1、生物分离工程（Bioseparation Engineering)课程主要参考书目课程主要参考书目 生物分离工程 （第二版） 孙彦编著 Bioseparation Process Science Antonio A. Garca et al编著编著成绩构成 平时成绩：30分 课堂测验、作业、出勤情况 期末考试：闭卷考试，70分32 学时学时 绪论绪论 2 2学时学时 细胞分离与破碎细胞分离与破碎 2 2学时学时 初级分离初级分离 2 2学时学时 膜分离技术膜分离技术 6 6学时学时 生物产品萃取技术生物产品萃取技术 8 8学时学时 色层分离技术色层分离技术 1010学时学时 蛋白质复性蛋白质复
2、性 2 2学时学时 沉淀与结晶沉淀与结晶 2 2学时学时第一章 绪 论 重要性重要性 生物分离过程生物分离过程 特点特点 一般步骤一般步骤 工业生物分离过程工业生物分离过程 典型的生物分离过程典型的生物分离过程过程的选择依据过程的选择依据生物分离工程的概念生物分离工程: 从粗原料中获得合乎使用要求的目标产 物的过程，包括目标产物的提取、浓 缩 、分离纯化及成品化等。多学科的交叉多学科的交叉 多种分离技术的集成多种分离技术的集成 生物工程生物工程科学研究的科学研究的 （Engineering) 合乎使合乎使用用最新成果最新成果 要求的要求的产品产品(Science) (Product) Upst
3、ream Technology Downstream ProcessingGeneticEngineeringBioreaction EngineeringBioseparation Engineeringl在基础研究领域， 生物分离技术的发展在某种程度上决定人类对生命、对自然的认知程度；l在工业生物技术领域，决定了生物产业的成本和经济效益。 生物工程的基本过程生物工程的基本过程生产生产生产生产生物分离过程决定了生物产业的经济效益生物分离过程决定了生物产业的经济效益 大多数酶：大多数酶：7070 医用酶如天门冬酰胺酶：医用酶如天门冬酰胺酶：8585 基因工程表达产物：基因工程表达产物：8585
4、一一9090以上以上 青霉素：青霉素：5050 乙醇：乙醇：1414传统产品传统产品 小分子（少数工业用粗酶）小分子（少数工业用粗酶） 理化性质清楚理化性质清楚 易于放大易于放大基因产品基因产品 大分子大分子 胞内胞内 不稳定不稳定 放大困难放大困难 生物分离过程的特点生物分离过程的特点u 目标产物含量低目标产物含量低 u 待分离物组成复杂待分离物组成复杂u 稳定性差，容易失活稳定性差，容易失活u 对最终产品的质量要求严格对最终产品的质量要求严格 发酵液中：青霉素发酵液中：青霉素 4.2% 庆大霉素庆大霉素 0.2% 动物细胞培养液：动物细胞培养液： 目标物含量目标物含量 5 50 g/mlB
5、ack细胞组成（占干重百分比）类 型 蛋白质 % 核 酸 % 多 糖 % 类脂物 %细 菌 40-70 13-34 2-10 10-15酵 母 40-50 4-10 小于15 1-6丝状真菌 10-15 1-3 小于10 2-9藻 类 10-60 1-5 小于15 4-80动物细胞 小于10 小于50 小于50 小于50植物细胞 小于70 小于30 小于50 小于80Back 产物失活的主要机制是化学降解或微生物产物失活的主要机制是化学降解或微生物引起的降解。引起的降解。 影响因素包括：影响因素包括： pH温度温度浓度浓度蛋白水解酶等蛋白水解酶等 要求：分离条件温和，并采用快速的分离纯化要求：
6、分离条件温和，并采用快速的分离纯化 方法除去影响目标产物稳定性的杂质。方法除去影响目标产物稳定性的杂质。Back 目前对医药、生物制剂的要求：无菌、无目前对医药、生物制剂的要求：无菌、无热源，对于蛋白类药物，一般要求杂蛋白含量热源，对于蛋白类药物，一般要求杂蛋白含量 2%。 例如：例如： 对医用青霉素，噻唑蛋白类的含量必须要对医用青霉素，噻唑蛋白类的含量必须要 1.5 10-6； 原亲酶素和重组胰岛素，杂蛋白含量应原亲酶素和重组胰岛素，杂蛋白含量应 0.01%。 对有些产品还要求呈稳定的无色晶体对有些产品还要求呈稳定的无色晶体 u 高效生物分离技术缺乏高效生物分离技术缺乏u目标产物的回收率低目
7、标产物的回收率低u 分离的成本高分离的成本高生物分离过程中存在的主要问题生物分离的一般步骤 破碎、萃取破碎、萃取 沉淀、吸附沉淀、吸附 层析、色谱层析、色谱 超滤、冷冻干燥超滤、冷冻干燥 离心、过滤离心、过滤 萃取、超滤萃取、超滤 电泳电泳 喷雾干燥、结晶喷雾干燥、结晶粗提粗提初分离初分离精分离精分离成品化成品化目标产物回收率的计算每步的回收率： Yi = mi2 / mi1mi2 第i步分离后得到产品的总量， mi1 第i步分离前产品的总量总回收率： iiTYY分离原则 提高每步操作的回收率 减少操作步骤 对分离技术及设备进行系统研究，努力开发新型高效的分离纯化方法是实现降低目标产物的成本、
8、提高经济效益的必由之路。例如：对人干扰素的分离 总回收率：16%离子交换离子交换（62.7%)62.7%)硫酸盐盐析硫酸盐盐析(96.2%)(96.2%)铜亲合层析铜亲合层析(46.0%)(46.0%)疏水层析疏水层析（78.3%)78.3%)凝胶电泳凝胶电泳(88.9%)(88.9%) 仅三步产品的回收率就达到仅三步产品的回收率就达到81%，且产品的，且产品的纯纯化程度与上述纯化过程相当。化程度与上述纯化过程相当。 分离路径的选择非常重要！分离路径的选择非常重要！硫酸盐盐析硫酸盐盐析免疫亲合层析免疫亲合层析阳离子交换层析阳离子交换层析如何进行分离方法的选择？方法：方法：1 寻找差异 u物理性
9、质：重力，分子大小，溶解度u化学性质：分子的亲疏水特性及其所带电荷性质的差异u生物学性质：生物分子间的特异性识别作用 性质上最大的差异将导致最有效的分离性质上最大的差异将导致最有效的分离2 对于生物活性物质，必须考虑分离方法对其生物活性的影响生物分离产品的类型：小分子类小分子类：MWMW 10001000MW 1000，酶、抗体、重组蛋白、，酶、抗体、重组蛋白、 核酸等核酸等. .利用分子间相互作用力的差异实现分离l利用生物分子的化学和生物学性质的差异l沉淀、萃取、吸附、色谱等利用分子间物性上的差异实现分离l如分子量、沉降系数、挥发度等l膜过滤、凝胶筛分、电泳、离心、蒸馏等生物分离方法及分离机
10、理 单单 元元 操操 作作 分分 离离 机机 理理 分分 离离 对对 象象 举举 例例膜分离膜分离 微滤微滤 压力差、拆分压力差、拆分 菌体、细胞菌体、细胞 超滤超滤 压力差、筛分压力差、筛分 蛋白质、多糖、抗生素蛋白质、多糖、抗生素 反渗透反渗透 压力差、筛分压力差、筛分 水、盐、糖、氨基酸水、盐、糖、氨基酸 透析透析 浓度差、筛分浓度差、筛分 尿素、盐、蛋白质尿素、盐、蛋白质 电渗析电渗析 电荷、筛分电荷、筛分 氨基酸、有机酸、盐、水氨基酸、有机酸、盐、水 渗透汽化渗透汽化 汽液相平衡汽液相平衡 乙醇乙醇萃取萃取 有机溶剂萃取有机溶剂萃取 液液相平衡液液相平衡 有机酸、抗生素有机酸、抗生素
11、 双水相萃取液液相平衡双水相萃取液液相平衡 液液相平衡液液相平衡 蛋白质、抗生素蛋白质、抗生素 液膜萃取液膜萃取 液液相平衡液液相平衡 氨基酸、有机酸、抗生素氨基酸、有机酸、抗生素 反胶团萃取相平衡反胶团萃取相平衡 液液相平衡液液相平衡 氨基酸、抗生素氨基酸、抗生素 超临界流体萃取超临界流体萃取 相平衡相平衡 香料、脂质香料、脂质层析层析 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 浓度差、筛分浓度差、筛分 脱盐、分子分级脱盐、分子分级 反相层析反相层析 分配平衡分配平衡 甾醇类、维生素、脂质、肽甾醇类、维生素、脂质、肽 离子交换层析离子交换层析 电荷、浓度差（电荷、浓度差（pHpH、 蛋白质、氨基酸、抗生素、
12、蛋白质、氨基酸、抗生素、 离子强度）离子强度） 核酸、有机酸核酸、有机酸 亲和层析亲和层析 生物亲和作用生物亲和作用 蛋白质、核酸蛋白质、核酸 疏水相互作用疏水相互作用 疏水作用疏水作用 蛋白质蛋白质 层析聚焦层析聚焦 电荷、浓度差（电荷、浓度差（pHpH） 蛋白质蛋白质电泳电泳 凝胶电泳凝胶电泳 筛分、电荷筛分、电荷 蛋白质、核酸蛋白质、核酸 等电点电泳等电点电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸 等速电泳等速电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸 区带电泳区带电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸蛋白质、
13、核酸离心离心 离心过滤离心过滤 离心力、筛分离心力、筛分 菌体、菌体碎片菌体、菌体碎片 离心沉降离心沉降 离心力离心力 菌体、细胞、血球菌体、细胞、血球 超离心超离心 离心力离心力 蛋白质、核酸、糖类蛋白质、核酸、糖类了解分离产物的物性对分离过程的设计是必需的u溶解度溶解度：受受 pHpH、盐等影响，将指导沉淀过程或、盐等影响，将指导沉淀过程或 萃取过程萃取过程u分子电荷分子电荷：将指导如何有效地进行离子交换等将指导如何有效地进行离子交换等u分子大小分子大小：指导凝胶过滤和膜过滤指导凝胶过滤和膜过滤u疏水性疏水性：指导沉淀过程和疏水分离指导沉淀过程和疏水分离u功能团功能团：功能团为稳定条件、提
14、取剂及亲和吸功能团为稳定条件、提取剂及亲和吸 附剂的选择提供依据附剂的选择提供依据u稳定性稳定性：适宜的适宜的pHpH值范围、温度范围、半衰期值范围、温度范围、半衰期u挥发性挥发性：是小分子物质选择分离过程的依据是小分子物质选择分离过程的依据生物物质常用的分离方法生物物质常用的分离方法1 1氨基酸氨基酸： 两性电解质，具有等电点，溶解度受溶两性电解质，具有等电点，溶解度受溶液液pHpH影响显著的特点。影响显著的特点。 常采用的分离纯化方法常采用的分离纯化方法 结晶结晶离子交换离子交换2 2蛋白质和多肽蛋白质和多肽： 特点：两性电解质，具有带电性、疏水性特点：两性电解质，具有带电性、疏水性 和生
15、物亲和性，分子量差异较大。和生物亲和性，分子量差异较大。 常用的分析方法：常用的分析方法： 离心离心 沉淀沉淀 膜分离膜分离 萃取：双水相萃取、反胶团萃取萃取：双水相萃取、反胶团萃取 层析层析 电泳等电泳等 3 3、糖类、糖类： 单糖、低聚糖、多糖单糖、低聚糖、多糖 分离纯化方法以吸附层析为主4、脂质脂质： 脂肪酸、不饱和脂肪酸、卵磷脂等。 分离纯化方法： 有机溶剂萃取 超临界流体萃取 层析等方法5 5抗生素抗生素： 分离纯化主要采用： 有机溶剂萃取 离子交换 结晶 吸附层折6 6其他其他 天然植物及中药中的药用成分。 分离纯化： 萃取：溶剂萃取和超临界萃取 吸附层析等工业生物分离过程选择的依
16、据 对于生物产品，消费者更看重的是产品的价格、质量和实用性。所以，工业生物分离过程选择的标准应该是以获得高质量、低价格的产品为目标。影响产品成本的除了分离步骤和效率外，还有一个重要的因素就是产品的浓度。 根据热力学第二定律，混合过程熵增大，是自发过程。所以，两种互溶的物质相互混合时，不需要外界能量。但是，要使混合的物质得到分离，必须补充使熵减小所需的能量。在恒温条件下使混合物中的各组分提纯为纯粹的物质所需的最小功 与吉布斯自由能变化 相等，即在稀溶液中： 即得到单位质量物质 所需的能耗与 成正比。所以，原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离回收的成本越大。 minWGiiiixRTxGWl
17、nminiiixRTxWlnmin,i)/1ln(ix采取的方法：1）增加产品在发酵液或细胞内的浓度；2）将浓缩过程尽可能地放在分离的最初阶 段。 分离效率的评价分离效率的评价评价一个分离过程对目标产物的分离效率主要有下面三个标准：浓缩率浓缩率 m（concentration factor)： 表征以浓缩为目的的分离过程的最重要指标分离因子分离因子 （separation factor or purification factor) 表征目标产物的分离纯化程度的重要指标回收率回收率 R (recovery factor) FC FP 原料 产品 CTC，CXC CTP，CXP FW CTW，C
18、XW 废料 其中，F表示流速，C表示浓度，下标T和X分别表示目标产物和杂质，C、P和W分别表示原料、产品和废料。浓缩率 mT = CTP/CTC mX = CXP/CXC如果 mT = mX ，则目标产物未得到分离纯化分离器分离因子 =分离因子越大，分离效率越高回收率R R = 100% = 100%TCTPCVCVcpxmmTTCTPCFCFcp工业生物分离过程举例1 单克隆抗体的生产（monoclonal antibodies)用途：临床治疗、检测及实验研究生产规模： 1m3/day，小规模批量生产，属于高附加值 产品，反应器的体积一般为35L左右。类型：IgG：分子量160,000Da，
19、能够分泌到胞外； IgM：分子量是IgG的5倍，存在于细胞膜表面。生产的方式：杂交瘤细胞生产的融合蛋白（血清培养）. IgG product Cells Supernatant IgG eluted Unbound material 单克隆抗体的回收和纯化（单克隆抗体的回收和纯化（John Wiley 等，等，1995）Bioreactor fluidwith cellContinuouscentrifugation100,000MWmembraneAffinitychromatograph Sterile filtrationFormulationMembraneconcentration2
20、. 人胰岛素人胰岛素（human insulin)生产方式：基因工程 E.coli；以包含体的形式存在于胞内； 细胞培养产生的是胰岛素前体，需进一步进行 化学转化为胰岛素含量：小于1g/L（相当低）；用途：临床注射用，要求的纯度相当高；3. 狂犬病疫苗（狂犬病疫苗（Rabies vaccine) 病毒性疫苗的生产一般是在动物体内、单层培养或悬浮培养，在病毒溶解细胞后在将其收集。生产方式：使用猿猴细胞作为微载体悬浮培养，反应体积 上百立升。动物细胞被固定在珠状的微载体上。 病毒（0.3m)首先感染细胞并在其内复制。其 后被收集分离。 Product Product B-chainCell deb
21、ris A-chain SupernatantCyanogen 人胰岛素的回收和纯化人胰岛素的回收和纯化Bromide （San Diego等，等，1998）Bioreactor fluidwith cellsPrecipitationChromatography阴离子、体积排阻阴离子、体积排阻Cell disruptionCentrifugal extractionDialysisCleaningpro insulinPrecipitationpH=5.0Chromatography弱阴、反向弱阴、反向HPLCExtractionSulfonationDialysis狂犬疫苗的下游分离过程狂
22、犬疫苗的下游分离过程 （John Wiley等等, 1994) Cells Permeate Concentrated virus -Propiolactone 丙酸内脂丙酸内脂 4 C 37 C HSA Nonantigenic material ProductBioreactor fluidwith cellsMembraneUF membrane10-100kDaVirusinactivationHydrolysis(24 hr)Zonal(蔗糖）蔗糖）Centrifugation 除菌除菌青霉素（青霉素（penicillin)：用青霉菌生产，主要提取步骤为萃 取。蛋白酶（蛋白酶（pro
23、tease)用途：洗涤剂，所以对纯度要求不高目的：高浓度、高产率，而非高纯度L-赖氨酸（赖氨酸（L-lysine) 可用于动物和人使用，不同用途，不同的纯化方式。主要分离方式为吸附。柠檬酸（柠檬酸（citric acid) 由Aspergillus niger（曲霉）生产，酸性菌，在低pH值下生长。主要分离方式为萃取（用煤油和叔氨）。青霉素的分离及纯化（青霉素的分离及纯化（Macmillan,1983) Product CaCl andPolyelectrolyte T=5 C Spent solvent Filtrate Spent IsopropanolAmyl acetate solve
24、nt or butanol乙酸戊酯乙酸戊酯 Extract Spent solvent Acetone and water andCarbon and sodium or Impurities potassium acetate Bioreactor fluidwith cellsFiltrationExtractionspH 2-3Activated carbontreatmentFiltrationDryingFiltrationWashingFiltrationPrecipitation 蛋白酶的分离纯化蛋白酶的分离纯化 （Shuler ML等等, 1992) Solid Product
25、 Cool to 4-5 CFilter aid Liquid ProductCellsPrecoatBioreactor fluidpretreatmentFiltration orcentrifugationTwo-stageultrafiltrationUltrafiltrationSterileultrafiltrationPolishingultrafiltrationFormulationFormulationDryingRotary filterPrecipitationLiquids or solids赖氨酸的回收和分离（赖氨酸的回收和分离（Marcel Dekker, 199
26、6) 柠檬酸的下游分离（柠檬酸的下游分离（BanidBanid AM AM等，等，19811981）小 结在工业生物分离纯化中作为设计者应关注在工业生物分离纯化中作为设计者应关注的关键问题的关键问题：高收率，降低总成本（也要考虑环境成本）；高的可靠性和重复性：保证产品质量的稳定。 应遵循的分离原则提高每步操作的回收率减少操作步骤将减小体积，增加目标物的浓度放在分离之初首先分离最易除去的物质在分离过程中尽早采用具有高分辨率的分离步骤将最困难的分离留在整个工艺过程的最后分离条件应保证产物的稳定性和活性缩短分离时间以减小产物分解，提高活性思考题思考题在工业上，欲分离纯化某种胞内蛋白，请谈谈在工业上，欲分离纯化某种胞内蛋白，请谈谈你对其分离纯化路径的设计思路以及在分离过你对其分离纯化路径的设计思路以及在分离过程中应注意的问题。程中应注意的问题。为什么在成品化的前一步要进行产品的浓缩为什么在成品化的前一步要进行产品的浓缩? ?请阐述各项生物分离原则的理论依据。请阐述各项生物分离原则的理论依据。作作 业业 查找资料，提交一份生物产品分离纯化的具体查找资料，提交一份生物产品分离纯化的具体工艺。工艺。
