1、1第第6 6章章重组重组DNADNA技术技术及其应用及其应用.2一、重组一、重组DNADNA技术概述技术概述1.1.重组重组DNADNA技术的相关概念技术的相关概念u克隆克隆: : 作作名词名词时指含有某目的时指含有某目的DNADNA片段的重片段的重组组DNADNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。分子或含有该重组分子的无性繁殖系。 作作动词动词时是指基因的分离与重组过程。时是指基因的分离与重组过程。u重组重组DNADNA技术技术是指将一种生物体（供体）的是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的
2、另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNADNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，因此，供体、受体、载体供体、受体、载体是重组是重组DNADNA技术的技术的三大基本元件。三大基本元件。.3一、重组一、重组DNADNA技术概述技术概述2.2.重组重组DNADNA技术的基础技术的基础uDNADNA的双螺旋结构、遗传信息传递的中心法则、的双螺旋结构、遗传信息传递的中心法则、遗传密码，为基因工程奠定了遗传密码，为基因工程奠定了理论基础理论基础 u酶学、细菌学、病毒学的发展，为基因工程提酶学
3、、细菌学、病毒学的发展，为基因工程提供了必要的供了必要的工具工具 u两项关键性两项关键性技术技术（DNADNA的体外切割与连接技术；的体外切割与连接技术；DNADNA的核酸序列分析技术）的问世，从根本上的核酸序列分析技术）的问世，从根本上解决了解决了DNADNA的结构分析问题的结构分析问题.4二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤（1 1）获得目的基因）获得目的基因（2 2）与克隆载体连接，形成新）与克隆载体连接，形成新的重组的重组DNADNA分子分子（3 3）用重组）用重组DNADNA分子转化受体分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复细胞，并能在受体细胞中复制和遗传制和遗传（
4、4 4）对转化子筛选和鉴定）对转化子筛选和鉴定（5 5）对获得外源基因的细胞或）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的遗传性状或表达出所需要的产物的产物.5.6二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤1. 1. 目的基因的获取目的基因的获取u已知基因的获取：已知基因的获取： PCRPCR、化学合成法、化学合成法u未知基因的获取：未知基因的获取： 基因文库分离法基因文库分离法、直接分离法、直接分离法.7uPCRPCR：polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，在体
5、外，在体外模拟细胞内进行的模拟细胞内进行的DNADNA复制过程复制过程二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤1. 1. 目的基因的获取目的基因的获取 之之 PCRPCR法法（1 1）变性（）变性（denaturationdenaturation）：模板）：模板DNADNA经热变性，双链被经热变性，双链被解开，成为两条单链。解开，成为两条单链。（2 2）退火（）退火（annealingannealing）：温度下降，变性）：温度下降，变性DNADNA复性，使寡复性，使寡核苷酸引物即与模板核苷酸引物即与模板DNADNA中所要扩增序列两端的碱基配对。中所要扩增序列两端的碱基配对。（
6、3 3）延伸（）延伸（extensionextension）：）： 在适宜条件下（包括在适宜条件下（包括DNADNA聚合酶聚合酶和核苷酸单体），引物和核苷酸单体），引物3 3 端向前延伸，合成与模板碱基序端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的列完全互补的DNADNA链。链。.81234522557294时间（min）温度（）适温延伸适温延伸3高温变性高温变性1低温退火低温退火2重复重复1 1 3 3步步2525 3030轮轮目的目的DNADNA片段片段扩增扩增100100万倍以上万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍DNA
7、DNA变性变性形成形成2 2条单链条单链模板模板DNADNA95.9PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物.10PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物引物1 1引物引物2 2DNADNA引物引物72TaqTaq酶酶TaqTaq酶酶.11PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始.12PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq.13PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束.14PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第第1
8、1轮扩增轮扩增第第2 2轮扩增轮扩增第第3 3轮扩增轮扩增第第4 4轮扩增轮扩增 第5轮扩增第第6 6轮扩增轮扩增理想拷贝数理想拷贝数=2=2n n n n 循环次数循环次数实际拷贝数实际拷贝数=(1+x)=(1+x)n n X X 平均效率平均效率, ,约为约为0.850.85 n n 循环次数循环次数 .15二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤1. 1. 目的基因的获取目的基因的获取 之之 PCRPCR法法特点：特点：u灵敏度高；简便、快速；对标本的纯度要灵敏度高；简便、快速；对标本的纯度要求低；求低；u需要知道目的基因的全部序列或两端序列。需要知道目的基因的全部序列或
9、两端序列。uPCRPCR反应产物的特异性由一对上下游引物反应产物的特异性由一对上下游引物所决定，引物的好坏往往是所决定，引物的好坏往往是PCRPCR成败的关键。成败的关键。.16二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 目的基因的获取目的基因的获取 之之 基因文库分离法基因文库分离法u 基因文库：基因文库：又称又称DNADNA文库，是指某个生物的基因文库，是指某个生物的基因组组DNADNA或或cDNAcDNA片段与适当的载体在体外重组后，转片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落
10、大量的阳性菌落( (或噬菌体或噬菌体) )，所有菌落或噬菌体，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。的集合即为该生物的基因文库。u 根据构建方法或材料来源的不同，基因文库根据构建方法或材料来源的不同，基因文库分为：分为：基因组文库（含有全部基因）基因组文库（含有全部基因）cDNAcDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） .17二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 目的基因的获取目的基因的获取 之之 基因文库分离法基因文库分离法基因文库的构建基因文库的构建.18二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2.
11、 2. 目的基因的获取目的基因的获取 之之 基因文库分离法基因文库分离法 基因特异性：基因特异性：常来自结构基因，因此仅代表某种生物的常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息传信息 时空特异性：时空特异性：不同代谢阶段（或发育阶段）的基因表达不同代谢阶段（或发育阶段）的基因表达谱不相同；不同器官或组织中基因的表达也不相同谱不相同；不同器官或组织中基因的表达也不相同 不均匀性：不均匀性：在同一个在同一个cDNAcDNA文库中，不同类型的文库中，不同类型的cDNAcDNA分子分子的数目是大不相同的的数
12、目是大不相同的 各各cDNAcDNA均可获得表达：均可获得表达：一般选用的载体都是表达型的一般选用的载体都是表达型的cDNAcDNA文库的特点：文库的特点：.19相对于相对于cDNAcDNA文库，基因组文库的优点：文库，基因组文库的优点： cDNAcDNA克隆只能反映着克隆只能反映着mRNAmRNA的分子结构，没有包括基因组的分子结构，没有包括基因组的间隔序列；的间隔序列； cDNAcDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNAmRNA的分的分布状态，即：高丰度布状态，即：高丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，分离基因容易；克隆，分离基因容易
13、；低丰度低丰度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆，分离基因困难；克隆，分离基因困难； 从从cDNAcDNA克隆中，不能克隆到基因组克隆中，不能克隆到基因组DNA DNA 中的非转录区段中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。功能。2. 2. 目的基因的获取目的基因的获取 之之 基因文库分离法基因文库分离法二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤.从基因文库中筛选目的基因探针杂交、PCR检测、酶切检测等方法二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤.21二、重组二、重组DNADNA技术
14、的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 重组重组DNADNA中的常用载体中的常用载体u载体：载体：vectorvector，可供外源，可供外源DNADNA插入并携带重插入并携带重组组DNADNA分子进入适当宿主细胞的分子进入适当宿主细胞的DNADNA分子。分子。具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有较高的外源具有较高的外源DNADNA的载装能力的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的筛选标记具有合适的
15、筛选标记安全，不含有有害基因安全，不含有有害基因.22二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 重组重组DNADNA中的常用载体中的常用载体克隆载体克隆载体转录载体转录载体表达载体表达载体原核载体原核载体真核载体真核载体穿梭载体穿梭载体质粒、噬菌体载体、噬菌粒、黏粒、人质粒、噬菌体载体、噬菌粒、黏粒、人工染色体载体等工染色体载体等.23二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 重组重组DNADNA中的常用载体中的常用载体质粒质粒.pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu
16、 IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 重组重组DNADNA中的常用载体中的常用载体质粒（克隆）质粒（克隆）.25二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 重组重组DNADNA中的常用载体中的常用载体质粒质粒（表达）（表达）.26二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤2. 2. 重组重组DNADNA中的常用载体中的常用载体质粒质粒（穿梭、（穿梭、表达）表达）.27二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目
17、的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接1 1）限制酶）限制酶u由细菌产生、能够识别并切割双链由细菌产生、能够识别并切割双链DNADNA分子中特分子中特定核苷酸序列的核酸内切酶。定核苷酸序列的核酸内切酶。u识别序列：多为识别序列：多为4-8bp4-8bp的回文序列的回文序列u切割产生的末端：粘性末端切割产生的末端：粘性末端 平末端平末端55突出突出33突出突出.28二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接1 1）限制酶）限制酶u同裂酶：来源不同，识别序列相同。同裂酶：来源不同，识别序列相同。 切割方式有同
18、识同切、同识异切切割方式有同识同切、同识异切GGATCCCCTAGGBamH与与 Bst IGGTACCCCATGGGGTACCCCATGGKpnAsp718.29二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接1 1）限制酶）限制酶u同尾酶：来源不同，识别序列不同，但形成的粘同尾酶：来源不同，识别序列不同，但形成的粘性末端相同。性末端相同。Bam HBgl GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A.30二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基
19、本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接2 2）连接酶）连接酶催化两个催化两个DNADNA分子间磷酸二酯键的形成。分子间磷酸二酯键的形成。DNA DNA 连接酶连接酶.31二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接2 2）连接酶）连接酶.32二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接2 2）连接酶）连接酶类型：类型：u大肠杆菌大肠杆菌 DNA DNA 连接酶：黏端连接效率高，平连接酶：黏端连接效率高，平端连接效
20、率极低。端连接效率极低。uT4 DNA T4 DNA 连接酶：既可连接黏端，也可连接平连接酶：既可连接黏端，也可连接平端，但后者连接效率低很多。端，但后者连接效率低很多。.33二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接3 3）连接方式）连接方式 之之 粘末端相连粘末端相连 BamH IEcoR IBamH IEcoR IDNA ligase.34二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接3 3）连接方式之）连接方式之 粘末端相连粘末端相连
21、EcoR IEcoR IEcoR IEcoR IDNA ligase.35二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接3 3）连接方式之）连接方式之 平末端相连平末端相连 u 过程与单一酶切的两个片段的连接相同，但只过程与单一酶切的两个片段的连接相同，但只能用能用T4 DNA ligaseT4 DNA ligaseu 对于一个片段是粘末端，另一个片段是平末端对于一个片段是粘末端，另一个片段是平末端的连接，先将粘末端进行末端修饰（用的连接，先将粘末端进行末端修饰（用Klenow Klenow 聚聚合酶或者合酶或者T4 D
22、NA T4 DNA 聚合酶平端化）后再行连接聚合酶平端化）后再行连接.36二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤3. 3. 目的基因与载体的酶切和连接目的基因与载体的酶切和连接4 4）连接条件）连接条件u温度与时间：温度与时间：1616，12-1612-16小时小时 4 4 ，24-4824-48小时小时u片段与载体比例：粘末端约为片段与载体比例：粘末端约为3:13:1， 平末端适当提高，可至平末端适当提高，可至10:110:1 .37二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤4. 4. 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞1 1）受体）受体 对
23、载体的复制和扩增没有严格的限制对载体的复制和扩增没有严格的限制 不存在特异的内切酶体系降解外源不存在特异的内切酶体系降解外源DNADNA 重组缺陷型，不会产生体内重组重组缺陷型，不会产生体内重组 容易导入重组容易导入重组DNADNA分子分子 符合重组符合重组DNADNA操作的安全标准操作的安全标准分分 原核受体、真核受体原核受体、真核受体.38二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤4. 4. 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞2 2）导入方法）导入方法 之之 原核生物原核生物uCaClCaCl2 2法：法：Ca2+Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶与细菌
24、外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙。空隙。 u电穿孔法：瞬时高电穿孔法：瞬时高压击穿细胞膜，形成压击穿细胞膜，形成微孔，外源微孔，外源DNADNA进入进入细胞。切断电场后，细胞。切断电场后，微孔可自行复原。微孔可自行复原。.39二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤4. 4. 重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞2 2）导入方法）导入方法 之之 真核生物真核生物u酵母：醋酸锂法酵母：醋酸锂法u植物：农杆菌介导法植物：农杆菌介导法u动物：脂质体法、磷酸钙共沉淀法、动物：脂质体法、磷
25、酸钙共沉淀法、显微注射法等显微注射法等.40二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定u转化子转化子就是掺入或导入外源就是掺入或导入外源DNADNA后获得了新的后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。u阳性克隆子或目的重组子阳性克隆子或目的重组子（ positive positive clone clone ）：含有目的基因的重组子。）：含有目的基因的重组子。.41二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定1)1)抗药性筛选抗药性筛
26、选: : 这是利用载体这是利用载体DNADNA分子上的抗分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。药性选择标记进行的筛选方法。.42 2) 2)插入失活筛选法插入失活筛选法 经过上述抗药性经过上述抗药性筛选获得的大量转化筛选获得的大量转化子中既包括需要的重子中既包括需要的重组子，也含有不需要组子，也含有不需要的非重组子。为了进的非重组子。为了进一步筛选出重组子，一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。抗药性进行再次筛选。 二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定.43二、重组二、重组DNADNA技术的
27、基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定3)3)显色反应选择法显色反应选择法(-(-互补法互补法) ) 将含有将含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZLacZ）的调控）的调控序列和氨基端（序列和氨基端（N N端）端）146146个氨基酸编码序列的个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码质粒转化至可编码-半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C C端）端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，产生具有酶学活性的蛋白，从而段实现互补，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有使转化的宿主菌在含有IPTG/X-
28、galIPTG/X-gal的培养基上的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为产生蓝色菌落，这种现象就称为-互补。互补。.44显色反应选择法显色反应选择法(-(-互补法互补法) ).45 4) 4)限制性核酸内切酶分析限制性核酸内切酶分析 当载体与外源基因进行连接时，都需要对其进当载体与外源基因进行连接时，都需要对其进行酶切，而且这些内切酶都是已知的，因此可以行酶切，而且这些内切酶都是已知的，因此可以从初步筛选出来的阳性重组菌中提取质粒从初步筛选出来的阳性重组菌中提取质粒DNADNA，然后用已知的内切酶进行酶切，酶切后进行琼脂然后用已知的内切酶进行酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现与预知的大
29、小一致的电泳糖凝胶电泳，如果出现与预知的大小一致的电泳片段，就证明已经有目的基因插入到载体中。片段，就证明已经有目的基因插入到载体中。二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定.461.1.空质粒（线性化）空质粒（线性化）2.2.重组质粒（线性化）重组质粒（线性化）3.3.重组质粒（双酶切）重组质粒（双酶切）4.4.目的片段（目的片段（PCRPCR产物）产物） M 1 2 3 4 二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定M 1 2M.DNA MarkerM.DNA Ma
30、rker；1.1.重组质粒（双酶切）重组质粒（双酶切）2.2.重组质粒（线性化）重组质粒（线性化）.47二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 5)Southern Blotting 5)Southern Blotting 将转化细胞的将转化细胞的DNADNA经经过酶切后，琼脂糖凝胶过酶切后，琼脂糖凝胶电泳，转移到硝酸纤维电泳，转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；素膜或尼龙膜上； 用目的基因的标记用目的基因的标记探针同固定在膜上的探针同固定在膜上的DNADNA片段杂交，经放射自显片段杂交，经放射自显影或其它显色方法确定影或其它显色方法
31、确定出与探针互补的电泳带。出与探针互补的电泳带。.48 1975 1975年，年，M.GrunsteinM.Grunstein和和D.HosneseD.Hosnese根据检测重根据检测重组子组子DNADNA分子的核酸杂分子的核酸杂交技术原理，对交技术原理，对SouthernSouthern印迹技术作印迹技术作了一些修改，提出了了一些修改，提出了菌落原位杂交技术。菌落原位杂交技术。二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定6 6） 菌落原位杂交法菌落原位杂交法.49二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重
32、组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定 通过对通过对PCRPCR产物产物的电泳分析，确定的电泳分析，确定目的基因是否插入目的基因是否插入到载体中。到载体中。7) PCR7) PCR筛选法筛选法普通普通PCRPCR（质粒为模板）（质粒为模板）菌落菌落PCRPCRM 1 2 3M: DNA MarkerM: DNA Marker1 1：阳性对照：阳性对照2 2：样本：样本3 3：阴性对照：阴性对照.50二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定8) 8) 免疫沉淀筛选法免疫沉淀筛选法在培养基中加入目标蛋白的特异在培养基中加入目标蛋白的特异性
33、抗体性抗体然后涂布转化液然后涂布转化液经培养后，目的重组子菌落会分经培养后，目的重组子菌落会分泌出目标蛋白，与特异性抗体发生泌出目标蛋白，与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色圆斑色圆斑此法简便快速，但灵敏度低，抗此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大。体消耗量大。培养培养.51二、重组二、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤5. 5. 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定9) 9) 核苷酸序列测定法核苷酸序列测定法最终鉴定，精确最终鉴定，精确.52u分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源u大规模生产生物
34、活性物质大规模生产生物活性物质u设计、构建生物的新性状甚至新物种设计、构建生物的新性状甚至新物种三、重组三、重组DNADNA技术的应用技术的应用u分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源u大规模生产生物活性物质大规模生产生物活性物质u设计、构建生物的新性状甚至新物种设计、构建生物的新性状甚至新物种.53对于生物学自身的意义对于生物学自身的意义n 反向遗传学的诞生：表型反向遗传学的诞生：表型 基因型基因型 基因基因 蛋白结构、功能蛋白结构、功能n 分子生物学：基因表达调控、信号传递途径等分子生物学：基因表达调控、信号传递途径等 高等生物发育和分化高等生物发
35、育和分化n 基因组全序列的测定与分析：基因组全序列的测定与分析： X174-DNAX174-DNA全序列测定全序列测定 人类基因组计划人类基因组计划 水稻基因组作图等水稻基因组作图等克隆、突变、克隆、突变、PCR等等.54u分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源u大规模生产生物活性物质大规模生产生物活性物质u设计、构建生物的新性状甚至新物种设计、构建生物的新性状甚至新物种三、重组三、重组DNADNA技术的应用技术的应用.55.56u分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源u大规模生产生物活性物质大规模生产生物活性
36、物质u设计、构建生物的新性状甚至新物种设计、构建生物的新性状甚至新物种三、重组三、重组DNADNA技术的应用技术的应用.57.58 人体必需氨基酸：人体必需氨基酸：甲携来一本亮色书甲携来一本亮色书 甲（甲硫氨酸）、携（缬氨酸）甲（甲硫氨酸）、携（缬氨酸）来（赖氨酸）、一（异亮氨酸）来（赖氨酸）、一（异亮氨酸）本（苯丙氨酸）、亮（亮氨酸）本（苯丙氨酸）、亮（亮氨酸）色（色氨酸）、书（苏氨酸）色（色氨酸）、书（苏氨酸） 豆科种子缺乏含硫氨基酸豆科种子缺乏含硫氨基酸 禾谷类粮食都缺乏赖氨酸禾谷类粮食都缺乏赖氨酸.59转鱼抗寒基因转鱼抗寒基因的番茄的番茄转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
37、.60u氮气约占空气总体积的百分氮气约占空气总体积的百分之八十之八十 u氮又是植物生长的主要肥料氮又是植物生长的主要肥料 u合成铵在高温高压下进行，合成铵在高温高压下进行，转化率也低转化率也低( (仅为仅为220220) ) u根瘤菌可将游离态的氮气转根瘤菌可将游离态的氮气转化为氮肥化为氮肥u山东大学聂延富教授培养出山东大学聂延富教授培养出了世界上第一个人工小麦根了世界上第一个人工小麦根瘤，根瘤内产生接种的细菌瘤，根瘤内产生接种的细菌并显示出固氮活性并显示出固氮活性 .61.62生长快、肉质好的转基因鱼生长快、肉质好的转基因鱼( (中国中国) )乳汁中含有人生长激素的乳汁中含有人生长激素的转基
38、因牛转基因牛( (阿根廷阿根廷) ).63生产基因工程药品生产基因工程药品胰岛素胰岛素 人生长激素人生长激素干扰素干扰素 白细胞介素白细胞介素2 2粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素红细胞生成素EPO EPO 组织纤维溶酶原激活剂组织纤维溶酶原激活剂生长激素生长激素 促生长素促生长素抗血友病因子抗血友病因子 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体.64u许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。来源限制产量有
39、限，其价格往往十分昂贵。u微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。决产量问题，还能大大降低生产成本。.65u胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg100Kg胰腺只能提取胰腺只能提取4-5g4-5g的胰岛素，其的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。产量之低和价格之高可想而知。u将合成的胰岛素基因导入将合成的胰岛素
40、基因导入大肠杆菌，每大肠杆菌，每200L200L培养液就培养液就能产生能产生10g10g胰岛素！使其价胰岛素！使其价格降低了格降低了30%-50%!30%-50%!.66u从人血中提取干扰素，从人血中提取干扰素，300L300L血才提取血才提取1mg1mg！u通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每肠杆菌，每1Kg1Kg的培养液可提取的培养液可提取20-40mg20-40mg干扰素。干扰素。.67u高技术高技术：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透u高投入高投入：在国外，一个生物药品平均要投入：在国外，
41、一个生物药品平均要投入1-31-3亿美元，亿美元，并随着开发难度的增大并随着开发难度的增大, ,有逐步增高的趋势有逐步增高的趋势u长周期长周期：国际上，一个新的生物药品需要：国际上，一个新的生物药品需要6-86-8年时间年时间u高风险高风险: : 一个新药品的开发，经过一系列的程序一个新药品的开发，经过一系列的程序- -研发、研发、中试、动物实验、中试、动物实验、I-IIII-III期临床实验，上市和严格的药期临床实验，上市和严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃u高回报高回报: : 开发成功一个新的生物药品开发成功一个新的生物药品, , 回报
42、很高。如美回报很高。如美国国AmgenAmgen公司，首次开发上市的公司，首次开发上市的EPOEPO、G-SCFG-SCF到到19971997年的年的销售额分别接近和达到销售额分别接近和达到2020亿美元亿美元.68u传统疫苗：传统疫苗：灭活疫苗灭活疫苗减毒活疫苗减毒活疫苗亚单位疫苗亚单位疫苗u基因工程疫苗：基因工程疫苗：亚单位疫苗亚单位疫苗核酸疫苗核酸疫苗基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗转基因可食疫苗等转基因可食疫苗等.69u所谓所谓基因治疗基因治疗是指用基因工程的技术方法，将正常的基因是指用基因工程的技术方法，将正常的基因转入病患者的细胞中，以取代病变基因，从而表达所缺乏转入病患者的细胞中，以
43、取代病变基因，从而表达所缺乏的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达到治疗某些遗传病的目的。到治疗某些遗传病的目的。 u通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一一次性次性”解除病人的疾苦。解除病人的疾苦。u目前，已发现的遗传病有目前，已发现的遗传病有65006500多种，其中由多种，其中由单基因缺陷单基因缺陷引引起的就有约起的就有约30003000多种。遗传病是基因治疗的主要对象。多种。遗传病是基因治疗的主要对象。 .70 利用重组利用重组DNADNA技术培育的技术培育的“指示生
44、物指示生物”能十分灵敏地能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物至还可以吸收和转化污染物基因工程与环境保护基因工程与环境保护.71u通常一种细菌只能分解石油中一种烃类通常一种细菌只能分解石油中一种烃类u基因工程培育成功的基因工程培育成功的“超级细菌超级细菌”却能分解石油中的多种却能分解石油中的多种烃类化合物烃类化合物u有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDTDDT等毒害物质等毒害物质.72u1973 1973 年，年，CohenCohen第一例成功的克隆实验第一
45、例成功的克隆实验u1978 Genentech1978 Genentech公司公司 人胰岛素人胰岛素 世界上第一世界上第一种基因工程蛋白药物种基因工程蛋白药物 u1982 1982 第一个基因工程药物第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、重组人胰岛素在英、美获准使用美获准使用 u1985 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼转基因鱼 u20032003年年4 4月月1414日，美国联邦国家人类基因组研究项日，美国联邦国家人类基因组研究项目负责人宣布，人类基因组序列图绘制成功。目负责人宣布，人类基因组序列图绘制成功。.73有关基因工程安全性
46、的争论有关基因工程安全性的争论携带有具潜在危携带有具潜在危险的克隆基因险的克隆基因有可能逃逸出有可能逃逸出实验室，或成实验室，或成功寄生于工作功寄生于工作者肠道，造成者肠道，造成灾难。灾难。自然界中原核生物自然界中原核生物与动植物尸体与动植物尸体DNADNA密切接触必密切接触必定有机会获得其定有机会获得其DNADNA，但并不能，但并不能在自然选择中取在自然选择中取得优势。得优势。.74u新发展的基因工程技术，为解决一些重要新发展的基因工程技术，为解决一些重要的生物学、医学以及社会问题展现了乐观的生物学、医学以及社会问题展现了乐观的前景。的前景。u重组生物的意外扩散，可能会带来不同程重组生物的意外扩散，可能会带来不同程度的潜在危险。度的潜在危险。u实验必须采取严格的控制条件。实验必须采取严格的控制条件。 物理防护（物理防护（P1P1P4P4）和生物防护（）和生物防护（EK1EK1EK3EK3）统一标准。）统一标准。.75思思 考考 题题1.1.什么是重组什么是重组DNADNA技术？其基本操作流程是技术？其基本操作流程是什么？什么？2.2.举例说明重组举例说明重组DNADNA技术的用途。技术的用途。.
