1、生物分离工程生物分离工程初级分离技术初级分离技术总体学习目的和要求总体学习目的和要求 了解蛋白质表面特性，掌握各种了解蛋白质表面特性，掌握各种沉淀和泡沫分离的原理、特点以沉淀和泡沫分离的原理、特点以及应用范围及应用范围。 目录目录n引言引言n沉淀分离沉淀分离n蛋白质表面特性蛋白质表面特性n盐析沉淀盐析沉淀n等电点沉淀等电点沉淀n有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀n热沉淀热沉淀n其他沉淀法其他沉淀法n沉淀生成动力学沉淀生成动力学n泡沫分离泡沫分离引言学习要点引言学习要点n识记：初级分离概念n理解：初级分离特点 初级分离概念初级分离概念初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞初级分离是指从发酵液、细胞培养液、胞
2、内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离浓缩和初步分离的下游加工过程。的下游加工过程。 初级分离特点初级分离特点n分离对象分离对象：体积大、杂质含量高；：体积大、杂质含量高；n分离技术分离技术：低操作成本、适于大规模生产：低操作成本、适于大规模生产沉淀分离学习要点n识记识记：盐析和盐溶概念：盐析和盐溶概念n理解理解：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉：蛋白质凝集沉淀的屏障，各种沉 淀方法的原理和影响因素淀方法的原理和影响因素n应用应用：采用不同的试剂方法实现蛋白质：采用不同的试剂方法
3、实现蛋白质 的沉淀的沉淀 沉淀的定义沉淀的定义 由于物理环境的变化而引起由于物理环境的变化而引起溶质溶解度的降低、生成固体凝溶质溶解度的降低、生成固体凝聚物的现象，称为聚物的现象，称为沉淀沉淀。 沉淀与结晶的区别沉淀与结晶的区别n沉淀生成的固体颗粒是沉淀生成的固体颗粒是不定形不定形的的n结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则结晶产品为单一组分，而沉淀凝聚物则成分非常复杂成分非常复杂（除了目标产物外，还夹（除了目标产物外，还夹杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等）杂着多种共存的杂质、盐和溶剂等） n沉淀的沉淀的纯度纯度远低于结晶远低于结晶 n多步沉淀操作也可获得高纯度的目标产多步沉淀操作也可获得高纯度的目
4、标产品品 沉淀技术适用范围沉淀技术适用范围 沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为程中通常作为初级分离技术初级分离技术加以使用，但在实加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的工业实例。工业实例。蛋白质表面特性蛋白质组成蛋白质表面特性蛋白质组成蛋白质组成蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸氨基酸和亲水性氨基酸蛋白质折叠趋势蛋白质折
5、叠趋势疏水性氨基酸：疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势分布于蛋白质外表面的趋势 结果结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区 胶体的定义胶体的定义n胶体是一种尺寸在1100 nm以至1000 nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。 -被遗忘了尺寸的世界Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 1932) 胶体的性质胶体的性质n比表
6、面增大，界面现象重要 n强烈的尺寸效应蛋白质表面特性蛋白质性质蛋白质表面特性蛋白质性质n蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质的分子量约蛋白质的分子量约61000 kDa，分子直径约为，分子直径约为130 nm。在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液在此粒径范围内，蛋白质可视为胶体，并表现出胶体溶液的部分性质的部分性质n蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质两端及侧链中有一些解离基蛋白质两端及侧链中有一些解离基 ，解离程度受，解离程度受pH影响。影响。n蛋白质的变性蛋白质的变性 物理因素：物理因素：加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、加热、加压、脱水、搅拌
7、、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；超声波的作用等； 化学因素：化学因素：有强酸、强碱、尿素、重金属盐、有强酸、强碱、尿素、重金属盐、SDS等。等。 蛋白质表面特性沉淀屏障蛋白质表面特性沉淀屏障n蛋白质分子周围的水化层蛋白质分子周围的水化层 水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层水溶液中蛋白质可视为胶粒，其周围存在着稳定的水化层 胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为胶粒外的这部分水客观上起排斥作用，称为“水化层斥力水化层斥力” n分子间的静电排斥作用分子间的静电排斥作用 根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反根据扩散双电层理论，胶粒是带电的，其表面吸附相反电荷的反离子，
8、这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四电荷的反离子，这些位于胶粒周围过量的反离子好像胶粒四周为离子氛所包围。当两个胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛周为离子氛所包围。当两个胶粒（蛋白质）趋近而使离子氛发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了发生重叠时，处于重叠区内的反离子浓度较大，从而破坏了原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从原有电荷的对称性，引起离子氛中电荷重新分布，即离子从浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶浓度较大的重叠区向未重叠区扩散。这种扩散的结果就是胶粒受到斥力而相互脱离。粒受到斥力而相互脱离。 蛋白质表面特性蛋白质表面特性沉淀策略及方法沉淀策
9、略及方法n策略策略 破坏蛋白质四周水化层破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度降低双电层厚度 n沉淀方法沉淀方法 改变溶液改变溶液pH值值 加入无机盐或改变无机盐种类加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂添加脱水剂 蛋白质表面特性蛋白质表面特性常用的沉淀技术常用的沉淀技术n盐析沉淀盐析沉淀n等电点沉淀等电点沉淀n有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀n聚合物沉淀聚合物沉淀n热沉淀热沉淀 盐析沉淀盐析沉淀- -学习要点学习要点n识记：识记：盐析和盐溶概念盐析和盐溶概念 n理解：理解：盐析沉淀的原理，影响盐析盐析沉淀的原理，影响盐析的各种因素的各种因素 n应用：应用：掌握盐析
10、操作过程掌握盐析操作过程 盐析沉淀盐析沉淀- -盐析的定义盐析的定义n定义定义 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析（生沉淀的现象称为盐析（Salting-out）n溶解度与溶解度与I I的关系的关系Cohn方程方程 IKSSlog盐析沉淀盐析沉淀- -盐析原理盐析原理n低离子强度下的盐溶低离子强度下的盐溶 向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子，向蛋白质的纯水溶液中加入电介质后，蛋白质将吸附盐离子，而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质而形成扩散双电层（产生分子间相互排斥作用）导致蛋白质的溶解度增大，
11、发生盐溶的溶解度增大，发生盐溶n高离子强度下的盐析高离子强度下的盐析 溶液主体中那些与扩散层反离子电荷符号相同的电解质离子溶液主体中那些与扩散层反离子电荷符号相同的电解质离子将把反离子压入（排斥）到双电层中将把反离子压入（排斥）到双电层中 由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使由于盐的水化作用，其将争夺蛋白质水化层中的水分子，使蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用蛋白质表面疏水区脱水而暴露，增大它们之间的疏水性作用 盐析沉淀盐析沉淀- -盐析原理图示盐析原理图示盐析沉淀盐析沉淀- -影响盐析因素影响盐析因素n蛋白质的分子量和结构 n无机盐种类和浓度 相同离子强度下
12、，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同相同离子强度下，不同种类的盐对蛋白质的盐析效果不同 盐的种类将影响到盐的种类将影响到Cohn方程中的盐析常数方程中的盐析常数 盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的盐的种类对蛋白质溶解度的影响与离子的感胶离子序列感胶离子序列相符相符n温度和pH值 在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着温度升高而增大随着温度升高而增大 在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水化层并导致蛋白质溶解度的降低化层并导致蛋白质溶解度的降低 盐析沉淀盐析沉
13、淀- -无机盐的选择无机盐的选择n溶解度大溶解度大 可配制成具有较高离子强度可配制成具有较高离子强度的无机盐溶液的无机盐溶液 n溶解度受温度的影响较小溶解度受温度的影响较小 n盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀的沉降或离心分离。降或离心分离。盐析操作盐析操作- -沉淀剂性质沉淀剂性质 对于用于沉淀剂的无机盐试剂，了解其对于用于沉淀剂的无机盐试剂，了解其性质，特别是无机盐的溶解性质（溶液密度、性质，特别是无机盐的溶解性质（溶液密度、饱和浓度等），是必需的。饱和浓度等），是必需的。以硫酸铵为例：以硫酸铵为例：20下，饱和浓度为下，饱和浓度为4.05 mol/L（相当于
14、相当于534 g/L） 饱和密度为饱和密度为1.235 kg/L；0下，饱和浓度为下，饱和浓度为3.825 mol/L（相当于相当于505 g/L） 盐析操作盐析操作- -溶解度曲线确定溶解度曲线确定离心分离离心分离沉淀物并沉淀物并重新溶解重新溶解测定其中测定其中总蛋白和总蛋白和目标蛋白目标蛋白的浓度的浓度 以饱和度以饱和度为横坐标，为横坐标，上清液中上清液中总蛋白和总蛋白和目标蛋白目标蛋白浓度为纵浓度为纵坐标，得坐标，得到蛋白质到蛋白质溶解度曲溶解度曲线线 00.20.40.60.81020406080100 of saturation of ammonium sulphateprotein
15、 relative content in supernatant )Typical ammonium sulphate precipitation ranges for proteins from a crude extract in supernatant. () EGFP relative content in supernatant, ()total protein relative content in supernatant Normalized eGFP content in the precipitated pellet at different saturation of am
16、monium sulfate 盐析操作盐析操作- -无机盐加入量无机盐加入量硫酸铵的摩尔浓度由硫酸铵的摩尔浓度由M1增大到增大到M2所需要加入的所需要加入的硫酸铵质量硫酸铵质量W为为 2123 . 005. 4534MMMW212285. 0825. 3505MMMW200如果用饱和度如果用饱和度S代替摩尔浓度代替摩尔浓度M， 2123 . 01534SSSW等电点沉淀等电点沉淀- -学习要点学习要点n理解：理解：等电点沉淀法原理等电点沉淀法原理 n应用：应用：了解等电点沉淀法的优缺点和适了解等电点沉淀法的优缺点和适用范围用范围 等电点沉淀等电点沉淀- -定义定义利用蛋白质在利用蛋白质在pH值
17、等于其等电点值等于其等电点的溶液中溶解度的溶液中溶解度下降的原理进行下降的原理进行沉淀分级的方法沉淀分级的方法称为等电点沉淀称为等电点沉淀法法 等电点沉淀原理等电点沉淀原理n利用在低离子强度下蛋白质溶解度较低利用在低离子强度下蛋白质溶解度较低的特性，调整的特性，调整溶液溶液pHpH值至等电点值至等电点或或在等在等电点的电点的pHpH下利用透析等方法下利用透析等方法降低离子强降低离子强度，使蛋白质沉淀。度，使蛋白质沉淀。等电点沉淀等电点沉淀- -沉淀条件沉淀条件n较低的溶液离子强度较低的溶液离子强度 n溶液的溶液的pH值接近等电点值接近等电点 等电点沉淀等电点沉淀- -实现方式实现方式n在低离子
18、强度下调整溶液在低离子强度下调整溶液pH值至等电点值至等电点 n在等电点的在等电点的pH值下利用透析等方法降低值下利用透析等方法降低溶液的离子强度，使蛋白质沉淀溶液的离子强度，使蛋白质沉淀 等电点沉淀等电点沉淀- -操作特点操作特点n等电点沉淀在较低的离子强度下进行，等电点沉淀在较低的离子强度下进行，因此沉淀操作结束后因此沉淀操作结束后无需脱盐无需脱盐 n与其它沉淀与其它沉淀结合使用结合使用，例如在等电点附，例如在等电点附近进行的盐析沉淀操作时可以获得更小近进行的盐析沉淀操作时可以获得更小的蛋白质溶解度的蛋白质溶解度 n溶液的溶液的pH值值调节方便调节方便，但过低的蛋白质，但过低的蛋白质等电点
19、容易引起目标蛋白质变性等电点容易引起目标蛋白质变性 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀- -学习要点学习要点n理解：理解：有机溶剂沉淀法原理有机溶剂沉淀法原理 n应用：应用：了解有机溶剂沉淀法的优缺了解有机溶剂沉淀法的优缺点和适用范围点和适用范围 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀- -原理原理向蛋白质溶液中加入水溶性有机溶剂：向蛋白质溶液中加入水溶性有机溶剂：水的活度将降低水的活度将降低有机溶剂对水具有很大的亲和力，能够争夺蛋白质有机溶剂对水具有很大的亲和力，能够争夺蛋白质表面的水分子。表面的水分子。结果：结果：随有机溶剂浓度增大，水化程度降低，溶液的介电常随有机溶剂浓度增大，水化程度降低，溶液的介电常数下降，
20、蛋白质分子间的静电引力增大，从而发生凝数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而发生凝聚和沉淀聚和沉淀 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀- -原理图示原理图示有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀- -特点特点n优点优点 有机溶剂密度较低，易于沉淀分离有机溶剂密度较低，易于沉淀分离 与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐 n缺点缺点 有机溶剂沉淀容易引起蛋白质变性有机溶剂沉淀容易引起蛋白质变性 热沉淀热沉淀- -学习要点学习要点n理解：理解：了解热沉淀原理了解热沉淀原理 热沉淀热沉淀- -原理原理 在较高的温度下，热稳定性差的蛋白质将发在较高的温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性，有规则的肽
21、链结构被打开呈松散状不规生变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而发生凝聚和沉淀，利用这一现象，可根据蛋进而发生凝聚和沉淀，利用这一现象，可根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，以分离出热稳定性高的目标蛋白产物以分离出热稳定性高的目标蛋白产物 与前面介绍的热力学沉淀方法不同，热沉淀过程是基与前面介绍的热力学沉淀方法不同，热沉淀过程是基于蛋白质的变性动力学于蛋白质的变性动力学 其他沉淀技术其他沉淀技术n聚合物沉淀聚合物沉淀 非离子型聚合物沉淀非离子型聚合
22、物沉淀 聚电解质沉淀聚电解质沉淀 n重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质 n生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 沉淀生成动力学沉淀生成动力学-沉淀生长沉淀生长 异向生长异向生长 发生在沉淀生成初期，微细的蛋白质颗粒发生在沉淀生成初期，微细的蛋白质颗粒为布朗粒子，沉淀生长为扩散速率控制为布朗粒子，沉淀生长为扩散速率控制 同向凝聚同向凝聚 较大的沉淀颗粒在搅拌剪切作用下通过碰较大的沉淀颗粒在搅拌剪切作用下通过碰撞而进一步凝聚，生成大颗粒沉淀撞而进一步凝聚，生成大颗粒沉淀 泡沫分离n识记：识记：泡沫分离的概念泡沫分离的概念n理解：理解：泡沫分离的原理、优势泡沫分离的原理、优势n应用：应用：泡沫分离的应用泡沫分离的应用泡沫分离概念n泡沫分离是根据表面吸附原理，利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体对液相中的溶质或颗粒进行分离的方法。
