1、细胞凋亡细胞凋亡outline1.细胞凋亡简介细胞凋亡简介 2.细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法3.死亡受体通路死亡受体通路4.线粒体通路线粒体通路细胞凋亡简介细胞凋亡简介细胞凋亡细胞凋亡u细胞凋亡的概念细胞凋亡的概念u细胞凋亡的生物学意义细胞凋亡的生物学意义u细胞凋亡的形态及生化变化细胞凋亡的形态及生化变化u细胞凋亡的分子机制细胞凋亡的分子机制u细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病u细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡的概念和特征一、细胞凋亡的概念和特征1.什么是细胞凋亡？什么是细胞凋亡？ Apoptosis的概念来自于希腊语，原意是指树叶或花瓣的脱落、凋零，而细胞发生凋亡时，就像树叶或
2、花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，不影响其他细胞的正常功能。 其生物学意义在于强调这种细胞的死亡方式是自然的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。 一、细胞凋亡的概念一、细胞凋亡的概念2.细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程 1.凋亡的起始：细胞表面特化结构消失、核糖体逐渐与内质网脱离、染色质固缩 2.凋亡小体的形成：和染色质断裂成片段，被反折的细胞质膜包围，形成凋亡小体 3.凋亡小体被吞噬，凋亡细胞的残余物质被消化后重新利用 细胞凋亡过程中，细胞质膜始终保持完整，细胞内含物不发生细胞外泄露，不引发机体的炎症反应。一、细胞凋亡的概念一、细胞凋亡的概念3. 细胞凋亡与细胞坏
3、死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞坏死（细胞坏死（necrosis）：细胞受到剧烈的物理）：细胞受到剧烈的物理、化学刺激或严重的病理性刺激后，引起、化学刺激或严重的病理性刺激后，引起的细胞死亡。的细胞死亡。细胞凋亡是细胞凋亡是“主动的自杀主动的自杀”行为，而细胞坏死行为，而细胞坏死是是“被动的自杀被动的自杀”行为！行为！细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡与细胞坏死的区别特点细胞凋亡细胞坏死形态学方面： 细胞体积萎缩，与周围细胞分离肿胀 细胞膜膜发泡，通透性正常，PS外翻完整性破坏，通透性增加 细胞器完整损伤 细胞核先固缩，后降解溶解 溶酶体完整裂解 线粒体浓缩，跨膜电位受损，cytoC释放肿胀
4、，破坏，能量生成受损生物化学方面： DNA核小体间剪切非特征性剪切 蛋白质Caspase活化非特征性降解 组织分布单个细胞细胞群体 结局被吞噬细胞吞噬，不引起炎症反应释放细胞碎片，引起炎症反应二、细胞凋亡的生物学意义二、细胞凋亡的生物学意义-细胞凋亡现象普遍存在于人类和多种细胞凋亡现象普遍存在于人类和多种动植物种，是多细胞生物体个体正常发育动植物种，是多细胞生物体个体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯穿于生物全部的生命活动中。穿于生物全部的生命活动中。1. 生理状态下的细胞凋亡生理状态下的细胞凋亡2. 病理状态下的细胞凋亡病理状态下的细胞凋亡1.1
5、 在发育过程中清除多余的细胞在发育过程中清除多余的细胞手指的形成手指的形成1.2 清除已经完成功能的细胞清除已经完成功能的细胞蝌蚪发育成蛙蝌蚪发育成蛙1.3 清除发育不正常的细胞清除发育不正常的细胞神经细胞体神经细胞体神经细胞轴突神经细胞轴突靶细胞靶细胞靶细胞释放靶细胞释放的生长因子的生长因子凋亡的神经细胞凋亡的神经细胞二、细胞凋亡的生物学意义二、细胞凋亡的生物学意义2. 病理状态下的细胞凋亡病理状态下的细胞凋亡lDNA损伤：射线、细胞毒抗癌药等；损伤：射线、细胞毒抗癌药等；l错误折叠蛋白的积累：内质网胁迫；错误折叠蛋白的积累：内质网胁迫；l病毒感染：病毒感染：HIV；l唾液管阻塞导致实质器官
6、萎缩：胰腺、肾等唾液管阻塞导致实质器官萎缩：胰腺、肾等。三、三、细胞凋亡的形态及生化变化细胞凋亡的形态及生化变化1.1.形态学特征形态学特征： 胞膜完整，外形发泡状，胞质浓缩，细胞器紧聚。染色体紧缩呈月牙状，凝聚在核膜周围。形成膜包的凋亡小体(apoptotic body)，被附近的细胞或巨噬细胞(M)吞噬消化清除。细胞凋亡可发生在正常细胞群中的单个细胞。2.2.生化特征生化特征：胞浆内Ca2+浓度升高。细胞内活性氧增多。质膜通透性变大。DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段。型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）、半胱天冬蛋白酶（casp
7、ases）活性升高。磷脂酰丝氨酸（PS）外翻。四、四、细胞凋亡的分子机制细胞凋亡的分子机制细胞凋亡的起始阶段由两条信号通路介导：细胞凋亡的起始阶段由两条信号通路介导：l内源性（线粒体）凋亡通路内源性（线粒体）凋亡通路The Intrinsic (Mitochondrial) Pathway of Apoptosisl外源性（死亡受体）凋亡通路外源性（死亡受体）凋亡通路The Extrinsic (Death Receptor-Initiated) Pathway of Apoptosis 五、五、细胞凋亡与疾病细胞凋亡与疾病细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种生理机细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种
8、生理机制。机体通过细胞凋亡清除损伤、衰老与突变的制。机体通过细胞凋亡清除损伤、衰老与突变的细胞，维持生理平衡。某些致病因子可使细胞凋细胞，维持生理平衡。某些致病因子可使细胞凋亡的基因调控失常，致使细胞凋亡减弱或增强，亡的基因调控失常，致使细胞凋亡减弱或增强，从而破坏了机体细胞的自稳态，最终导致各种疾从而破坏了机体细胞的自稳态，最终导致各种疾病的发生。病的发生。u凋亡过低凋亡过低导致相关疾病的发生：肿瘤、系统性导致相关疾病的发生：肿瘤、系统性红斑狼疮等。红斑狼疮等。u凋亡过度凋亡过度导致机体免疫功能丧失或引发相关的导致机体免疫功能丧失或引发相关的疾病：神经退行性疾病、疾病：神经退行性疾病、AID
9、S病和心血管病等。病和心血管病等。肿瘤的发生肿瘤的发生环境中的环境中的DNA损伤物质损伤物质正常细胞正常细胞癌基因癌基因活化活化抑癌基抑癌基因失活因失活凋亡相关凋亡相关基因改变基因改变增殖失调增殖失调凋亡减少凋亡减少肿瘤发生肿瘤发生六、细胞凋亡的检测方法六、细胞凋亡的检测方法检测细胞凋亡的方法很多，可归纳为三类：检测细胞凋亡的方法很多，可归纳为三类：（一）形态学方法（一）形态学方法（二）生化特征检测（二）生化特征检测（三）流式细胞仪检测（三）流式细胞仪检测细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法 细胞凋亡的生物学特征细胞凋亡的生物学特征 1形态学变化 形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉
10、及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。细胞凋亡的形态学检测细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1 光学显微镜和倒置显微镜（1） 未染色细
11、胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与D
12、NA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为25mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。3 透射电子显微镜观察透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期（期（pro-
13、apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构的空泡结构(图图2)；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)
14、。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 三、线粒体膜势能的检测三、线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡
15、刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增
16、强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。注意事项1 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。2 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。 2生物化学变化（1）DNA的片段化 细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约
17、为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段。 实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。 2） 大分子合成 细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。 四、四、DNA片断化检测片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处
18、断裂, 形成50300kbp长的DNA大片段, 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。 方法：细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。 2 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析方法：收集细胞，70%冷乙醇（in PBS）4C固定过夜，PBS洗涤，1000rpm10min RNase A
19、（0.5mg/ml）37C消化30min PI（50mg/ml）染色，室温避光15min，FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。 五五、Caspase-3活性的检测活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下
20、降。 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等的裂解。方法：收集细胞PBS洗涤抽提细胞裂解液蛋白定量SDS-PAGE电泳硝酸纤维素膜或PVDF膜转移5%脱脂奶粉封闭，室温1.52h或4C过夜Caspase-3多抗或单抗室温反应12h或4C过夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应12h TBS-T洗3次， 510min/次?ECL显影或NBT/BCIP显
21、色。 荧光分光光度计分析原理： 活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS洗涤，制备细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）?37C反应1h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-4
22、60nm）。 六六、凋亡相关蛋白、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和蛋白的表达和细胞定位分析细胞定位分析TFAR19（PDCD5）是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞
23、凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。死亡受体通路死亡受体通路细胞凋亡细胞凋亡1.通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspases的细胞凋亡通路,称为死亡受体通路。2. 参与基因包括肿瘤坏死因子TNF-、白细胞介素（IL） 、造血集落刺激因子及某些激素类、腺苷酸类似物等。3.最终激活凋亡酶caspases导致细胞凋亡。1.当Fas被激活后， Fas间因为DD的趋同性而聚集成三聚体，FADD一方面可以结合在三聚体的DD上，另一方面又可以在DED的趋同性作用下和TNFR1及caspase8结合在一起，活化的caspase8再激活下游的c
24、aspase，完成级联反应，通过水解作用使细胞蛋白大量解体，启动细胞凋亡。2. TNF-可通过激活Fas或TNFR1，使细胞产生活性氧中间产物（ROI，过氧化氢，氨基化合物等）， ROI含量过高直接使DNA发生断裂，促进NF-k的活化，启动死亡基因的表达。1.糖皮质激素可以是细胞内钙离子浓度升高，激活钙离子或镁离子依赖性核酸酶，使核小体连接部分的DNA发生断裂。2.升高的钙离子浓度也能激活谷氨酰胺转移酶，促进细胞质蛋白与细胞膜蛋白间的交联，增强包膜的抗溶解能力，使细胞膜完整性得以维持，因此也没有发生炎症反应。（一（一) )凋亡细胞的特征性表现：凋亡细胞的特征性表现：包括包括DNADNA裂解为裂
25、解为200bp200bp左右的片段，染色质浓缩，左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，凋亡小体。细胞膜活化，细胞皱缩，凋亡小体。 激活蛋白激酶激活蛋白激酶 破坏细胞结构破坏细胞结构 影响核酸的结构与功能影响核酸的结构与功能 ( (二）破坏细胞抗凋亡因素二）破坏细胞抗凋亡因素（1）激活蛋白激酶）激活蛋白激酶： including FAK, PKC , and Raf1. FAK disrupt cell adhesion for the apoptotic cell.（2）破坏细胞结构）破坏细胞结构actin, and gelsilin. Cleavage and inactivatio
26、n of these proteins lead to changes in cell shape. CaspaseCaspase的效应机制的效应机制死亡受体死亡受体配体配体/受体结合受体结合起始者起始者caspase-8自激活自激活执行者执行者caspase激活激活凋亡凋亡细胞凋亡线粒体通路细胞凋亡线粒体通路一段视频Apoptosis and Signal Transduction - DnaTubecom http:/ 线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成ATP的主要地点。 线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH。NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化。与此同时，导致跨膜
27、质子移位形成跨膜质子梯度和/或跨膜电位。 线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜质子梯度能量合成ATP。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。线粒体跨膜电位线粒体跨膜电位 近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散，会使细胞进入不可逆的凋亡过程。 线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了通透性转变孔道（PT孔道），PT孔道是由多个蛋白质组成的，位于线粒体内膜与外膜接触位点。PT孔道的性质孔道的性质线粒体内膜通透性转变既是细胞凋亡的必须条件，也是它的充足条件。PT孔道打开后导致线粒体许多功能的致命性变化从而启动了
28、死亡途径。PT孔道作为许多生理效应的感受器（二价阳离子、ATP、ADP、NAD、m、pH、巯基与多肽），整合了电生理、氧化还原与细胞代谢状态的信息。PT孔道的组成成分ADP-ATP载体是能量代谢的重要分子，由于ADP-ATP载体是由一个基因家族的几个成员所编码，它的表达有严格的组织专一性。因此，PT孔道在不同细胞中的调节可能稍有不同。PT孔道的作用有自放大的效应。PT会有正反馈， 从而在细胞凋亡中有自摧毁的作用。启动线粒体启动线粒体凋亡途径凋亡途径BAX蛋白移位到线粒体外膜并多聚化刺激线粒体通透性转变释放细胞色素C(Cyt C) 释放smac, DiabloCyt C结合APAF-1, 形成多
29、聚体激活Caspase9，形成凋亡小体激活Caspase3，等抑制IAP保持Caspase9的活性释放凋亡诱导因子AIF促进细胞凋亡细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C释放和凋亡小体的形成。因此，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid - 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。
