1、天然产物的提取分离和结构鉴定天然产物的提取分离和结构天然产物的提取分离和结构鉴定鉴定Chapter 2天然产物的提取分离和结构鉴定教学目的与要求：教学目的与要求：了解天然产物化学的预实验与提取掌握天然产物化学成分提取分离的原理及方法掌握色谱分离方法了解天然产物化学结构的测定方法天然产物的提取分离和结构鉴定主要内容主要内容v一、天然产物化学成分的预实验与提取一、天然产物化学成分的预实验与提取v二、色谱分离分析方法二、色谱分离分析方法v三、结晶和重结晶三、结晶和重结晶v四、天然产物化学成分的结构鉴定四、天然产物化学成分的结构鉴定天然产物的提取分离和结构鉴定2.1天然产物化学成分的预实验与提取天然产
2、物化学成分的预实验与提取v提取：提取：将有效成分从天然物质中提出的过程将有效成分从天然物质中提出的过程v分离：分离：将提取中混合的性质相同或不同的成将提取中混合的性质相同或不同的成分进一步分开的过程分进一步分开的过程天然产物的提取分离和结构鉴定研究天然产物化学成分的基本步骤研究天然产物化学成分的基本步骤原材料原材料单体化合物单体化合物总提取物总提取物不同部位不同部位目的化合物目的化合物结构修饰结构修饰人工合成人工合成提取提取初步分离初步分离精细分离纯化精细分离纯化天然产物的提取分离和结构鉴定一、天然产物化学成分的预实验一、天然产物化学成分的预实验v1.基本原理： 根据各成分极性的不同，先系统地
3、分成几个不同部分，然后利用显色反应或沉淀反应，或结合纸色谱、薄板色谱，定性判断各部分中可能含有的化合物类型。天然产物的提取分离和结构鉴定2.选择合适的极性溶剂（相似相溶）石油醚环己烷苯氯仿乙醚乙酸乙酯 正丁醇丙醇，乙醇甲醇水含盐水极性：小 大 亲脂性：大 小 亲水性：小 大天然产物的提取分离和结构鉴定适用于极性从小到大的预实验适用于极性从小到大的预实验采用石油醚、水、采用石油醚、水、95%95%乙醇的三段法进行粗分，提高工作效率乙醇的三段法进行粗分，提高工作效率天然产物的提取分离和结构鉴定天然产物的提取分离和结构鉴定二、天然产物化学成分的系统分离二、天然产物化学成分的系统分离v1.系统分离：v
4、 选择一系列分离措施，将性质相近的组分集中在一起提取出来，以便分别与临床、动物试验、检测等相配合，确定该部分是否有效v目的：v对无效部分暂不追踪，对有效部分视具体情况再进行分离，找出关键成分。天然产物的提取分离和结构鉴定v2.系统分离阶段v粗分阶段：又称部位分离，大类物质的分离，如皂苷、蛋白质等；v细分阶段：组分分离天然产物的提取分离和结构鉴定天然产物的提取分离和结构鉴定对于水提取液，采用离子交换树脂将其分为碱、酸和中性三部分：天然产物的提取分离和结构鉴定天然产物的提取分离和结构鉴定三、提取天然产物的常用方法三、提取天然产物的常用方法v1.溶剂法溶剂法v2.水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法v3.分馏法
5、分馏法v4.吸附法吸附法v5.沉淀法沉淀法v6盐析法盐析法v7.透析法透析法v8.升华法升华法天然产物的提取分离和结构鉴定1、溶剂提取法及其原理溶剂提取法及其原理 溶溶 剂剂 法法 溶剂提取法：是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。 原理：根据“相似相溶”原理，选择与化合物极性相当的溶剂将化合物从植物组织中溶解出来，同时，由于某些化合物的增溶或助溶作用，其极性与溶剂极性相差较大的化合物也可溶解出来。天然产物的提取分离和结构鉴定2、常用溶剂的特点、常用溶剂的特点石油醚石油醚, ,环己烷环己烷,
6、, 苯苯, ,氯仿氯仿, ,乙醚乙醚, ,乙酸乙酯乙酸乙酯, ,正丁醇正丁醇, ,丙酮丙酮, ,乙醇乙醇, ,甲醇甲醇, ,极性：小大亲脂性：大小亲水性：小大天然产物的提取分离和结构鉴定比水重的有机溶剂：氯仿比水重的有机溶剂：氯仿与水分层的有机溶剂：环己烷与水分层的有机溶剂：环己烷 正丁醇正丁醇能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇醇与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮 甲醇甲醇极性最大的有机溶剂：甲醇极性最大的有机溶剂：甲醇极性最小的有机溶剂：石油极性最小的有机溶剂：石油醚醚常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的
7、有机溶剂：正丁醇常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂：正丁醇 溶解范围最广的有机溶剂：乙溶解范围最广的有机溶剂：乙醇醇天然产物的提取分离和结构鉴定选择溶剂要注意以下三点：选择溶剂要注意以下三点：溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；溶剂不能与中药的成分起化学变化；溶剂不能与中药的成分起化学变化；溶剂要经济、易得、使用安全等。溶剂要经济、易得、使用安全等。3 3、溶剂的选择、溶剂的选择天然产物的提取分离和结构鉴定4 4、各种溶剂提取法、各种溶剂提取法 连续回流提取法等连续回流提取法等 浸渍法浸渍法渗漉法渗漉法煎煮法煎煮法回流提取法回流提取法
8、天然产物的提取分离和结构鉴定 浸渍法浸渍法： 浸渍法系将天然产物粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。 渗漉法渗漉法： 渗漉法是将天然产物粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。天然产物的提取分离和结构鉴定01溶剂罐02变频物料泵03快速渗漏机04流量计05渗滤液罐06可调试电加热水箱07热水泵08高效旋转薄膜蒸发器09浓缩液罐10冷凝器11冷却器12受却器13真空泵14控制柜SLNS-快速渗漉提取浓缩机组工艺流程图快速渗漉提取浓缩机组工艺流程图天然产物的提取分离和结构鉴定SLNS-
9、快速渗漉提取浓缩机组快速渗漉提取浓缩机组天然产物的提取分离和结构鉴定煎煮法煎煮法： 煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。 天然产物的提取分离和结构鉴定回流提取法回流提取法： 应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。溶剂浸过药材表面约12cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约1小时
10、后放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。 天然产物的提取分离和结构鉴定天然产物的提取分离和结构鉴定连续回流提取法连续回流提取法：应用挥发性有机溶剂提取天然产物有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。天然产物的提取分离和结构鉴定 提取方法提取方法溶剂溶剂操作操作提取效率提取效率使用范围使用范围备注备注浸渍法浸渍法水
11、或有机水或有机溶剂溶剂不加热不加热效率低效率低各类成分，各类成分，尤 遇 热 不尤 遇 热 不稳定成分稳定成分出膏率低，易出膏率低，易发霉，需加防发霉，需加防腐剂腐剂渗漉法渗漉法有机溶剂有机溶剂不加热不加热脂 溶 性 成脂 溶 性 成分分消耗溶剂量大，消耗溶剂量大，费时长费时长煎煮法煎煮法水水直火加热直火加热水 溶 性 成水 溶 性 成分分易挥发、热不易挥发、热不稳定不宜用稳定不宜用回 流 提 取回 流 提 取法法有机溶剂有机溶剂水浴加热水浴加热脂 溶 性 成脂 溶 性 成分分热不稳定不宜热不稳定不宜用，溶剂量大用，溶剂量大连 续 回 流连 续 回 流提取法提取法有机溶剂有机溶剂水浴加热水浴加
12、热节省溶剂、节省溶剂、效率最高效率最高亲 脂 性 较亲 脂 性 较强成分强成分用索氏提取器，用索氏提取器，时间长时间长天然产物的提取分离和结构鉴定5 5、溶剂萃取法分以下几种情况、溶剂萃取法分以下几种情况v采取几种不同极性的溶剂分步提取v先用极性低，与水不相混溶的有机溶剂（如石油醚，苯等），再用与水相溶的有机溶剂（如丙酮，乙醇等），最后用水提取。v目前采用的两种系统为： 乙醇-乙醚-甲醇-水 己烷-二氯甲苯-甲醇-水 常用作提供生物试验的样品用天然产物的提取分离和结构鉴定v单一溶剂提取v用水提取，杂质较多，常加入少量戊醇或辛醇v如果植物中含胺型生物碱、苷类及有机酸等含有亲水性基团，并能溶于水，
13、可直接用水提取（如：小檗碱，芸香苷，甘草酸）v如果植物中含的成分较为简单或某一成分含量较高时，可估计其极性大小或溶剂性能，选择一种适当的溶剂提取（如：细辛素石油醚，橙皮苷甲醇或乙醇）。天然产物的提取分离和结构鉴定v两种或两种以上溶剂v利用植物中所含成分在某种溶剂中溶解度大差异而达到分离的目的 如： 川楝素：苯石油醚溶解脂类，川楝素难溶而分出 60%乙醇减压浓缩氯仿提取天然产物的提取分离和结构鉴定v液-液分配萃取v利用混合物中的各成分在两种互不相溶的溶剂中，由于分配系数不同而达到的分离目的v分配系数相差越大，分离效果越高。天然产物的提取分离和结构鉴定v反应溶剂萃取v常用于内酯化合物，因为内酯环遇
14、碱水解成为羧酸盐而溶于水，再加酸酸化，可重新形成内酯环，不溶于水，即分开。天然产物的提取分离和结构鉴定6、强化溶剂提取的新方法v超临界流体萃取SCFEv超声波强化提取技术v微波萃取技术v酶法萃取技术天然产物的提取分离和结构鉴定超临界流体萃取超临界流体萃取SCFESCFE 超临界流体萃取：超临界流体萃取： 是以某一介质作为萃取剂，在其临界温度和临是以某一介质作为萃取剂，在其临界温度和临界压力之上的条件下，从液体或固体物料中萃取出界压力之上的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离的组分的一种方法。待分离的组分的一种方法。 超临界流体：超临界流体： 由于接近液体的密度使之具有较高溶解度由于接近液体的
15、密度使之具有较高溶解度, ,由由于接近气体的粘度于接近气体的粘度, , 使之具有良好的流动性能使之具有良好的流动性能, ,扩扩散系数介于气液之间散系数介于气液之间, ,使之对待萃取的物料组织有使之对待萃取的物料组织有良好的渗透性良好的渗透性, ,这些特征大大提高了溶质进入超临这些特征大大提高了溶质进入超临界流体的传质速率。界流体的传质速率。 天然产物的提取分离和结构鉴定超临界流体萃取的特点超临界流体萃取的特点 萃取过程在较低温度范围内进行萃取过程在较低温度范围内进行, ,特别适用于具有热敏性或特别适用于具有热敏性或易氧化的成分。萃取介质通常选用二氧化碳易氧化的成分。萃取介质通常选用二氧化碳,
16、,二氧化碳化学性二氧化碳化学性质稳定质稳定, ,无腐蚀性、无毒性、不易燃、不易爆无腐蚀性、无毒性、不易燃、不易爆, ,萃取后容易从萃取后容易从分离成分中脱除分离成分中脱除, ,不会造成污染不会造成污染, ,适用于食品和医药行业。适用于食品和医药行业。 工艺条件容易控制工艺条件容易控制, ,通过对温度和压力进行调节通过对温度和压力进行调节, , 可以实现可以实现选择性萃取和分离。选择性萃取和分离。 萃取产物的理化性质保持良好萃取产物的理化性质保持良好, ,产品质量好产品质量好, ,且无溶剂残留问且无溶剂残留问题题, ,萃取介质循环利用萃取介质循环利用, ,无环境污染问题。无环境污染问题。 超临界
17、流体萃取需要冷媒和高压支持且生产量较小超临界流体萃取需要冷媒和高压支持且生产量较小, ,操作成操作成本大。本大。 天然产物的提取分离和结构鉴定超临界流体萃取的应用超临界流体萃取的应用 由于超临界流体萃取技术上有许多不可替代的优点由于超临界流体萃取技术上有许多不可替代的优点, ,近年近年来获得高度的重视和广泛的应用来获得高度的重视和广泛的应用, ,例如中药有效成分的提取；菌体生成物的分离；香精香例如中药有效成分的提取；菌体生成物的分离；香精香料色素的提取；动植物脂肪、脂溶性成分、植物碱、甾料色素的提取；动植物脂肪、脂溶性成分、植物碱、甾醇类物质等成分的提取；有机溶剂以及有害有毒物质的醇类物质等成
18、分的提取；有机溶剂以及有害有毒物质的脱除等。脱除等。 天然产物的提取分离和结构鉴定超声波强化提取技术超声波强化提取技术v原理：利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取。v优点：提取时间短，收率高，避免高温对有效成分的破坏v缺点：对容器壁的薄厚，放置位置要求较高天然产物的提取分离和结构鉴定微波萃取技术微波萃取技术v原理：在微波场中，利用吸收微波能力的差原理：在微波场中，利用吸收微波能力的差异，被提取物质的某些区域或萃取体系中某异，被提取物质的某些区域或萃取体系中某些成分选择性加热些成分选择性加热分离分离v优点：提取速度快优点：提取速度快v缺点：要求药材含一定的水分，微波对某些缺点：要求药材
19、含一定的水分，微波对某些化合物有一定降解作用，只适宜对热稳定的化合物有一定降解作用，只适宜对热稳定的产物产物天然产物的提取分离和结构鉴定酶法萃取技术v原理：利用酶破坏植物的细胞壁，使有效成分溶出v是一种最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一v中药提取中多用纤维素酶天然产物的提取分离和结构鉴定水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法v水蒸气蒸馏法，适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的天然产物成分的提取。此类成分的沸点多在100以上，与水不相混溶或仅微溶，且在约100时存一定的蒸气压。当与水在一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时，液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出v大蒜素、丹皮酚、麻黄碱天然产
20、物的提取分离和结构鉴定分分 馏馏 法法v利用沸点不同进行分馏，再精制纯化v如：在分离毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱时，利用沸点不同进行常压或减压分馏天然产物的提取分离和结构鉴定吸附法吸附法v吸附目的：吸附目的：v1.1.吸附除去杂质，常指鞣质色素吸附除去杂质，常指鞣质色素v2.2.吸附所需物质吸附所需物质v常常用氧化铝、酸性白土、活性炭常常用氧化铝、酸性白土、活性炭 天然产物的提取分离和结构鉴定沉 淀 法v利用某些试剂产生沉淀的性质而得到分离或除去“杂质”。天然产物的提取分离和结构鉴定v盐析法盐析法: :加易溶无机盐至一定浓度或饱和，加易溶无机盐至一定浓度或饱和，降低成分溶解度，常用氯化钠、氯
21、化铵、硫降低成分溶解度，常用氯化钠、氯化铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁酸铵、硫酸钠、硫酸镁v透析法：透析法：小分子可通过半透膜，大分子不能小分子可通过半透膜，大分子不能通过，常用于纯化皂苷、蛋白质、多肽和多通过，常用于纯化皂苷、蛋白质、多肽和多糖等化合物。糖等化合物。天然产物的提取分离和结构鉴定升升 华华 法法v固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。天然产物中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自天然产物中提取出来。v例如樟木中升华的樟脑（camphor），在本草纲目中已有详细的记载，为世界上最早应用升华法制取药材有效成分的记述。v茶叶中的咖啡碱在178以上就能升华而不
22、被分解。游离羟基蒽醌类成分，一些香豆素类，有机酸类成分，有些也具有升华的性质。 天然产物的提取分离和结构鉴定四、天然产物的分离与精制四、天然产物的分离与精制v根据物质溶解度差别进行分离v根据物质在两相溶剂中的分配系数不同进行分离v根据物质的吸附性差别进行分离天然产物的提取分离和结构鉴定根据物质溶解度差别进行分离根据物质溶解度差别进行分离 利用不同温度，不同溶解度。eg结晶，重结晶加入另一溶剂，改变混合剂的极性，使一部分沉淀析出溶剂沉淀对酸、碱或两性有机化合物，常加酸碱来调节PH值，改变分子存在状态（游离型或离解型），从而改变溶解度而实现分离沉淀剂沉淀酸或碱性的化合物可通过加入沉淀剂，使之生成不
23、溶性的盐类析出。盐析沉淀天然产物的提取分离和结构鉴定v根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行 分离分离v液液-液萃取与分配系数液萃取与分配系数K值值vK=CU/CLvCU-溶质在上相溶剂中的浓度vCL-溶质在下相溶剂中的浓度天然产物的提取分离和结构鉴定v分离难易与分离因子分离难易与分离因子v分离因子分离因子表示表示 A A、B B 两种溶质在同一溶剂系统中两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。分配系数的比值。v即：即： =KA/KB( =KA/KB( 注：注：KA KB )KA KB )v100100，仅作一次简单萃取就可实现基本分离；，仅作一次简单萃取就可
24、实现基本分离；v100 10,萃取萃取10-12次次v 2，须，须100次以上萃取才基本分离次以上萃取才基本分离v 1,不能分离不能分离天然产物的提取分离和结构鉴定v分配比与分配比与PHPH值值 一般一般 pH3 pH12,pH12,则酸则酸性物质呈离解状态性物质呈离解状态(A-)(A-)、碱性物质则呈非离解状态碱性物质则呈非离解状态(B)(B)存在。据此存在。据此, ,可采用图可采用图2-52-5所示在不同所示在不同pHpH的缓冲的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配的方法溶液与有机溶剂中进行分配的方法, ,使酸性、碱性、使酸性、碱性、中性及两性物质得以分离。中性及两性物质得以分离。 天然产物的提取
25、分离和结构鉴定v液-液萃取与纸色谱v50，简单萃取v50，采用逆流分溶法v如果不知道分配比，可以借助纸色谱（PPC）求值v作业：逆流分溶法的原理和内容作业：逆流分溶法的原理和内容v 什么是色谱，色谱的分类什么是色谱，色谱的分类天然产物的提取分离和结构鉴定逆流分溶法v液-液萃取分离中经常遇到的情况是分离因子值较小, 故萃取及转移操作常须进行几十次乃至几百次。此时简单萃取已不能满足需要, 而要采用逆流分溶法( countercurrent distribution,简称CCD)。天然产物的提取分离和结构鉴定逆流分溶法v【逆流分溶法】又称逆流分配法、逆流分布法或反又称逆流分配法、逆流分布法或反流分布
26、法。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中流分布法。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中溶解度不同的原理使混合物分离的方法。溶解度不同的原理使混合物分离的方法。v此法相当于多次萃取。利用此原理制成了连续、自此法相当于多次萃取。利用此原理制成了连续、自动的逆流分溶仪。该仪器可使两种性质相似、即使动的逆流分溶仪。该仪器可使两种性质相似、即使分溶常数很接近的化合物，经过一定次数振摇、转分溶常数很接近的化合物，经过一定次数振摇、转移的操作，亦可达到分离的目的。用于分离抗生素、移的操作，亦可达到分离的目的。用于分离抗生素、脂肪酸、蛋白质、核酸以及激素等，也用于测定溶脂肪酸、蛋白质、核酸以及激素等，也用于测定溶
27、质的分溶常数。质的分溶常数。 天然产物的提取分离和结构鉴定CCD CCD 法因为操作条件温和、试样容易回收法因为操作条件温和、试样容易回收, ,故特别故特别适于中等极性、不稳定物质的分离。另外适于中等极性、不稳定物质的分离。另外, ,溶质浓溶质浓度越低度越低, ,分离效果越好。但是分离效果越好。但是, ,试样极性过大或过小试样极性过大或过小, ,或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采用此或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。 天然产物的提取分离和结构鉴定色谱法色谱法v 色谱法（chromatograph
28、y）又称层析法，是一又称层析法，是一种分离和鉴定化合物的有效方法，其最大的优点在种分离和鉴定化合物的有效方法，其最大的优点在于分离效能高、快速简便。对一些结构性质相似化于分离效能高、快速简便。对一些结构性质相似化合物的分离，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等合物的分离，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以达到分离目的时，用色谱法往往可以收到很好难以达到分离目的时，用色谱法往往可以收到很好的分离效果。的分离效果。 v基本原理：基本原理：利用混合物各组分在某一物质中的吸附利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异
29、，混合物的溶液流经该种物质，进行反复能的差异，混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。天然产物的提取分离和结构鉴定分类分类: :按流动相的分子聚集状态分类按流动相的分子聚集状态分类: :GCGC、LCLC、SFC SFC 等等按固定相的分子聚集状态分类按固定相的分子聚集状态分类: :GSCGSC、GLCGLC、LSCLSC、LLCLLC等等按操作形式分类按操作形式分类: :柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等按色谱过程的分离机制分类按色谱过程的分离机制分类: :分配色谱法、吸附色谱法、离子
30、交换色谱分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、法、 空间排阻色谱法、毛细管电泳法等空间排阻色谱法、毛细管电泳法等天然产物的提取分离和结构鉴定毛细管电色谱法毛细管电色谱法（CEC）色谱法色谱法GSC液相色谱法液相色谱法 （LC）柱色谱法柱色谱法平面色谱法平面色谱法毛细管电泳法毛细管电泳法（CE）LLCLSCSECIECBPC纸色谱法纸色谱法薄层色谱法薄层色谱法（TLC）LLCLLCLSC气相色谱法气相色谱法（GC）柱色谱法柱色谱法GLC超临界流体色谱法超临界流体色谱法 （SFC）天然产物的提取分离和结构鉴定 实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运
31、动的两相，固定相固定相(stationary phase)(stationary phase)和流动相和流动相(mobile phase)(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配分配”的过程。的过程。v组分的结构和性质微小差异组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等随流动相移动的速度不等 差速迁移差速迁移 色谱分离。色谱分离。天然产物的提取分离和结构鉴定v液-液分配柱色谱 将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不相混溶的另一相
32、溶剂 (流动相)冲洗色谱柱。这样,物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动,在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液-液分配柱色谱法。 天然产物的提取分离和结构鉴定v正相色谱正相色谱：分离水溶性或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时,固定相多采用强极性溶剂,如水、缓冲溶液等,流动相则用氯仿、乙酸乙醋、丁醇等弱极性有机溶剂,称之为正相色谱；v反相色谱反相色谱: :但当分离脂溶性化合物,如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时,则两相可以颠倒,固定相可用石蜡油,而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂,故称之为反相分配色谱 (reverse phase partition chroma
33、tography)。 天然产物的提取分离和结构鉴定加压液相柱色谱加压液相柱色谱v特点特点：加压液相色谱用的载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒，因而柱效率大大提高。v分类：快速色谱FC，低压液相色谱LPLC，中压液相色谱MPLC，高压液相色谱HPLC天然产物的提取分离和结构鉴定根据物质的吸附性差别进行分离根据物质的吸附性差别进行分离v固-液吸附：v物理吸附（主要）v化学吸附v半化学吸附天然产物的提取分离和结构鉴定物理吸附物理吸附 (physical absorption) 也叫表面吸附,是因构成溶液的分子(含溶质及溶剂)与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用所引起。 v特点
34、：特点：是无选择性、吸附与解吸过程可逆、 可快速进行。故在实际工作中用得最广。如采用硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂进行的吸附色谱即属于这一类型。天然产物的提取分离和结构鉴定v化学吸附化学吸附(chemical absorption),如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附,或生物碱被酸性硅胶吸附等吸附质与吸附剂之间要发生化学反应的一类吸附。v特点特点：具有选择性、 吸附十分牢固、有时甚至不可逆,故用得较少。天然产物的提取分离和结构鉴定半化学吸附半化学吸附(semi-chemical absorption),如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附,力量较弱,介于物理吸附与化学吸附之间的一类吸附。
35、天然产物的提取分离和结构鉴定1 1 物理吸附基本规律物理吸附基本规律（2）被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附过程中的三要素，彼此紧密相连。（1）物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱大体遵循“相似者易于吸附” 的经验规律。天然产物的提取分离和结构鉴定硅胶、氧化铝因均为极性吸附剂,故有以下特点:(1)对极性物质具有较强的亲和能力,极性强的溶质将被优先吸附。(2)溶剂极性越弱,则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强,则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。(3)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附,但一旦加入极性较强的溶剂时,又可被后者置换洗脱下来。天然产物的提取分离和结构鉴定活性炭因为是非极性
36、吸附剂, 对非极性物质具有较强的亲和能力,在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低,则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时,洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。 天然产物的提取分离和结构鉴定2 2 极性及其强弱判断极性及其强弱判断 极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。所谓极性乃是一种抽象概念,用以表示分子中电荷不对称(asymmetry)的程度，并大体上与偶极矩(dipole moment)、极化度（polarizability）及介电常数（dielectric constant）等概念相对应。 （1）官能团的极性按下
37、列官能团的顺序增强： CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR， C=O，CHO，NH2，OH，COOH （2）化合物的极性则由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素所决定。天然产物的提取分离和结构鉴定（3）大体上溶剂极性的大小可以根据介电常数()的大小来判断。介电常数越大，则极性越大。一般溶剂的介电常数按下列顺序增大： 环己烷（1.88），苯（2.29），无水乙醚（4.47），氯仿（5.20），乙酸乙酯（6.11），乙醇（26.0），甲醇（31.2），水（81.0） 天然产物的提取分离和结构鉴定 3. 3.简单吸附法进行物质的浓缩与精制简单吸附法进行物质的浓缩与精制 简单吸
38、附，如在结晶及重结晶过程中加入活性炭进行的脱色、脱臭等操作，在物质精制过程中应用很广。 天然产物的提取分离和结构鉴定4. 4. 吸附柱色谱法用于物质的分离吸附柱色谱法用于物质的分离 吸附色谱法中硅胶、氧化铝柱色谱在实际工作中用得最多。吸附色谱法中硅胶、氧化铝柱色谱在实际工作中用得最多。有关注意事项如下有关注意事项如下: : (1) (1) 硅胶、氧化铝吸附柱色谱过程中硅胶、氧化铝吸附柱色谱过程中, ,吸附剂的用量一般为吸附剂的用量一般为试样量的试样量的30603060倍。试样极性较小、难以分离者倍。试样极性较小、难以分离者, ,吸附剂用吸附剂用量可适当提高至试样量的量可适当提高至试样量的100
39、200100200倍。倍。 据此可选用适当规格的色谱管, 实验室中常用色谱管的规格如下所示，其高度与直径比约为(15:1) (20:1)。 色谱管内径(cm):0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 6.0 8.0 10 长度 (cm):10 15 30 45 60 75 90 120 150天然产物的提取分离和结构鉴定(2) (2) 硅胶、氧化铝吸附柱色谱硅胶、氧化铝吸附柱色谱, ,应尽可能选用极性小应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解试样的溶剂装柱和溶解试样, ,以利试样在吸附剂柱上形以利试样在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带。成狭窄的原始谱带。(3) (3) 洗脱用溶剂的极性宜逐步增加
40、洗脱用溶剂的极性宜逐步增加, ,但跳跃不能太大。但跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂实践中多用混合溶剂, ,并通过巧妙调节比例以改变并通过巧妙调节比例以改变极性极性, ,达到梯度洗脱分离物质的目的。达到梯度洗脱分离物质的目的。(4) (4) 为避免发生化学吸附为避免发生化学吸附, ,酸性物质宜用硅胶、碱性酸性物质宜用硅胶、碱性物质则宜用氧化铝进行分离。物质则宜用氧化铝进行分离。(5) (5) 如液如液- -液分配色谱中所述液分配色谱中所述, ,吸附柱色谱也可用加压吸附柱色谱也可用加压方式进行方式进行, ,溶剂系统可通过溶剂系统可通过 TLC TLC进行筛选。进行筛选。天然产物的提取分离和结构鉴定
41、5. 5. 聚酰胺吸附色谱法聚酰胺吸附色谱法 聚酰胺(polyamide)吸附属于氢键吸附,是一种用途十分广泛的分离方法,极性物质与非极性物质均可适用,但特别适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。 (1) (1) 聚酰胺的性质及吸附原理聚酰胺的性质及吸附原理天然产物的提取分离和结构鉴定一般认为是通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的一般认为是通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基酚羟基, ,或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。至于吸附强弱则取决于各种化合物成氢键缔合而产生吸附。至于吸附强弱则取决于各种化合物
42、与之形成氢键缔合的能力。通常在含水溶剂中大致有下列规与之形成氢键缔合的能力。通常在含水溶剂中大致有下列规律律: : 形成氢键的基团数目越多形成氢键的基团数目越多, ,则吸附能力越强。则吸附能力越强。 成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者, ,其其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。在聚酰胺上的吸附即相应减弱。天然产物的提取分离和结构鉴定分子中芳香化程度高者分子中芳香化程度高者, ,则吸附性增强；反之则吸附性增强；反之, ,则减弱。则减弱。如：如：以上是仅就化合物本身对聚酰胺的亲和力而言。但吸附因为是在溶液中进行,故溶剂也会参加吸附剂表面的争夺,或通过
43、改变聚酰胺对溶质的氢键结合能力而影响吸附过程。显然,聚酰胺与酚类或醌类等化合物形成氢键缔合的能力在水中最强,在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱,在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。 天然产物的提取分离和结构鉴定（2 2）聚酰胺柱的洗脱）聚酰胺柱的洗脱在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强, ,可大致排列成下可大致排列成下列顺序列顺序: :水水甲醇甲醇丙酮丙酮氢氧化纳水溶液氢氧化纳水溶液甲酰胺甲酰胺二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液尿素水溶液(3) (3) 聚酰胺色谱的应用聚酰胺色谱的应用聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸
44、附是可逆的, ,分离效果好分离效果好, ,加以吸附容量又大加以吸附容量又大, ,故聚酰胺色谱特别适故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离。此外合于该类化合物的制备分离。此外, ,对生物碱、萜类、对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。离也有着广泛的用途。天然产物的提取分离和结构鉴定6. 6. 大孔吸附树脂大孔吸附树脂 (1) (1) 大孔吸附树脂的吸附原理大孔吸附树脂的吸附原理 大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料,它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。分子筛性是由于其本身多孔性结构
45、的性质所决定。 (2) (2) 影响吸附的因素影响吸附的因素 比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键（3 3）大孔吸附树脂的应用）大孔吸附树脂的应用 大孔吸附树脂现在已被广泛应用于天然化合物的分离和富集工作中,如苷与糖类的分离、生物碱的精制。在多糖、黄酮、三萜类化合物的分离方面都有很好的应用实例。 天然产物的提取分离和结构鉴定（4 4）洗脱液的选择）洗脱液的选择 洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂等。洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙脂等。根据吸附作用强弱选用不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂。根据吸附作用强弱选用不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂。对非极性大孔树脂对非极性大孔树脂, ,洗
46、脱液极性越小洗脱液极性越小, ,洗脱能力越强。洗脱能力越强。对于中等极性的大孔树脂和极性较大的化合物来说对于中等极性的大孔树脂和极性较大的化合物来说, ,则选用极则选用极性较大的溶剂为宜。性较大的溶剂为宜。 天然产物的提取分离和结构鉴定四、根据物质分子大小差别进行分离四、根据物质分子大小差别进行分离 1 1、凝胶过滤法（、凝胶过滤法（Gel filtrationGel filtration） 凝胶过滤法也叫凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatography)、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、排祖色谱（exclusion chromato
47、graphy），系利用分子筛分离物质的一种方法。其中所用载体，如葡聚糖凝胶，是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。（1 1）原理：）原理：分子筛原理。即利用凝胶的三维网状结构的分分子筛原理。即利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行分离。子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行分离。 天然产物的提取分离和结构鉴定（2 2）出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。）出柱顺序：按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。 （3 3）常用的溶剂：）常用的溶剂：碱性水溶液（碱性水溶液（0.1mol/L NH0.1mol/L NH4 4OHOH）含盐水
48、溶液）含盐水溶液（0.5mol/L NaCl0.5mol/L NaCl等）等）醇及含水醇，如甲醇、甲醇醇及含水醇，如甲醇、甲醇水水其他溶剂：如含水丙酮，甲醇其他溶剂：如含水丙酮，甲醇- -氯仿氯仿天然产物的提取分离和结构鉴定（4 4）凝胶的种类与性质）凝胶的种类与性质 种类很多，常用的有以下两种：种类很多，常用的有以下两种： Sephadex-G Sephadex-G：葡聚糖凝胶，只适用于水中应用，且不：葡聚糖凝胶，只适用于水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质。同规格适合分离不同分子量的物质。 Sephadex LH-20 Sephadex LH-20：羟丙基葡聚糖凝胶，为：羟丙基葡聚
49、糖凝胶，为Sephadex Sephadex G-25G-25经羟丙基化后得到的产物，具有以下两个特点：具有经羟丙基化后得到的产物，具有以下两个特点：具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质；在由极性与非极分子筛特性，可按分子量大小分离物质；在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的作用，性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的作用，适合于不同类型有机物的分离。应用最广。适合于不同类型有机物的分离。应用最广。 天然产物的提取分离和结构鉴定交联葡聚糖的化学结构交联葡聚糖的化学结构天然产物的提取分离和结构鉴定五、五、 根据物质离解度不同进行分离根据物质离解度不同进行分离 具有酸性
50、、碱性、两性基团的化合物在水中多呈解离状态，具有酸性、碱性、两性基团的化合物在水中多呈解离状态，据此可用离子交换法进行分离。据此可用离子交换法进行分离。 固定相：离子交换树脂固定相：离子交换树脂1 1、离子交换法分离物质的原理、离子交换法分离物质的原理流动相：水或含水溶剂流动相：水或含水溶剂洗脱液：强酸性阳离子交换树脂（洗脱液：强酸性阳离子交换树脂（H H型）型）稀氨水洗脱稀氨水洗脱 强碱性阴离子交换树脂（强碱性阴离子交换树脂（OHOH型）型）稀氢氧化钠洗脱稀氢氧化钠洗脱原理：离子交换原理原理：离子交换原理天然产物的提取分离和结构鉴定2 2、离子交换树脂的结构及性质、离子交换树脂的结构及性质强
