1、第二章第二章 酶工程基础酶工程基础n第一节第一节 酶的分类和命名酶的分类和命名n第二节第二节 酶的化学本质、来源和生产酶的化学本质、来源和生产n第三节第三节 酶催化原理酶催化原理 n第四节第四节 酶催化反应动力学酶催化反应动力学第一节第一节 酶的分类和命名酶的分类和命名n一酶的分类：一酶的分类：n1氧化还原酶n2转移酶n3水解酶n4裂合酶n5异构酶n6连接酶（合成酶）n7核酸酶（催化核酸）1氧化还原酶 (Oxidoreductase)n包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶(Oxidase) 、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等n如乳酸如乳酸(Lactate)(Lactate)脱
2、氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH2转移酶(Transferase)n包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等n例如，例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO3水解酶(Hydrolase)n脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶n主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。n例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipa
3、se)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH4裂合酶(Lyase)n这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。n主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。n例如，例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。HOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH5异构酶(Isomerase)n此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等例如，例如，6-6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。6连接酶（合成酶）(
4、Ligase or Synthetase)n又称为合成酶，能够催化又称为合成酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类反应必须与键的形成反应。这类反应必须与ATPATP分解反应相互分解反应相互偶联。偶联。nA + B + ATP + H-O-H =A A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi B + ADP +Pi n例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸丙酮酸 + + COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸7.核酸酶（催化核酸） Ribozymen核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的
5、RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。酶用于生物催化的概况类别类别占总酶比例占总酶比例% %利用率利用率% %水解酶水解酶 hydrolases2665氧化还原酶氧化还原酶oxidoreductases2725转移酶转移酶 transferases245裂合酶裂合酶 lyases125异构酶异构酶 isomerases51连接酶连接酶 ligases61第二节第二节 酶的化学本质、来源和生产酶的化学本质、来源和生产n一、酶催化功能的结构基础n 酶是蛋白质酶是蛋白质n 酶分子的组酶分子的组n 酶蛋白分子的结构特征酶蛋白分子的结构特征n 维持酶蛋白分子构象的力维持酶蛋白分子构象的
6、力n 酶蛋白一级结构与空间构像的关系酶蛋白一级结构与空间构像的关系 n 酶的活性部位酶的活性部位 酶的化学本质u 酶由氨基酸组成，分子量很大u 酶是高分子胶体物质、两性电解质，在电场中如蛋白质一样泳动u 导致蛋白质变性的因素往往也能使酶变性u 酶能被蛋白酶水解而失活 非蛋白催化剂（或称非酶催化剂） 核酶（ Ribozyme）具有催化能力的RNA 脱氧核酶（deoxy Ribozyme）人工合成的具有催化能力的DNA 酶分子的组成酶分子的组成酶按组成分类单纯酶：不需辅酶，除蛋白质不含其他成分 如水解酶类的胃蛋白酶、核酸酶、脲酶等 结合酶（全酶）蛋白质非蛋白部分金属离子： 如羧肽酶含Zn2+小分子
7、物质：转氨酶含磷酸吡哆醛糖蛋白：凝血酶含糖蛋白RNA ： RNase P含RNA等 广义辅酶根据其与酶蛋白结合程度辅酶：与酶蛋白结合不牢，极易分离，在反应 溶液中与酶蛋白处于可逆的解离状态 如NAD+、NADP+辅基：与酶蛋白结合十分牢固而不易分离 如细胞色素氧化酶的铁卟啉、葡萄糖氧 化酶的FAD分子辅酶的功能：辅酶参与和底物分子作用，催化底物反应，而且对酶蛋白的稳 定性起保护作用,而高分子酶蛋白提供特异性催化条件单体酶、寡聚酶和多酶复合物单体酶、寡聚酶和多酶复合物1.单体酶（单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。2.寡聚酶寡聚酶 (oli
8、gomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。3.多酶复合物多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。丙酮酸脱氢酶系（丙酮酸脱氢酶系（E.coliE.coli）：丙酮酸脱氢酶（）：丙酮酸脱氢酶（E E）、）、硫辛酰转乙酰酶（硫辛酰转乙酰酶（E E）和二氢硫辛酰脱氢酶（）和二氢硫辛酰脱氢酶（E E）。）。EEE碱性EEE+EE+脲 酶蛋白分子的结构特征酶蛋白分子的结构特征蛋白质功能决定于其结构，不仅与其氨基酸组成（一级结构）有关，还与其空间结构
9、有关 具有酶活性的蛋白质都是球蛋白具有酶活性的蛋白质都是球蛋白：在球蛋白的分子中，一条肽链往往是通过一部分-螺旋、一部分-折叠、一部分-转角和一部分无规则卷曲而形成紧密的球状构象 在球蛋白分子中，大多数非极性侧链总是埋藏在分子内部，形成疏水核疏水核，而大多数极性侧链总是暴露在分子表面上，形成一些亲水区。亲水区。 在球蛋白质分子表面，往往有一内陷的空穴，此空穴往往是疏水区，能够容纳一个或两个小分子配体或大分子配体的一部分。 对酶分子而言，此空穴正好容纳一个或多个小分子底物或大分子底物的一部分此即酶活性部位 有些球蛋白具有四级结构，这类球蛋白的分子中含两条或更多条肽链，他们彼此以非共价键相连，每一
10、条肽链都有自己的二三级结构，此多肽链即为蛋白质分子的亚单位（亚基） 亚基一般由一条多肽链组成，也有的有几条多肽链由二硫键相连而成一级结构二级结构三级结构四级结构 维持酶蛋白分子构象的力维持酶蛋白分子构象的力 蛋白质多肽链何以形成二级、三级结构？ 为什么多数蛋白质分子总是采取内含疏水核外包亲水壳的球状 或椭圆状的紧密结构？这不仅涉及到侧链间相互作用，而且涉及到侧链与溶剂环境（pH、温度、离子强度、溶质等）的相互作用 疏水的相互作用疏水键 维持四级结构起着主要作用 两非极性基团（疏水基团）为了避开水相而聚集在一起的作用 HCCH3CHCH3蛋白质分子的多肽链中，非极性氨基酸残基（Leu、Ile、V
11、al、Ala、Phe、Tyr、Pro、Met）的疏水侧链有一种避开水而相互粘附的趋势，藏于蛋白质分子的内部 在大多数蛋白质中，非极性氨基酸残基含量往往高达30%50%，为避开水相，总是千方百计聚集在一起，在分子内部形成一个疏水核多肽链盘旋折叠，形成一个紧密球状或椭圆状结构，即使如此，有时还不足以将所有疏水残基全部包藏在由一条肽链折叠形成的核心里，过剩的疏水残基只有通过亚单位聚合以实现把剩余疏水侧链包藏在亚单位之间，因此疏水键对于维持蛋白质分子四级结构起着主要作用 氢键 氢键可发生在两条多肽链之间，或一条多肽链的不同部位之间 主链骨架上羰基氧原子与亚胺基氢原子生成氢键CORHCHNHNCHRCO
12、NHOC在一条直线上，氢键键能大约为84186.8J/mol，长度为0.2790.012nm，这种氢键对维持蛋白质二级结构、保持蛋白质稳定性起极其重要的作用主链骨架上这一氢键 对于-螺旋、-折叠、-转角的维持起重要作用C O NH 在蛋白质的某些侧链之间如Ser、Thr、Tyr的-OH与Glu、Asp的 COOH可生成氢键 某些侧链与主链骨架之间，如Tyr的OH与主链骨架的C O,可构 成氢键HCCH2OHHNCOCHCH2CCH2O-OHNCOHCCH2OHHNCOCOCHRHN 配位键 不少酶蛋白含金属离子，如固氮酶 金属离子与蛋白质的连接往往是配位键，当用螯合剂从蛋白质 中取出金属离子时
13、，则蛋白质分子便解离成亚单位，或者是三 级结构局部遭破坏，以致活力丧失 二硫键（SS） 两个Cys的SH可产生二硫键 键能很大约（30100）4185.8J/mol，是很强的化学键 在某些蛋白质中，二硫键一旦破坏，则蛋白质活力丧失；二硫 键的数目多，则蛋白质分子抗拒外界因素的能力也加强，即蛋 白质分子的稳定性也增强 RNase中的二硫桥 离子键（又叫盐键或盐桥） 蛋白质分子中带正电荷的基团有： N-末端的-NH3+ ；肽链中的 Lys-NH3+、 带负电的基团有：C-末端的-COO-；肽链中的Asp- COO- Glu-COO- 带正电的极性侧链与带负电的极性侧链可发生静电吸引 高浓度的盐、过
14、高或过低的pH值可破坏蛋白质构象中的离子键， 这就是强酸、强碱使蛋白质变性的原因 范德华引力 不带电的极性侧链之间，或不带电的极性侧链 与非极性侧链之间，或非极性侧链之间可产生 范德华引力ArgCNHNH2NH2+ 酶蛋白一级结构与空间构像的关系酶蛋白一级结构与空间构像的关系n一级结构决定了蛋白质的空间结构n实验证据：在8mol/L尿素存在下，用巯基乙醇处理天然RNase，其二硫键全部断裂，肽链松散，活性全部丧失。n 当用透析法除去尿素、巯基乙醇后，RNase活力全部恢复，而且复原后产物其物化性质与天然RNase完全相同；n 而在随机情况下，8个HS-形成4个SS时，应有105种不同方式，但在
15、复原过程中，走向随机的RNase肽链却只选择了其中一种方式（即与天然构象完全相同），这说明RNase的一级结构决定了其特定的天然构象 酶的活性部位 酶是生物大分子物质，分子量都在10000以上，至少每个酶分子由100个以上氨基酸连接而成，然而，只有少数一些氨基酸残基和催化活力有关，这些特异的氨基酸残基组成了酶的活性中心。 酶与其他蛋白质的不同之处在于，酶分子在一级结构基础上通过二三级折叠盘绕,形成了各自特定的具有催化功能的活性构像区域，酶分子不是以整个分子，而是在这个区域内参与和底物结合并对底物进行催化反应。活性中心前列腺素H2合成酶活性中心的本质活性中心的本质n活性中心是酶分子中活性中心是酶
16、分子中与催化功能直接有关与催化功能直接有关并在三维结构上相互并在三维结构上相互靠近的少数几个靠近的少数几个aa残残基或其上的某些基团基或其上的某些基团按照特定立体构象组按照特定立体构象组成的活性结构区域成的活性结构区域.（是与底物结合并催（是与底物结合并催化反应的场所）化反应的场所）溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心活性中心的特点：活性中心的特点：n仅为酶分子的仅为酶分子的少数几个少数几个残基残基由于肽链的盘绕折由于肽链的盘绕折叠而成；叠而成；n是由是由特定空间构象特定空间构象维持维持的一个裂隙；的一个裂隙；n活性中心以外的部分对活性中心以外的部分对活性中心形成提供结构活性中心形成提供结构基础。
17、基础。 羧肽酶活性中心羧肽酶活性中心 活性中心包括催化部位和底物结合部位活性中心包括催化部位和底物结合部位q催化部位催化部位：在催化反应中直接参与电子授：在催化反应中直接参与电子授受关系的部位，受关系的部位，直接参与催化直接参与催化，底物敏感，底物敏感键在此被切断或形成新键，并形成产物。键在此被切断或形成新键，并形成产物。q底物结合部位底物结合部位：指：指与底物特异结合与底物特异结合的有关的有关部位，也叫特异性决定部位。部位，也叫特异性决定部位。 实验表明：实验表明： 活性中心上有活性中心上有7 7种氨基酸的频率最高，分别是：种氨基酸的频率最高，分别是： Ser, His, Cys, Tyr,
18、 Asp, Glu, Lys同类酶活性中心一级结构的氨基酸顺序十分相似；同类酶活性中心一级结构的氨基酸顺序十分相似；催化各类反应的酶，其活性中心的基团常有一定的特征；催化各类反应的酶，其活性中心的基团常有一定的特征； 如：蛋白酶如：蛋白酶-丝氨酸、组氨酸（丝氨酸、组氨酸（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶） 半胱氨酸半胱氨酸（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶） 脱氢酶脱氢酶-酪氨酸（苹果酸脱氢酶等）酪氨酸（苹果酸脱氢酶等） 转移酶、脱羧酶或异构酶转移酶、脱羧酶或异构酶-氨基（转氨酶、某些激酶）氨基（转氨酶、某些激酶） 氧化还原酶氧化还原酶- - CysCys二硫键二硫键活
19、性部位和必需基团必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必必需需基基团团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质接触残基+辅助残基结构残基二、酶的生产二、酶的生产n酶的获得是酶和酶工程研究的主要内容酶的获得是酶和酶工程研究的主要内容之一，包括酶的生产与提取纯化。之一，包括酶的生产与提取纯化。n 1 1、酶的来源、酶的来源、n 2 2、发酵生产、发酵生产、n 3 3、提高酶产量的方法、提高酶产量的方法、n 4 4、提取纯化、提取纯化、n 5 5、纯度与回收率、纯度与回收率酶的来源酶的来源
20、1 1、动植物原料提取、动植物原料提取 早期多为采用早期多为采用 例如：用动物脏器、麦芽、木瓜、菠萝等提取各种酶。例如：用动物脏器、麦芽、木瓜、菠萝等提取各种酶。（尿激酶、蚓激酶、凝血酶、抑肽酶、糜蛋白酶、透明质（尿激酶、蚓激酶、凝血酶、抑肽酶、糜蛋白酶、透明质酸酶等酸酶等)2 2、动植物细胞培养、动植物细胞培养 近二十年来研究近二十年来研究3 3、 微生物发酵微生物发酵 目前工业应用酶大多数来自微生物目前工业应用酶大多数来自微生物以微生物为生产原料有许多优点：以微生物为生产原料有许多优点： 微生物种类繁微生物种类繁多多； 产酶微生物产酶微生物多多；菌株易诱变；菌株易诱变 一种微生物产好几种酶
21、；一种微生物产好几种酶； 微生物繁殖微生物繁殖快快、生产周期、生产周期短短、培养方便，易提取酶，特、培养方便，易提取酶，特 别是别是胞外酶胞外酶； 微生物微生物易改造易改造，可通过各种手段培育新种；，可通过各种手段培育新种； 酶发酵过程可电脑控制，生产可连续化、自动化。酶发酵过程可电脑控制，生产可连续化、自动化。酶的发酵生产酶的发酵生产 1 1、酶的生产菌、酶的生产菌 先决条件，直接影响发酵的生先决条件，直接影响发酵的生产成本产成本. . (1)(1)、对生产菌的要求：、对生产菌的要求： 产量高产量高（利用廉价原料，周期短）；（利用廉价原料，周期短）； 非病源非病源菌；菌； 生产菌要生产菌要稳
22、定稳定（不易变异退化，不易感染噬菌体）；（不易变异退化，不易感染噬菌体）； 最好分泌最好分泌胞外酶胞外酶，以利于酶的分离。，以利于酶的分离。 产蛋白酶活力应很低（除蛋白酶生产菌外）。产蛋白酶活力应很低（除蛋白酶生产菌外）。n目前投入工业发酵生产的酶约有目前投入工业发酵生产的酶约有60706070种，它种，它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌n其中大规模工业生产的只有将近其中大规模工业生产的只有将近20302030种。种。n目前工业用酶中，目前工业用酶中， 蛋白酶占蛋白酶占59%59%， 糖化酶糖化酶13%13%， - -淀粉
23、酶淀粉酶5%5%， 葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶6%6%， 果胶酶果胶酶3%3%， 纤维素酶纤维素酶1%1%， 脂肪酶脂肪酶3%3%， 医药与分析研究用酶占医药与分析研究用酶占10%10%。 （3 3）、主要产酶菌）、主要产酶菌大肠杆菌：大肠杆菌：应用最广泛。因为其遗传背景清楚而广泛应用应用最广泛。因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌工程菌”。也常在工业生产中应用于生产。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、门冬门冬酰酰氨酸酶、青霉素氨酸酶、青霉素酰化酶、酰化酶、限制性核酸内切酶限制
24、性核酸内切酶等。等。枯草杆菌：枯草杆菌：淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等。淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等。啤酒酵母：啤酒酵母：主要产主要产酰酰化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、凝化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、凝血激酶、尿激酶等。血激酶、尿激酶等。曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。等多种酶。发酵条件对产酶的影响发酵条件对产酶的影响 1、培养基培养基 2 2、pHpH值值 3 3、温度温度 4 4、溶解氧溶解氧 5 5
25、、搅拌、搅拌6 6、泡沫、泡沫7 7、发酵周期发酵周期 优良菌种优良菌种的筛选、的筛选、适宜条件适宜条件的确定是获得高产酶的的确定是获得高产酶的重要措施，能较大幅度提高酶产量，尽量挖掘微生重要措施，能较大幅度提高酶产量，尽量挖掘微生物的产酶潜力。但是措施是有限的，并且是经验的，物的产酶潜力。但是措施是有限的，并且是经验的，随机性大，单靠这些措施很不够。为了使酶产量有随机性大，单靠这些措施很不够。为了使酶产量有一个飞跃，要采取一个飞跃，要采取另外一些有效措施。另外一些有效措施。提高酶产量的方法提高酶产量的方法n针对性的打破生物细胞内酶蛋白的合成机针对性的打破生物细胞内酶蛋白的合成机制，可以从以下
26、方面入手：制，可以从以下方面入手：1. 1.条件控制条件控制2.2.遗传控制遗传控制诱变育种诱变育种基因重组基因重组 构建工程菌构建工程菌添加诱导物添加诱导物降低阻遏浓度降低阻遏浓度添加表面活性剂添加表面活性剂产酶促进剂产酶促进剂采用添加诱导物、解除阻采用添加诱导物、解除阻 遏物、流加等技术遏物、流加等技术 1 1、添加诱导物：、添加诱导物： 许多工业用酶（淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、许多工业用酶（淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半乳糖苷酶等）都属诱导酶，对于诱导酶的发半乳糖苷酶等）都属诱导酶，对于诱导酶的发酵生产，添加适量诱导物可使酶产量显著提高。酵生产，添加适量诱导物可使酶产量显著提高。 原理是原
27、理是，加入效应物与阻遏蛋白结合，阻止其与，加入效应物与阻遏蛋白结合，阻止其与操纵基因结合，使结构基因得以表达；实际工操纵基因结合，使结构基因得以表达；实际工作中，关键是选择一个恰当的诱导物、确定诱作中，关键是选择一个恰当的诱导物、确定诱导浓度及诱导时间。导浓度及诱导时间。 诱导物一般有以下几类：诱导物一般有以下几类： 难于被利用的底物，底物类似物或底物修饰难于被利用的底物，底物类似物或底物修饰物。如：物。如：IPTGIPTG 诱导物的前体。如：诱导物的前体。如：犬尿酸的前体犬尿酸的前体Trp,Trp,也能诱导犬尿也能诱导犬尿酸酶。酸酶。 酶的反应产物。如：酶的反应产物。如：纤维二糖诱导纤维素酶
28、，没食纤维二糖诱导纤维素酶，没食子酸诱导单宁酶。子酸诱导单宁酶。 诱导物添加的量和时间要通过实验确定。诱导物添加的量和时间要通过实验确定。 pH pH 、温度、温度 细胞生长温度细胞生长温度 2 2、降低阻遏浓度降低阻遏浓度 尾产物阻遏：尾产物阻遏：可可去除尾产物去除尾产物或使其尽量少形成，或使其尽量少形成，如添加尾产物类似物或其抑制剂、采用营养缺陷型如添加尾产物类似物或其抑制剂、采用营养缺陷型菌株等；菌株等； 分解代谢产物阻遏：分解代谢产物阻遏： A)A)、尽量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源；、尽量不要采用葡萄糖等易被利用的碳源； B)B)、流加、流加将葡萄糖逐渐加入反应器，使反应器中的将葡
29、萄糖逐渐加入反应器，使反应器中的 葡萄糖保持在低水平。葡萄糖保持在低水平。 C)C)、添加一定量的、添加一定量的cAMPcAMP。 3 3、添加表面活性剂促进酶分泌到胞外、添加表面活性剂促进酶分泌到胞外 细胞内酶含量提高到一定程度，会被胞内蛋白酶分细胞内酶含量提高到一定程度，会被胞内蛋白酶分解，加入表面活性剂之类促进分泌剂，可使胞内酶解，加入表面活性剂之类促进分泌剂，可使胞内酶未被分解即被释放到胞外未被分解即被释放到胞外( (因为表面活性剂有助于改因为表面活性剂有助于改善细胞通透性，因而也可打破细胞内酶合成的善细胞通透性，因而也可打破细胞内酶合成的“反反馈平衡馈平衡”) )。 常用：常用：Tw
30、een-80Tween-80、Triton x-100Triton x-100等。等。 表面活性剂n增加细胞通透性。增加细胞通透性。处在气液界面改善了氧的传递速度，处在气液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性，增加酶产量。还可以保护酶的活性，增加酶产量。n生产上常用非离子型表面活性剂生产上常用非离子型表面活性剂。离子型表面活性剂。离子型表面活性剂对微生物有害。用于食品医药的酶在生产中用的表面对微生物有害。用于食品医药的酶在生产中用的表面活性剂须对人畜无害。活性剂须对人畜无害。n阴离子型阴离子型：SDSSDS，有抑菌作用，有抑菌作用，使蛋白质变性使蛋白质变性。n阳离子型阳离子型：季铵盐类，
31、：季铵盐类，使细胞膜损伤使细胞膜损伤。n非离子型非离子型：PEGPEG、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、聚醚类、吐温、聚醚类、吐温、Triton-X-100Triton-X-100等等。4 4、添加产酶促进剂、添加产酶促进剂n植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或橘青霉磷酸二酯植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或橘青霉磷酸二酯酶产量提高酶产量提高1-201-20倍；倍；n聚乙烯醇可提高糖化酶产量；聚乙烯醇可提高糖化酶产量；n聚乙烯醇、醋酸钠等可提高纤维素酶产量。聚乙烯醇、醋酸钠等可提高纤维素酶产量。 产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，
32、无规律可循。不相同，无规律可循。诱变育种诱变育种-人为引起基因突变，使亲株失去固有人为引起基因突变，使亲株失去固有产酶机制产酶机制 诱变育种是采用物理或化学诱变剂处理均诱变育种是采用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使突变频率大幅匀分散的微生物细胞群，促使突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速高效的筛度提高，然后设法采用简便、快速高效的筛选方法，从中挑选出少数符合要求的选方法，从中挑选出少数符合要求的突变株突变株。 1 1、基因突变：、基因突变： 是遗传物质是遗传物质核酸核酸(DNA,RNA)(DNA,RNA)中的核苷酸顺序突然中的核苷酸顺序突然发生发生稳定的可遗传稳定的可遗传
33、的变化，包括的变化，包括DNADNA链上一对或少链上一对或少数几对碱基发生改变（点突变），或是数几对碱基发生改变（点突变），或是DNADNA的大段的大段变化、损伤（染色体畸变）变化、损伤（染色体畸变） 突变可发生在突变可发生在DNADNA顺序的不同位置上：顺序的不同位置上： 结构基因、调节基因、操纵基因、结构基因、调节基因、操纵基因、 启动基因启动基因 2 2、 诱变目的：诱变目的： 诱导型诱导型 组成型：组成型：以使获得的突变株在没有诱导以使获得的突变株在没有诱导物存在条件下，酶产量也能达到诱导水平。物存在条件下，酶产量也能达到诱导水平。 阻遏型阻遏型 去阻遏型：去阻遏型：即获得的突变株通常
34、引起阻即获得的突变株通常引起阻遏的条件下酶产量也达到无阻遏水平。遏的条件下酶产量也达到无阻遏水平。 酶生物合成的模式酶生物合成的模式 同步合成型同步合成型 延续合成型延续合成型 中期合成型中期合成型 滞后合成型滞后合成型 n (1)(1)延续合成型延续合成型-酶的工业生产中最理想酶的工业生产中最理想 细胞开始生长就有酶产生，细胞生长进入平衡期后，细胞开始生长就有酶产生，细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续生成一段时间。酶还可以延续生成一段时间。n (2)(2)同步合成型同步合成型 尽量提高对应的尽量提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降低发酵温度等。的稳定性，如降低发酵温度等。n (3)(3)
35、滞后合成型滞后合成型 要尽量减少阻遏物，使酶的合成提前开始。要尽量减少阻遏物，使酶的合成提前开始。n (4)(4)中期合成型中期合成型 从提高从提高mRNAmRNA稳定性以及解稳定性以及解除除阻遏两方面进行。阻遏两方面进行。 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。酶的纯度与回收率酶的纯度与回收率催化反应的能力，表
36、示样品中酶的浓度（催化反应的能力，表示样品中酶的浓度（u/mlu/ml酶酶液）；液）；整个样品中的全部酶活力，即酶活力（整个样品中的全部酶活力，即酶活力（u/mlu/ml酶液）酶液） 酶液总体积（酶液总体积（mlml）；）；酶活力：酶活力：总活力总活力：回收率：回收率：比比 活活 力：力：提纯倍数：提纯倍数： 提纯前后提纯前后比活力比活力之比。之比。 单位质量的蛋白质所含有的酶活力。单位质量的蛋白质所含有的酶活力。提纯前与提纯后酶的提纯前与提纯后酶的总活力总活力之比；之比；酶的保存酶的保存n影响酶稳定性的因素影响酶稳定性的因素1) 1)温度温度低温或更低温（加甘油或多元醇）低温或更低温（加甘油
37、或多元醇）2)2)pHpH与缓冲液与缓冲液酶的稳定范围内酶的稳定范围内3)3)酶蛋白浓度酶蛋白浓度浓度高较稳定浓度高较稳定4)4)氧氧有些酶易氧化失活。有些酶易氧化失活。n提高酶的稳定性提高酶的稳定性加入酶的稳定剂加入酶的稳定剂1) 1)底物、抑制剂和辅酶底物、抑制剂和辅酶2)2)SH-SH-保护剂保护剂: : 二巯基乙醇、二巯基乙醇、GSHGSH、DTTDTT。3)3)金属离子金属离子（CaCa2+2+能保护淀粉酶，能保护淀粉酶，MnMn2+2+能稳定溶菌酶，能稳定溶菌酶，ClCl- -能稳定能稳定透明质酸酶）；透明质酸酶）；表面活性剂；高分子化合物表面活性剂；高分子化合物（血清蛋白、多元（
38、血清蛋白、多元醇，特别是甘油和蔗糖）；醇，特别是甘油和蔗糖）；防止微生物污染（甲苯、苯甲酸、防止微生物污染（甲苯、苯甲酸、百里醇）百里醇）第三节第三节 酶催化原理酶催化原理 酶作为生物催化剂与一般化学催化剂的比较： A. 更高的催化效率 B. 更高的反应专一性 C. 温和的反应条件 D. 具有调节能力 E. 易变性失活（一）、酶的作用方式（一）、酶的作用方式 形成酶-底物中间络合物（酶-底物 络合物学说） 当一个酶在起催化作用时,首先要和底物结合形成一个酶-底物复合体,然后再催化底物转化成产物。 E-S complexsubstraten 中间络合物学说的验证 n 把温度降至-50时，反应速度
39、大大降低，本来不稳定的中间物相对就稳定了。这时就可以进行晶体衍射分析。 ( (二二) )、 酶的高催化效率酶的高催化效率 就分子比而言，酶催化反应速度比非催化反应速就分子比而言，酶催化反应速度比非催化反应速度高度高1081020倍，比非酶催化反应高倍，比非酶催化反应高1071013倍。以倍。以转换数表示，大部分酶为转换数表示，大部分酶为1000左右。左右。 转换数：在一定条件下，每个活性中心或每个酶分子每秒钟催化底物转变的分子数。酶的催化机理是降低活化能酶的催化机理是降低活化能 酶的催化机理 A、底物形变 B、邻近与定向效应 C、酸碱催化 D、共价催化 E、微环境效应 底物形变底物形变(扭曲、
40、张变）扭曲、张变） 酶反应时酶反应时, ,酶活性部位与底物分子结酶活性部位与底物分子结合合, ,由于酶活性中心关键电荷基团使底物由于酶活性中心关键电荷基团使底物某些敏感键发生形变某些敏感键发生形变( (扭曲、张变扭曲、张变) )，使底，使底物分子构象改变，有关反应键削弱，从而物分子构象改变，有关反应键削弱，从而使反应物从基态激发为过渡态，从而降低使反应物从基态激发为过渡态，从而降低了活化能，形成过渡态络合物，加速反应了活化能，形成过渡态络合物，加速反应进行。进行。 邻近与定向效应邻近与定向效应 邻近效应是指酶与底物结合形成络合物以后，使底物与底邻近效应是指酶与底物结合形成络合物以后，使底物与底
41、物、酶的催化基团与底物之间，结合于同一分子的活性部位上而物、酶的催化基团与底物之间，结合于同一分子的活性部位上而使活性部位的底物有效浓度得以极大提高，从而反应速度大大增使活性部位的底物有效浓度得以极大提高，从而反应速度大大增大的一种效应。大的一种效应。 定向效应是指反应物的反应基之间，酶的催化基团与底物的反应定向效应是指反应物的反应基之间，酶的催化基团与底物的反应基之间的正确取位后产生的反应速度增大的一种效应基之间的正确取位后产生的反应速度增大的一种效应。 酸碱催化酸碱催化 酶分子中具有各种酸性或碱性氨基酸酶分子中具有各种酸性或碱性氨基酸侧链，酸碱催化是通过瞬时地向反应物提侧链，酸碱催化是通过
42、瞬时地向反应物提供质子或从反应物中汲取质子，以稳定过供质子或从反应物中汲取质子，以稳定过渡态、加速反应。渡态、加速反应。 共价催化共价催化 共价催化又称亲核或亲电子催化，催共价催化又称亲核或亲电子催化，催化时，酶作为亲核催化剂或亲电子催化剂化时，酶作为亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价络合物，降低反应活化自由能，定的共价络合物，降低反应活化自由能，以达到加速反应的目的。以达到加速反应的目的。 微环境效应微环境效应 酶在其活性部位内造成一个疏水的酶在其活性
43、部位内造成一个疏水的微环境，有利于中间络合物的生成和稳微环境，有利于中间络合物的生成和稳定。定。酶作用的专一性结构专一性结构专一性立体异构专一性立体异构专一性族（基团）专一性族（基团）专一性绝对专一性绝对专一性（三）、酶作用的专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。键专一性键专一性旋光异构专一性旋光异构专一性几何异构专一性几何异构专一性酶作用专一性的假说酶作用专一性的假说 1. 锁与钥匙学说（模板学说锁与钥匙学说（模板学说） 认为底物分子（或其一部分）象钥匙 那样专一地楔入到酶的活性中心部位。 （图示图示
44、） 2. 三点附着学说三点附着学说 认为底物的效应基团只有与酶的活性 中心三点匹配，才能起反应。（。（图示图示） 3.3.诱导楔合假说诱导楔合假说 认为当酶分子与底物接近时，酶蛋白 受底物的诱导而发生有利于底物结合 的构象变化，酶与底物在此基础上互 补楔合，进行反应。（。（图示图示）+底物底物酶酶酶酶底物复合物底物复合物锁与钥匙关系学说锁与钥匙关系学说酶酶底物底物不匹配不匹配互补匹配互补匹配三点附着学说三点附着学说诱导楔合假说诱导楔合假说第四节第四节 酶催化反应动力学酶催化反应动力学 一、酶分析一、酶分析 ( (即酶活力测定即酶活力测定) ) （Enzyme AssayEnzyme Assay
45、） 酶活力：是指酶催化一定化学反应的能力，其大小可酶活力：是指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表用在一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表示。（单位时间底物减少或产物增加）示。（单位时间底物减少或产物增加） 一个酶单位一个酶单位（active unit, U，I.U）为在确定的最适为在确定的最适反应条件下，每分钟催化反应条件下，每分钟催化1mol( (微摩尔）微摩尔）底物变化所底物变化所需要的酶量。（国际酶委员会规定）需要的酶量。（国际酶委员会规定） 所以：酶的单位数与速度值数值上相等所以：酶的单位数与速度值数值上相等 （一）、测定原理：（一）
46、、测定原理： 测酶活力就是在确定的最适反应条件下测测酶活力就是在确定的最适反应条件下测定酶促反应速度，定酶促反应速度， 酶促反应速度取决于那些因素酶促反应速度取决于那些因素 ？速度方程速度方程米氏方程米氏方程 Michaelis & MentenMichaelis & Menten根据中间产物学说推根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称为关系的公式称为 米氏方程：米氏方程： 关于米氏方程的讨论关于米氏方程的讨论1、 Km S 时：时： v=VS/ Km 初速度与初速度与S成正比的成正比的一级反应。一级反应。2、若、若Km 100K
47、m100Km时：时：v= Vmv= Vm S/(Km +S) S/(Km +S) VmVm，即反应，即反应初速度接近于最大速度。而初速度接近于最大速度。而Vm = Vm = K K3 3 EE0 0 ，即酶活性直接，即酶活性直接正比于正比于EE0 0 ，而与，而与SS无关（表明酶活性部位全部被底物无关（表明酶活性部位全部被底物占据）。在测定酶活性时，一般选择此条件。占据）。在测定酶活性时，一般选择此条件。 vSS或PS0SPS0/2t1/2=S0/2Vmt 测定酶活力的基本要求：测定酶活力的基本要求：1 1、要使反应系统中要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限除待测酶浓度是影响反应速
48、度的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；制性因素（反应速度定量酶活力）；2 2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）；、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大能力）； 所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下几方面做工作：做工作： 底物？底物？ pHpH？ 温度？温度？ 样品？样品？ （四）、测定：（四）、测定： 1） 测测产物产物生成速度生成速度 酶活力大小可用反应速度表示，反应速度可用酶活力大小可用反应速度表示，反应速度可用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示：单位时间内底物的减少或产物的增加来表示： V = = dSdtd
49、Pdt 2）、）、测反应的初速度测反应的初速度 随着反应的进行，底物浓度下降和产物增加导随着反应的进行，底物浓度下降和产物增加导 致逆反应从无到有，逐渐变得显著起来；致逆反应从无到有，逐渐变得显著起来； 酸、碱、热等也在慢慢地使酶失活变性。酸、碱、热等也在慢慢地使酶失活变性。 因此，这种情况下测的反应速度只是一种表观的、因此，这种情况下测的反应速度只是一种表观的、各种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性，各种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性，真正能代表酶催化活力的是真正能代表酶催化活力的是反应初始阶段反应初始阶段的速度。的速度。 通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间通过制作进
50、程曲线来确定初速度范围的时间通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间通过制作进程曲线来确定初速度范围的时间 二、酶法分析二、酶法分析（ENZYME ANALYSISENZYME ANALYSIS） 酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。有关的样品中酶以外其他物质的含量。 常用于食品、药物、体液等样品中成分含常用于食品、药物、体液等样品中成分含量检测量检测 1 1、基本
