1、DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）作者：作者：Dr.FengDr.FengDNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）2实验目的实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳检测掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。的原理和方法。DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）3实验原理实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。要为分子筛效应。 在在 pH 值为值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。部解离，核酸分子
2、带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使使分子大小和构象不同的核酸分子分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料（如核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。到核酸片段所在的位置。DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）4实验器材和试剂实验器材和试剂 实验器材：实验器材：桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射
3、仪桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪 样品：样品： DNA分子量标准品，质粒分子量标准品，质粒 试剂试剂 琼脂糖琼脂糖 1电泳缓冲液（电泳缓冲液（TBE） 6上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭溴化乙锭(EB) ：10mg/mlDNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）5上样缓冲液0.25溴酚兰；溴酚兰；0.25二甲苯青；二甲苯青；30甘油水溶液甘油水溶液 作用：作用：增加样品密度，使其比重增加，以确保增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加均匀沉入加样孔内样孔内在电泳中形成肉眼可见的指在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加
4、样操作更方便使样品呈色，使加样操作更方便DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）6 天然琼脂（天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（琼脂糖（agaroseagarose）琼脂胶（琼脂胶（agaropectinagaropectin）: :含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。作用下能产生较强的电渗现象。琼脂琼脂DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）7琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化琼
5、脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。片段的标准方法。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的法）所无法分离的DNA片段。片段。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色染色,在紫外光下至少可以检出在紫外光下至少可以检出1-10ng的的DNA条带条带,从而可以确从而可以确定定DNA片段在凝胶中的位置。片段在凝胶中的位置。 此外此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带条带,用于以后用于以后
6、的克隆操作。的克隆操作。DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）8电泳指示剂：电泳指示剂： 核酸电泳常用的指示剂有两种核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝（溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）；）； 二甲苯青（二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携带的电荷量），它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）9核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭（溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫分
7、子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光外线激发下，发出桔红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦可在电，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min EB染料有许多优点，如染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或更少的或更少的DNA即可检出即可检出。（注意：（注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和使用和使用EB时都应带上手套，且注意不要把时都应带上手套，且
8、注意不要把EB洒到桌面或地板洒到桌面或地板上。上。 ）银染色银染色DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）10影响琼脂糖凝胶电泳的因素影响琼脂糖凝胶电泳的因素DNA分子的大小：实验证明，分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距片段迁移距离与其分子量的对数成反比；离与其分子量的对数成反比； 琼脂糖的浓度：一定大小的琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；DNA分子的构型：不同构型的分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大胶中的电泳速度差别较大DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）11(1) 操
9、作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。定量分析。(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。长期保存。DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）12DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）
10、13 银染色银染色银染色液中的银离子银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。色。灵敏度比灵敏度比EB高高200倍，但银染色后，倍，但银染色后，DNA不宜回收不宜回收DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）14实验操作实验操作 制备琼脂凝胶 胶板的制备 加样 电泳 紫外透射仪检测DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）15操作步骤1. 准
11、备准备用蒸馏水将电泳用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗槽和梳子冲洗干净，放在水干净，放在水平桌面上，并平桌面上，并架好梳子架好梳子DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）162. 配制配制1%琼脂糖凝胶及倒胶琼脂糖凝胶及倒胶具体步骤：具体步骤： 三角瓶内：三角瓶内：0.6g琼脂糖琼脂糖 +60ml(0.5TBE) 煮胶溶解煮胶溶解 冷却至冷却至60(不烫手不烫手) 加加EB 倒板倒板 室温下充分凝固室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面缓冲液至刚没过凝胶表面12nm。DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件
12、分享）173. 加样加样 将将DNA样品（样品（5ul）与）与6 上样上样缓冲液（缓冲液（1ul） 混匀后，用微混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。量加样枪小心加入样品孔内。注意加样枪的枪头不可插入注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。样品外溢。 每加完一个样品要更换枪头，每加完一个样品要更换枪头，以防止以防止EB污染。污染。 DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）184. 电泳电泳 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为负极往正极泳动（靠近
13、加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）（长度以两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳处，停止电泳DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）195. 结果观察结果观察 电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳结束后，将凝胶板取出。在紫外仪上观察电泳带及其位置，记录实验结果。电泳带及其位置，记录实验结果。DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）20DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）DNA琼脂糖凝胶电泳分析（课件分享）感谢您的阅览(此课件下载后可以自行编辑修改 关注我 每天分享干货）
