学亲和力等对配体分子的生物学亲和力等。 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1 透析透析(dialysis)和超滤和超滤(ultrafiltration)2 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration) 1 透析和超滤* 透析透析(dialysis)利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质大分子与其他小分子物质分开的方法。白质大分子与其他小分子物质分开的方法。* * 超滤法超滤法 应用正压或离心力，使水和其他小
13、分子通过半透应用正压或离心力，使水和其他小分子通过半透膜而蛋白质被截留在膜上，达到膜而蛋白质被截留在膜上，达到浓缩浓缩或或脱盐脱盐粗粗分级分级的目的。的目的。透析与超过滤简易装置透析与超过滤简易装置超滤装置（1）凝胶过滤的介质2 凝胶过滤凝胶的网孔大小决定分离范围n能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围nSephadex G-50 1 50030 000 有时用排阻极限来表示分离范围的上限,排阻极限指不能扩散进入凝胶网孔的最小相对分子量,如Sephadex G-50的极限为30 000 常用的凝胶常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名葡聚糖凝胶（商品名Sephadex）是由线型的是由线
14、型的-1,6-葡萄糖与葡萄糖与1-氯氯-2,3-环氧丙环氧丙烷反应而成烷反应而成,商品名为商品名为Sephadex 。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(商品名商品名Bio-GelP)是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共聚而成，商品名为聚而成，商品名为Bio-Gel P。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-gel A)是从琼脂中分离制得的，商品名为是从琼脂中分离制得的，商品名为Sepharose或或Bio-Gel ASephadexSepharosen以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰丙烯酰胺胺（单体）聚合而成（单
15、体）聚合而成(2)凝胶过滤的原理凝胶过滤的原理： 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 应用l凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。l分子大小彼此相差分子大小彼此相差25%25%的样品，只要通过的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。单一凝胶床就可以完全将它们
16、分开。l利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行的溶液进行脱盐、去热源和脱色脱盐、去热源和脱色。（二）根据溶解度差别纯化的方法 影响蛋白质溶解度的外界因素主要有：影响蛋白质溶解度的外界因素主要有：（1）溶液的）溶液的pH，（2）离子强度）离子强度I，（3）介电常数）介电常数，（4）温度）温度T。 根据蛋白质分子结构的特点，适当改变上述根据蛋白质分子结构的特点，适当改变上述外界因素，就可以选择性的控制蛋白质混合物外界因素，就可以选择性的控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，作为分离纯化蛋白质的中某一成分的溶解度，作为分离纯化蛋白质的一种手段。一种手段。利用蛋白
17、质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。1. 等电点沉淀和pH控制 2. 盐溶和盐析 n盐溶盐溶(salting in) 是指低浓度的中性盐可以增加蛋白质溶解度的现象。n盐析盐析(salting out) 是指当中性盐的离子强度增加
18、到足够高时，（如饱和或半饱和的程度），很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来的现象。 常用盐析盐类：常用盐析盐类： (NH4)2SO4 ，NaCl等等盐溶原理示意图n盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。分子与水分子之间的相互作用却加强。n盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极转变为盐离子的水化水，从而降
19、低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。质分子表面的水化层。盐析原理示意图应用盐析是一种最常用的分级分离的方法之一,利用好了一步即能去大量的杂蛋白。现在已有的很多蛋白水解酶或其酶原都已经利用盐析进行了沉淀并结晶,如:胰凝乳蛋白酶原,胰蛋白酶等。优点:保持蛋白质的天然构象,能再溶解鸡蛋清球蛋白沉淀滤液卵清蛋白晶体卵清蛋白晶体半饱和(NH4)2SO4卵清蛋白的分离卵清蛋白的分离全饱和(NH4)2SO43. 有机溶剂分级法 n与水互溶的有机溶剂（如乙醇和丙酮）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低， 原因之一是降低了介质的介电常数，蛋白质表
20、面的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集沉淀； 原因之二与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集沉淀。 有机溶剂分级分离原理示意图4 温度对溶解度的影响 n在低离子强度时，蛋白质的溶解度大多数在一定范围（约0-40）内是随着温度增加而增加的。n但在40-50以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性介质中就会失去溶解力。n大多数蛋白质在低温下比较稳定。因此，蛋白质的分级分离操作一般都要求在低温下进行。（三）根据电荷不同的分离方法（三）根据电荷不同的分离方法 1 . 电泳电泳 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不
21、同分子大小不同的的蛋白质所带蛋白质所带净电荷密度不同净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以，迁移率不同，在电泳时可以分开。分开。 F=FfqE=fV=v/E泳动度电泳的发展a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。行电泳。 b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的液的支持物支持物上进行电泳，不同组分形成上进行电泳，不同组分形成带状区域。带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。）纸电泳：用滤纸作支持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。、聚丙烯酰胺）作支持物。
22、 +-Protein DenaturedPartialDenatured滤纸电泳滤纸电泳 Cellulose薄层电泳 (TLE) Cellulose acetate胶体 Starch Gel 电泳形式的演进电泳形式的演进圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。+ -+ 纯化中应用最多的是纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳和和等电聚焦电泳等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。蛋白质。 （1
23、） PAGE：PAGE电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳凝胶板分为两部分：凝胶板分为两部分：浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶PAGE垂直平板电泳示意图垂直平板电泳示意图高效的分辨率高效的分辨率浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应PAGE的三种分离效应（2）等电点聚焦n蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质n当当pH=pIpH=pI时净电荷为零时净电荷为零，在电场中既，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点就是该蛋白质的等电点(pI)以以PAGPAG为电泳支持物，并在其中加入两性电为电泳支持物
24、，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成体在凝胶中移动，形成pHpH梯度，蛋白质在梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其凝胶中迁移至其pIpI的的pHpH处，即不再泳动而处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳焦电泳(isoelectric focusing-PAGE(isoelectric focusing-PAGE，IEF-PAGE)IEF-PAGE)原理: 等电聚焦的运作机制等电聚焦的运作机制：-+pH357911+-+-+-+-+-+Adapted from Albert
25、s et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.487+-（3）双向凝胶电泳）双向凝胶电泳 2.离子交换层析法离子交换层析法 不同载体： 离子交换纤维素 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖n亲和层析法亲和层析法(AC) Pr琼脂糖琼脂糖小珠小珠配体：配体：凝集素，凝集素，抗原，抗体抗原，抗体金属螯合剂金属螯合剂杂质杂质杂杂质质蛋白质蛋白质 配体配体 蛋白质配体复合物蛋白质配体复合物配体的选择配体的选择n可选择配体的种类：可选择配体的种类：n抑制剂抑制剂n效应物效应物n酶的辅助因子酶的辅助因子n类似底物类似底物n抗体抗体
26、n其它（外源凝集素，其它（外源凝集素，PolyAPolyA， PolyU PolyU 金属离子）金属离子）（六） HPLCn原理：，GF，吸附层析n技术上的改进颗粒力度小而均匀，机械性能强化学性能稳定高压柱，计算机辅助设备分辨率提高，效率提高n五、蛋白质相对分子量的测定n1.凝胶过滤法测定相对分子质量 Note：n蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于，而是。n用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形）n分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，在一定的范围内，
27、各个组分的洗脱液体积Ve与其分子量的对数成线性关系（反比）： Veb lg MWc优点：n设备简单，不要求复杂的仪器n对待测样品的纯度要求不高。待测样品可以是不纯的，只要具有专一的生物活性。n聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：具有三维网状具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的物的电泳电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳n普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（质比（净电荷净电荷、大小大小、形状形状）（二）（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） SDS 在在蛋白质蛋白质表面表面均匀
28、均匀附上附上一层负电一层负电： SD S原態蛋白質變性蛋白質成一線狀分子boi l i ng SDSSDS（十二烷基磺酸钠），它能够与蛋白质多肽（十二烷基磺酸钠），它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约链中的氨基酸残基按大约1 1 1.4 1.4比例结合。比例结合。 SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。是亚基的分子量。 nSDSSDSPAGEPAGE的依据：的依据：物质分子量的差异性n当SDS与蛋白质结合后：n1)SDS使蛋白质分子即带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质分子间的电荷差别n2）改变了蛋白质单体的构象，SDS-蛋白质复合体形
29、状趋向一致，所以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。 n方法：方法：用用SDS和和巯基乙醇巯基乙醇（打开二硫键）处理（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成结合，形成 SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带蛋白质分子均带 负电负电（SDS带负电），且带负电），且荷质比相同荷质比相同； 不同蛋白质分子具有不同蛋白质分子具有相似的构象相似的构象。 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们 的迁移率作图的迁移率作图 测出待测样品的迁移率测出待测样
30、品的迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量从标准曲线上查出样品的相对分子质量 六六 蛋白质的含量测定与纯度鉴定：蛋白质的含量测定与纯度鉴定：（一）（一）总总蛋白质含量测定：蛋白质含量测定： 凯氏定氮法：凯氏定氮法：测样品中测样品中N含量含量双缩脲法：双缩脲法：不十分精确，但较简便不十分精确，但较简便Folin-酚试剂酚试剂(Lowry法法)： 蛋白质标准测定方法：蛋白质标准测定方法：染料结合法（染料结合法（BradfordBradford法）法）灵敏度较高灵敏度较高, , g g水平水平 染料：考马斯亮蓝染料：考马斯亮蓝紫外吸收法：紫外吸收法： A A280280比色比色胶体金法胶体金法(
31、ng(ng水平水平) )（二）蛋白质的纯度鉴定（二）蛋白质的纯度鉴定 电泳：一条带电泳：一条带 层析层析(HPLC)：一个峰：一个峰 N-末端分析；一种末端分析；一种AAn一、单项选择题n1. 构成蛋白质的氨基酸属于下列哪种氨基酸？（ ）。 n A. L-氨基酸 B. L-氨基酸 C. D-氨基酸 D. D-氨基酸n 2. 280nm波长处有吸收峰的氨基酸为（ ）。 n A.精氨酸 B.色氨酸 C.丝氨酸 D.谷氨酸n 3. 有关蛋白质三级结构描述，错误的是（ ）。 n A.具有三级结构的多肽链都有生物学活性n B.三级结构是单体蛋白质或亚基的空间结构n C.三级结构的稳定性由次级键维持 n
32、D.亲水基团多位于三级结构的表面A. L-氨基酸B.色氨酸A.具有三级结构的多肽链都有生物学活性n4. 关于蛋白质四级结构的正确叙述是（ ）。n A.蛋白质四级结构的稳定性由二硫键维系n B.四级结构是蛋白质保持生物学活性的必要条件n C.蛋白质都有四级结构n D.蛋白质亚基间由非共价键聚合n。Dn二、多项选择题n1. 蛋白质结构域（ ）。n A.都有特定的功能 B.折叠得较为紧密的区域n C.属于三级结构 D.存在每一种蛋白质中n2. 空间构象包括（ ）。n A. -折叠 B.结构域 C.亚基 D.模序A B C A B C Dn三、名词解释n1. 蛋白质等电点 2. 蛋白质三级结构n3.
33、蛋白质变性 4. 模序n 蛋白质等电点：蛋白质净电荷等于零时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。n 蛋白质三级结构：蛋白质三级结构指整条多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。n 蛋白质变性：蛋白质在某些理化因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物学活性的丧失，称为蛋白质变性。n 模序：由二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间结构称为模序。一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊功能。n1. 根据氨基酸的理化性质可分为 ， ， 和 四类。n非极性疏水性氨基酸；极性中性氨基酸；酸性氨基酸；碱性氨基酸n2. 多肽链中氨基酸的 ，称为一级
34、结构，主要化学键为 。n3. 蛋白质变性主要是其 结构受到破坏，而其 结构仍可完好无损。n1. 为何蛋白质的含氮量能表示蛋白质的相对量？如何根据蛋白质的含氮量计算蛋白质的含量？n各种蛋白质的含氮量颇为接近，平均为16% ，因此测定蛋白质的含氮量就可推算出蛋白质的含量。常用的公式为n100克样品中蛋白质含量（克%） 每克样品中含氮克数 6.25100 。n2 称取25mg蛋白酶配成25mL溶液，取2mL溶液测得含蛋白氮0.2mg，另取0.1mL溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500g酪氨酸，假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1g酪氨酸的酶量，请计算：n（1）酶溶液的蛋白浓度及比活。（2）每克纯酶制剂的总蛋白含量及总活力。n 举例说明蛋白质一级结构、空间结构与功能之间的关系。n蛋白质一级结构是高级结构的基础。n1、n2、n3、有相似一级结构的蛋白质，其空间构象和功能也有相似之处。如镰刀形红细胞性贫血是因其Hb的-链上一个氨基酸发生改变所致（由正常的-6-Glu变为-6-Val）。n蛋白质的空间结构与功能密切相关，如Hb由T型（紧密型）变为R型（疏松型），Hb与氧的亲和力增大约200倍。n。
