1、线性评价及分析测量范围的确定09:37:251参考材料 NCCLS EP6-A2 ：Evaluation of Linearity of QuantitativeAnalytical Methods;Approved Guide-Second Edition 临床检验方法确认与性能验证P153 WS/T 408-2012 临床化学设备线性评价指南09:37:25209:37:25关于“确认” (Validation)方法学研究或方法产品性能研究由方法建立者或产品生产者完成给出主要方法性能：准确度(accuracy)精密度(precision)特异性(specificity)检测限和定量限(LO
2、D and LOQ, 灵敏度)线性(linearity)耐变性(robustness). .3-陈文祥09:37:25关于验证 (Verification)对主要方法性能的证实在引入新方法时进行对配套系统，一般验证下列指标：准确度(accuracy)精密度(precision)可报范围(reportable range)参考区间(reference interval)对非配套系统，验证更为广泛，除上述指标外：分析特异性分析灵敏度任何其他必要指标The U.S. CLIA4-陈文祥概念 线性范围（Linear Range)是指系统最终的输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度成正比的范围，此时的非线
3、性误差应低于允许误差。 分析测量范围（Analytical Measurement Range）方法直接测量标本，而不需要任何的稀释、浓缩或者其它预处理等过程下，测量结果总误差符合要求的分析物浓度的范围。（CAP） 符合方法学性能，测量总误差满足方法规定的性能指标。 临床可报告范围（Clinically Reportable Range)是方法可采用对标本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测量下的分析物值的范围。 临床有用性 可报告范围（Reportable Range）：实验室可建立或验证仪器或检测系统测量相应的准确实验结果值的范围。（CLIA）09:37:255测量区间（Measu
4、ring Interval） 也称（分析）测量范围。 测量程序可给出测量结果（数值）、由测量低限和测量高限构成的闭区间； 在此区间内，测量总误差满足方法规定的性能指标。 规定条件下，满足特定的不确定要求时，某一测量仪器（系统）测量同样的量所给出的一系列数值。 相关性能获得确认的体外诊断设备的线性曾被称作“可报告范围”测量范围（measuing range）:当测量系统的误差处于规定的界限内（如CV=10%)时，被测量值分布的高、低界限值间的范围。09:37:25609:37:257思考 定量免疫（如化学发光，免疫比浊），校准曲线并非直线，能否进行线性评价？1.61.41.210.80.60.4
5、0.200123456线性评价-EP6 设备熟悉期：在控、校准、样本准备等； 注意生物安全防护； 样本（浓度水平）数量：验证：4-6个样本，覆盖线性范围，3-4次测定；建立（ Establishment）：9-11个样本，超出20-30%预期线性范围，3-4次测定。09:37:258 样本类型：混合病人样本、用适当稀释液稀释的临床样本、加入分析物的混合临床样本、商品质控物或校准物、水溶液等。避免干扰，尽量减少基质效应。高浓度样本可用说明书指定稀释液稀释成系列低浓度样本。 总体要求：为避免基质效应对结果的影响，进行线性评价时所选用的样品应与临床实验样品相似，但不应对测定方法有明确的干扰作用，避免
6、溶血、脂血、黄疸等。 评价的是理论值（实际浓度、相对浓度）与仪器给出的最终结果（而非仪器内部的响应值）之间的线性关系。09:37:25909:37:25可添加分析物1009:37:25使用高低混合血清制备系列样本采用足量的混合血清样本时，准备如下： X1: 低浓度混合血清，浓度接近或等于下限； X5: 高浓度混合血清，浓度等于或接近上限； X2: 3份X1 + 1份X5 X3: 2份X1 + 2份X5 X4: 1份X1 + 3份X511浓度计算 如果高/低浓度混合血清的值未知，可将每种混合血清编码。编码可代表每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样品，编码可用整数（如1、2、3、4与5）代表连续样
7、品。本实验方案不需预先知道样品浓度，在确定线性范围时可使用样品测定结果的均值。09:37:2512样品号1234567891011低浓度混合血清(ml)5.004.504.003.503.002.502.001.501.000.500.00高浓度混合血清(ml)0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.0009:37:2513如所制备的中间浓度样品不是等间隔，其浓度间隔间的关系应明确，在测定时可以这些间隔间的相对比值做为X值。实验程序 一般要求：实验人员必须熟练掌握仪器操作和维护程序、样本准备方法和校准。 全部实验和数据采集宜在同一试验批（run）内或
8、者相隔简短的实验批中完成（最后在一天内完成）。样本随机排列。有显著携带污染时，应用空白隔开样本。每个浓度样本重复测定3-4次。记录分析结果。09:37:2514样本浓度测定次数及结果X1Y1-1Y1-2Y1-3Y1-4X2Y2-1Y2-2Y2-3Y2-4X3Y3-1Y3-2Y3-3Y3-4X4Y4-1Y4-2Y4-3Y4-4X5Y5-1Y5-2Y5-3Y5-409:37:25实验记录表格15检查离群点Dixon 方法 将每个浓度4次按从大到小排列（Yi-1到Yi-4) 计算极差 D = Yi-1 Yi-4计算 D1= (Yi-1-Yi-2)/D计算 D4= (Yi-3-Yi-4)/DD1或D4
9、如果大于0.765（0.05)或0.889（0.01）则该点为离群点；09:37:2516xs =09:37:2517x =x1 x2 x33格拉布斯（Grubbs）法每组数据中有3个测定结果，分别记为 x1，x2，x3。1)将3个测定值按大小顺序排列,最大值记为 xmax,最小值记为xmin;2)由3个测定值计算均值x和标准差s:323i1i x09:37:2518样品测定次显著性水平数340.0501.1531.4630.0251.1551.4810.0101.1551.4920.0051.1551.4963)根据可疑值 xmax或 xmin分别按下式计算统计量t：t1 = xmaxxsx
10、 xmins5)如t值大于临界值，则相应的可疑值为离群值。Grubbs检验临界值表多项回归分析 将上述数据进行多项回归分析，得出一级、二级与三级多项式，此步可采用统计学软件（如SPSS,SAS）完成。阶数一级多项式 回归自由度（Rdf）Y = a + b1X 2二级三级Y = a + b1X + b2X2Y = a + b1X + b2X2 + b3X33409:37:2519回归方程的线性检验 t = bi/ SEi 如三级多项式L= 5，R = 2，Rdf = 4，df = 5*2-4 = 6。在t值表中寻找t界值（双边检验，=0.05），如非线性系数无显著性（p0.05），则数据组被认为
11、具线性，此时可对数据组进行精密度检验，精密度符合线性判断要求时，数据分析结束并得出结论为数据组具有统计学线性或一阶线性。如任一非线性系数具显著性（p9PPPPPP09:37:2528不精密度和ADL的临界值（PctBnd=5%，d=1或2阶）L 样本数R重复测量的次数最优拟合方程的回归标准误/c%LR=10LR=12LR=14LR=16LR=18LR=2015.55.55.45.45.45.426.16.05.95.95.85.836.76.56.46.36.26.247.27.06.96.86.76.657.87.67.47.27.17.068.48.17.97.77.57.479.0(P)
12、8.7(P)8.48.28.07.88PP8.9(P)8.6(P)8.48.29PPPP8.9(P)8.7(P)9PPPPPP09:37:2529不精密度和ADL的临界值（PctBnd=5%，d=3阶）样品号重复1重复2重复3重复4平均值一阶拟合值二阶拟合值三阶拟合值10.7000.7000.7000.7000.7000.8400.7020.68422.9003.0002.9002.8002.9002.8592.9252.95935.5005.1005.1005.3005.3005.0225.1635.16347.1007.1007.2007.1007.1007.1467.2167.18359
13、.0009.4009.0009.1009.1009.2329.0939.11009:37:25例230方程的阶数系数符号系数值系数标准误t-检验自由度回归标准误最优拟合方程一阶a0.0020.0790.984一阶b10.9530.0130.000180.180二阶a-0.2600.0910.0112y=-0.014X+1.105x-0.260二阶b11.1050.0410.001二阶b2-0.0140.0040.000170.136三阶a-0.3390.1390.026三阶b11.1920.1220.000三阶b2-0.0350.0270.217三阶b30.0010.0020.457160.1
14、3809:37:2531 计算最佳拟合回归标准误=0.136, 总平均浓度 c =5.02, /c =2.71%。由ADL计算公式得ADL=2.32%最优拟合方程是二阶d=2，在LR=20和/c = 2.71% (在2%-3%之间) 时，查表4临界值为5.7%-6.1%没有标注字母“P”，表明测量数据的精密度符合作线性评价的要求。ADL 为 2.32%, 小于临界值5.7%-6.1%，表明数据组具有临床可接受的非线性或二阶线性。方程的阶数系数符号系数值系数标准误t-检验自由度回归标准误最优拟合方程一阶a0.6572.8420.820一阶b11.0960.0520.000186.389y=1.0
15、96x+0.657二阶a4.7234.2310.280二阶b10.8070.2320.003二阶b20.0030.0030.218176.279三阶a10.7246.4840.118三阶b10.0540.6630.936三阶b20.0230.0170.184三阶b30.0000.0000.244166.19609:37:25例332测定值09:37:253310090807060504030201000123456样品号对数据组做图表明数据非常分散，因此先进行数据组精密度检验，假设一阶方程为最优 拟合方程，计算 /c=12.2%， 在 d=1， LR =20 和 /c9% 时，查表 4 显示字
16、母“P”。表明数据组精密度差，不能进行线性评价。09:37:2534/c%LR=10LR=12LR=14LR=16LR=18LR=2015.55.55.45.45.45.426.16.05.95.85.85.736.66.46.36.36.26.147.16.96.86.76.66.556.67.47.27.1706.968.27.97.77.57.47.278.7(P)8.4(P)8.17.97.87.68PP8.6(P)8.3(P)8.1809PPPP8.5(P)8.3(P)9PPPPPP09:37:2535不精密度和ADL的临界值（PctBnd=5%，d=1或2阶）L 样本数R重复测量的
17、次数最优拟合方程的回归标准误线性回归 以分析物浓度为X轴，测定结果为Y轴，绘制X-Y线性图：Y = aX +b，目测或进行统计学分析，判断是否符合要求。09:37:2536 前提：实验室设定cv 2%；非线性误差5% 直观印象：无明显离群点，重复测定数据间的偏差随浓度增加而增加。09:37:25举例-lgM37 D2/2 总和39.05，平均值7.81；平方根2.8，相当于总体的重复性标准差（SD）；百分差值的SD为 0.9%； 随机误差0.9%，分析析误差一般小于2%（2SD），但是也有可能超过(TE=Bias+1.65SD).09:37:253809:37:25回归分析39比较直线方程预期
18、值与最近拟合曲线预期值 低、中、高浓度测定结果超过5%，结论：非线性。09:37:254009:37:25lgM4109:37:25IgM偏差图4209:37:25Ca4309:37:25Ca4409:37:25Ca-多项式回归45 偏差超过非线性误差（0.2）；决定舍去第6点，用1-5进行评价。如果1-5符合要求，则其线性为4.65-15.409:37:25预测值偏差比较4609:37:254709:37:2548 t0.05,7=2.36509:37:25Ca-舍去第6点，多项式回归49 偏差小于0.2，在4.65-15.4范围内，符合线性要求。09:37:25预期值比较5009:37:2
19、55109:37:2552y = 1.024x - 0.011R = 0.999-520151050051015202509:37:25TC-线性评价2553ModelSummaryRRSquareAdjustedRSquareStd.ErroroftheEstimate0.9998422530.99968450.99965070.121TheindependentvariableisVAR00002.CoefficientsUnstandardizedCoefficientsStandardizedCoefficientstBStd.ErrorBetaSig.VAR000020.965721
20、90.02758890.940744635.0040310VAR00002*20.00921480.00348540.19328112.64384170.013VAR00002*3-0.00031740.0001122-0.1404258-2.82908840.009(Constant)0.03572190.05523960.64667270.52309:37:25SPSS结果54线性最佳差值%0-0.010.040.05-364.2732.072.112.04-0.08-3.56634.144.244.13-0.10-2.408436.216.366.28-0.08-1.313678.288
21、.488.45-0.04-0.4336910.3510.6110.630.020.20130312.9313.2613.340.080.63519609:37:25最佳拟合曲线和直线回归相比55方法最佳拟合方程|D|（mmol/L)|D|%线性范围上限（mmol/L)A二次0.020.190.21%2.45%12.93B一次-12.93C三次0.020.100.20%3.57%20.69D二次0.010.060.06%0.42%12.93E*一次-20.69F一次-12.93G三次0.020.080.27%3.87%20.6909:37:2556可报告范围的确定 分析测量范围（Analytic
22、al Measurement Range）方法直接测量标本，而不需要任何的稀释、浓缩或者其它预处理等过程下的分析物值的范围。（CAP）符合方法学性能，测量总误差满足方法规定的性能指标。 临床可报告范围（Clinically Reportable Range)是方法可采用对标本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测量下的分析物值的范围。临床有用性 可报告范围（Reportable Range）：实验室可建立或验证仪器或检测系统测量相应的准确实验结果值的范围。（CLIA），也被称为线性范围 （Linear Range）09:37:2557实验内容 浓度水平：5个（或以上）； 材料：标准溶液、
23、厂家或者PT机构提供的线性材料；（混合）患者样本、添加分析物；稀释液：水、生理盐水、牛蛋白或者血清白蛋白溶液、低浓度样本、空白血清。制备稀释物的程序：如前述，高低浓度样本比例混合；重复测定次数：3次数据分析：绘图，手工绘制通过所有点的最佳直线，如果不能通过所有点，应首先通过较低浓度点；对于直线不通过的点，估算非线性的系统误差。将系统误差与该浓度的预期随机误差（2s）之和与TEa相比较。09:37:2558指定值测定值均值0051051009510010510020020019520520030031030029030040038039040039050047046048047009:37:25
24、胆固醇举例 数据 mg/dL59y轴为均值与x轴为指定值的图形09:37:25图形 y轴为均值与x轴为指定值的图形60指定值均值估计偏差给定CV%S2STE(|bias|+2s)TEa055100100020020003003000400390-1031224-3440500470-3031530-6050线性范围可延伸到400mg/dL09:37:2561P158 AX轴标记为0%, 25%, 50%, 75%和100%稀释物。 BY轴标记为基于平均值或试验检测范围的适当水平。 C绘制【 (0%，混合物1均值), (25%，混合物2均值), (50%，混合物3均值), (75%，混合物4均值
25、), (100%，混合物5均值)】坐标。 D画出通过数据点的最佳直线给出头3个坐标更多权重。 E检查线性图，直观地作出可报告范围的决定。09:37:2562混合物均值(Y)理论值(X)偏倚（bias）%误差混合物1:060+6N/A混合物2:25%138139-1-0.7%混合物3:50%27827800混合物4:75%411417-6-1.4%混合物5:100%545556-11-2.0%09:37:25误差量化可报告范围工作表63校准验证 是以患者样本相同的方式检测已知浓度的材料证实在整个患者试验结果可报告范围之内仪器或检测系统的校准情况（CLIA）。 包括至少最低（或零）值，中值和最大值
26、接近范围的上限来验证实验室检测系统试验结果可报告范围； 至少每6个月进行一次，及不论何时出现下列情况时： 试剂批号的改变，除非实验室能证实并没有影响用于报告患者试验结果的范围，以及室内质控值并没有受到试剂批号改变的影响。 进行了重大的保养维护或关键部件的替换，可能影响试验性能。 室内质控出现异常的趋势或偏移，或超出实验室的可接受界限，及其他评价和纠正方法未能识别和纠正的问题。 实验室已建立的验证患者试验结果可报告范围的计划要求更经常性地校准验证。09:37:256409:37:25NCCL校准验证 评价仪器： 贝克曼、日立、Olympus AU 样本数5个 样本重复测定次数：565验证1 验证
27、1：校准线的斜率与1、截距与0无统计学差异，校准验证的测定值在可接受范围内，分析检测系统的校准有效。09:37:2566验证2 校准线的斜率与1或截距与0有统计学差异，但所有校准验证的测定值在可接受的范围内，分析检测系统的校准有效.09:37:2567差异1 校准线的斜率与1、截距与0无统计学差异，但校准验证测定值至少有一个超过了可接受范围，分析检测系统校准无效。反映出有随机误差09:37:2568差异2 校准线的斜率与1或截距与0有统计学差异，校准验证测定值至少有一个超出可接受范围，分析检测系统的校准无效。反映出有系统误差09:37:2569最简单的做法？ Xx.xxx 理论浓度-试剂浓度的线性 在制造商给定的线性范围内（10-1000mmol/L)范围内，相关系数0.9975. 以斜率和截距判断？09:37:2570谢谢09:37:2571
