1、细胞凋亡细胞凋亡分子机制及检测分子机制及检测 细胞发生代谢停止、结构破坏和功能细胞发生代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡细胞死亡。细。细胞死亡包括胞死亡包括坏死和凋亡坏死和凋亡两大类型。相比起两大类型。相比起细胞坏死，细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式形式。 在在2020世纪世纪7070年代，科学家们发现了细年代，科学家们发现了细胞凋亡，这一研究成果获得了胞凋亡，这一研究成果获得了20022002年诺贝年诺贝尔生理尔生理/ /医学奖。医学奖。有丝分裂有丝分裂 细胞增多细胞增多 动态平衡动态平衡细胞凋亡细胞凋亡 细胞减
2、少细胞减少新生细胞出现，产生相应功能新生细胞出现，产生相应功能 机体机体 正常生正常生原有的、不必要的、有害的细胞除去原有的、不必要的、有害的细胞除去 长发育长发育 细胞程序性死亡细胞程序性死亡的概念是的概念是19561956年年提出的，提出的，PCDPCD是个功能性概念，描述在一个是个功能性概念，描述在一个多细胞生物体多细胞生物体中某些细胞死亡是中某些细胞死亡是个体发育个体发育中的一个中的一个预定的，并预定的，并受到严格程序控制受到严格程序控制的正常组成部分。的正常组成部分。 特征特征: :即散在地、逐个地从正常组织中死亡即散在地、逐个地从正常组织中死亡和消失和消失, ,机体无炎症反应，而且
3、对整个机体的发机体无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。育是有利和必须的。 细胞程序性死亡是一个细胞程序性死亡是一个发育学发育学概念，而细胞概念，而细胞凋亡则是一个凋亡则是一个形态学形态学概念，描述一件有着一整套概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。互使用，具有同等意义。凋亡概念的形成凋亡概念的形成 1965年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些散在的死亡细胞。这些细胞的溶酶体并未被
4、破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从其周围的组织中脱落并被吞噬,机体无炎症反应。 1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。细胞凋亡的形态学及生物化学形态学及生物化学研究阶段（1972-1987）1）利用光镜和电镜光镜和电镜对形态学特征进行了详细的研究。2）染色体染色体DNA的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。3）RNA/蛋白质蛋白质大分子的合成。4）钙离子钙离子变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重
5、要条件。 5）内源性核酸内切酶内源性核酸内切酶：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。细胞凋亡的分子生物学分子生物学研究阶段1）细胞凋亡相关基因基因及其调控2）细胞凋亡的信号转导信号转导3）细胞凋亡各种分子相互作用及相互关系4) 细胞凋亡的临床应用基础研究阶段 细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。 细胞的生长发育、增殖、分化和死亡是细胞细胞的生长发育、增殖、分化和死亡是细胞的的4 4大特点，细胞死亡分为大特点，细胞死亡分为细胞凋亡和细胞坏死细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis)(apoptosis)是由死亡信号诱发的受调是由死
6、亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程节的细胞死亡过程, , 是细胞生理性死亡的普遍形是细胞生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中式。凋亡过程中DNADNA发生片段化，细胞皱缩分解发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。生炎症。 第一节第一节 概述概述一、细胞凋亡概念和特征一、细胞凋亡概念和特征 细胞坏死（细胞坏死（necrosisnecrosis）是在各种致病是在各种致病因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）的剧烈刺激下的的剧烈刺激下的病理性死亡。病理性死亡。其其特点特点是是: : 引起死亡
7、的因素剧烈，死亡迅速。表现为引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。表现为能量代谢下降能量代谢下降膜通透性增加膜通透性增加细胞水细胞水肿肿细胞器破裂，细胞溶解，细胞器破裂，细胞溶解，DNADNA不断不断裂裂内含物释放内含物释放引起炎症反应。引起炎症反应。 细胞凋亡细胞凋亡: :细胞在一定的生理或病理条细胞在一定的生理或病理条件下件下, ,遵循自身的程序遵循自身的程序, ,结束其生命的生理结束其生命的生理性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象。凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解象。凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解细细胞和细胞器浓缩而不裂解胞和细胞器浓缩而不裂解染色体染色体DNAD
8、NA断裂断裂和形成凋亡小体和形成凋亡小体细胞内含物不外泄，不细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。识别和吞噬。细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的形态学特征 细胞：细胞：首先变圆，体积缩小，与邻近细胞的连首先变圆，体积缩小，与邻近细胞的连接丧失，失去微绒毛，胞浆浓缩，细胞膜结构接丧失，失去微绒毛，胞浆浓缩，细胞膜结构仍保持完整。仍保持完整。 细胞核的变化细胞核的变化：胞核内染色质浓缩形成密集颗：胞核内染色质浓缩形成密集颗粒，位于核被膜下。粒，位于核被膜下。 细胞器：细胞器： 线粒体：保持完整呈正常状态线粒体：保持完整呈正常状态 溶酶体
9、：保持完整，内容物不外泄溶酶体：保持完整，内容物不外泄 形成形成凋亡小体凋亡小体： 内质网、高尔基复合内质网、高尔基复合体及核被膜膨大体及核被膜膨大, ,形成泡状结构与细胞膜融形成泡状结构与细胞膜融合，以出泡方式离开正在死亡的细胞，将合，以出泡方式离开正在死亡的细胞，将所包含的完整细胞器和核碎片等细胞内容所包含的完整细胞器和核碎片等细胞内容物以细胞质膜包被成物以细胞质膜包被成凋亡小体凋亡小体(apoptosis (apoptosis bodiesbodies）释放到细胞外。凋亡小体很快被释放到细胞外。凋亡小体很快被周围邻近周围邻近间质细胞或巨噬细胞间质细胞或巨噬细胞吞噬，而不吞噬，而不引起周围
10、组织的炎症反应。引起周围组织的炎症反应。胸腺细胞胸腺细胞正常正常凋亡凋亡 生物化学方面：生物化学方面： 核酸内切酶核酸内切酶活化与活化与DNADNA电泳呈梯子状电泳呈梯子状改变是改变是apoptosisapoptosis的的生物化学标志生物化学标志。 核酸内切酶在核小体连接处将核酸内切酶在核小体连接处将DNADNA链切断，链切断，从而最终产生从而最终产生寡聚核小体寡聚核小体。这些寡聚核小体的大。这些寡聚核小体的大小均是小均是DNADNA长度为长度为180 - 200180 - 200个碱基对个碱基对(bp)(bp)的倍数，的倍数，因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNAD
11、NA时出现特征时出现特征性的性的“梯状梯状”（ladderladder）带纹）带纹。Ladder Pattern of Apoptotic Cells二、细胞凋亡的生理意义二、细胞凋亡的生理意义1. 1. 维持组织器官维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡细胞类型和细胞总量的基本平衡：清：清除衰老损伤的细胞除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。：皮肤、粘膜细胞的更新等。2. 2. 在在胚胎发育胚胎发育中起重要作用中起重要作用 a a 手指和脚趾的形成等。手指和脚趾的形成等。 b b 大脑神经元之间形成大脑神经元之间形成连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉
12、。 c c 在淋在淋巴细胞发育成熟中起重要作用。巴细胞发育成熟中起重要作用。d d 心脏发育过程中心脏发育过程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋亡调节。胞凋亡调节。3. 3. 细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病疾病。 未成熟未成熟B B细胞细胞（immature B cellimmature B cell）完成骨髓发）完成骨髓发育阶段后，进入血液循环。尽管它表达育阶段后，进入血液循环。尽管它表达膜表面抗原膜表面抗原受体受体，但，但不具备免疫活性不具备免疫活性。因此，在结合抗原后，。因此
13、，在结合抗原后，细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。 只有经过不同阶段的过渡期，分化为成熟只有经过不同阶段的过渡期，分化为成熟B B细细胞，才具有免疫活性。胞，才具有免疫活性。 过渡期过渡期B B细胞的发育、成熟是受复杂的调控。细胞的发育、成熟是受复杂的调控。一方面一方面，细胞的生存机制促进未成熟，细胞的生存机制促进未成熟B B细胞的存活细胞的存活与发育，保证了与发育，保证了B B细胞成熟的顺利完成。细胞成熟的顺利完成。另一方面另一方面，70%70%的细胞凋亡，消除潜在自身反应性的细胞凋亡，消除潜在自身反应性B B细胞细胞，实现，实现了对自身组织的免疫耐受。了对
14、自身组织的免疫耐受。 由HIV感染引起的艾滋病有一个重要特征是随着病情的发展，CD4T细胞数进行性减少，其主要原因是：1，HIV感染细胞后产生一些调控性基因产物，这些产物使未被感染细胞未被感染细胞对CD95介导的凋亡高度敏感凋亡高度敏感（即通过Fas-FasL应答而使未被感染的细胞凋亡）；2，被HIV感染的CD4T细胞大量复制子病毒，导致细胞死亡，同时又使更多的细胞被感染。随感染时间的延长造成免疫系统进行性损伤和崩溃。 由此可见:HIV即可引起细胞凋亡也可引起细胞可引起细胞凋亡也可引起细胞坏死坏死.一、半胱天冬酶（胱冬酶，一、半胱天冬酶（胱冬酶，caspasecaspase，天冬氨酸天冬氨酸特
15、异性半胱氨酸蛋白酶，特异性半胱氨酸蛋白酶，cysteine-containing cysteine-containing aspartate-specific protease)aspartate-specific protease)第二节第二节 细胞凋亡相关基因和蛋白质细胞凋亡相关基因和蛋白质Caspase的含义表现在两个方面（）它们为半胱氨酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团；（）它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。 Asp Asp 特异性半胱氨酸蛋白酶特异性半胱氨酸蛋白酶. . caspasecaspase能够高度选择能够高度选择性地
16、切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解一种蛋白质。一种蛋白质。 是一类促进细胞凋亡的是一类促进细胞凋亡的蛋白水解酶蛋白水解酶，在诱导细胞凋，在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的亡中起关键作用，成为细胞凋亡的“中心处理器中心处理器”，即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细胞凋亡。冬酶通过水解不
17、同的蛋白质引起细胞凋亡。1 Caspase1 Caspase的结构和功能的结构和功能 Caspase Caspase 共有十多种，结构相似，都以共有十多种，结构相似，都以酶原酶原的形式分的形式分泌。酶原水解激活后产生泌。酶原水解激活后产生前结构域，大亚基和小亚基前结构域，大亚基和小亚基三部分，然后大小亚基聚合形成有活性的四聚体。三部分，然后大小亚基聚合形成有活性的四聚体。 N N端结构域端结构域参与酶功能激活调节参与酶功能激活调节; ; 大、小亚基大、小亚基提供与底物提供与底物结合及催化结合及催化所需的氨基酸。所需的氨基酸。Caspase Caspase 可专一、高效地特异性水解一系列蛋白质底
18、可专一、高效地特异性水解一系列蛋白质底物物, ,并导致蛋白质功能丧失或改变并导致蛋白质功能丧失或改变 。 caspase caspase 酶原酶原 前结构域前结构域 + + 大亚基大亚基 + + 小亚基小亚基 大大 异二聚体异二聚体 小小 大大 大大 异四聚体异四聚体 活性形式活性形式 小小 小小 活化Caspase为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子，球状分子的核心为个螺旋环绕的6个片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化Caspase分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。 Crystal Structures of
19、Human Caspases Structure of Caspase-7 with Inhibitor Caspase Caspase 作用：作用： 是一类是一类蛋白水解酶蛋白水解酶，可特异水解底物，可特异水解底物蛋白分子中蛋白分子中天冬氨酸残基天冬氨酸残基羧基侧羧基侧的肽键，的肽键，从而激活该蛋白质或改变蛋白质的活性，从而激活该蛋白质或改变蛋白质的活性，从而促进细胞凋亡。从而促进细胞凋亡。 N A-B-C-D-X CN A-B-C-D-X C 不同的不同的CaspaseCaspase对对ABCDABCD种类要求不同。种类要求不同。 CaspaseCaspase是细胞凋亡的执行者，引起是细胞
20、凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信息传递细胞凋亡的各种因素通过凋亡信息传递途经最终激活途经最终激活caspasecaspase，caspasecaspase通过水通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。其中胞凋亡。其中caspase 3caspase 3 的作用最重要。的作用最重要。但并非所有的凋亡过程都有但并非所有的凋亡过程都有caspase caspase 的的参与。参与。2 Caspase 2 Caspase 的分类的分类（1 1）上游）上游/ /启动型启动型caspase: 2caspase: 2、8 8、9 9、1010，1212
21、 处于细胞凋亡信号传递途径的上游，在凋处于细胞凋亡信号传递途径的上游，在凋亡信号的刺激下首先被激活，然后再水解激活亡信号的刺激下首先被激活，然后再水解激活下游的下游的caspase.caspase.（2 2）下游）下游/ /执行型执行型caspase: 3caspase: 3、 6 6 、7 7 处于细胞凋亡信后传递途径的下游，被上处于细胞凋亡信后传递途径的下游，被上游游caspasecaspase激活后直接水解与细胞凋亡有关的激活后直接水解与细胞凋亡有关的底物蛋白，引起细胞形态学和生物化学改变以底物蛋白，引起细胞形态学和生物化学改变以及及DNADNA的断裂。的断裂。3 Caspase3 Ca
22、spase的底物的底物1 1、细胞骨架蛋白细胞骨架蛋白：核纤层蛋白、肌动蛋白、：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白。核分裂相关蛋白等十几种蛋白。2 2、与与DNADNA损伤修复相关的蛋白质和酶损伤修复相关的蛋白质和酶，阻止，阻止DNADNA损伤的修复。损伤的修复。 如：如：DNADNA依赖性蛋白激酶、依赖性蛋白激酶、DNADNA复制相关复制相关蛋白。蛋白。3 3、激活激活DNADNA酶酶，促进，促进DNADNA断裂。断裂。二、死亡受体及相关蛋白二、死亡受体及相关蛋白 是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：* * 死亡配体（细胞外）死亡配体（细
23、胞外）死亡受体（细胞膜）死亡受体（细胞膜）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）激活激活caspase caspase 诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡1 1 死亡受体死亡受体(death receptor, DR)(death receptor, DR)死亡受体死亡受体是一类跨膜蛋白，与其配体结合后可是一类跨膜蛋白，与其配体结合后可把凋亡信号传递到细胞内部。把凋亡信号传递到细胞内部。主要的死亡受体是主要的死亡受体是TNF-RTNF-R超家族；超家族； 配体配体 死亡受体死亡受体 TNF- TNF-R1TNF- TNF-R1 FasL Fas FasL Fas（CD95/APO-1C
24、D95/APO-1） APO-3L DR-3APO-3L DR-3（WOL-1WOL-1） APO-2 DR-4APO-2 DR-4（TRAIL-R1TRAIL-R1） TRAIL DR-5TRAIL DR-5（TRAIL-R2TRAIL-R2） （TNFTNF相关的凋亡诱导配体，相关的凋亡诱导配体，TNF-related TNF-related apoptosis-inducing ligandapoptosis-inducing ligand）Fasassociated protein withdeath domainTNF receptor-1associated death domai
25、n protein ApoptosisApoptosiscaspase激活的DNA酶（caspaseactivated deoxyribonuclease，CAD） ICAD（inhibitor of CAD） 死亡受体相关蛋白死亡受体相关蛋白（中介蛋白（中介蛋白/ /接头蛋白）接头蛋白） 是连接死亡受体和是连接死亡受体和caspasecaspase的中介蛋白，把凋的中介蛋白，把凋亡信号从死亡受体传递给亡信号从死亡受体传递给caspasecaspase。(1) FADD(1) FADD（FasFas相关的死亡结构域蛋白相关的死亡结构域蛋白，Fas Fas associated death do
26、main protein)associated death domain protein)由两部分构由两部分构成成, ,介导介导FasFas和和TNFRTNFR1 1两种受体的细胞凋亡信号两种受体的细胞凋亡信号: : A A 死亡结构域：与死亡结构域：与FasFas的的DDDD相互作用相互作用 B B 死亡效应区：与启动型死亡效应区：与启动型caspase2caspase2、8 8、9 9、1010作用作用 (2) TRADD(2) TRADD（TNFR-1 TNFR-1 相关死亡结构域蛋白相关死亡结构域蛋白） 从从TNFR-1TNFR-1接受死亡信号，然后传递给接受死亡信号，然后传递给FAD
27、D. FADD. This protein can also interact with This protein can also interact with receptor FAS, and is involved in the Fas-receptor FAS, and is involved in the Fas-induced cell death pathwayinduced cell death pathway 三、三、凋亡蛋白酶激活因子类凋亡蛋白酶激活因子类（apoptosis protease activation factor, Apafapoptosis proteas
28、e activation factor, Apaf） 一类促进细胞凋亡的蛋白因子，参与细胞凋亡的一类促进细胞凋亡的蛋白因子，参与细胞凋亡的线粒体信息传递途经。线粒体信息传递途经。 细胞凋亡与细胞凋亡与线粒体膜电位线粒体膜电位及及通透性通透性改变有关。凡改变有关。凡是诱导细胞凋亡的因素，都可使线粒体的是诱导细胞凋亡的因素，都可使线粒体的膜电位膜电位下降，膜通透性增加下降，膜通透性增加，线粒体膜通透性转运孔线粒体膜通透性转运孔（MPTMPT）开放）开放，释放出多种可激活，释放出多种可激活caspasecaspase的蛋白的蛋白因子，包括细胞色素因子，包括细胞色素c(Cytc)c(Cytc)，凋亡诱
29、导因子，凋亡诱导因子(AIF)(AIF)。 1 1 细胞色素细胞色素c c（CytcCytc） 细胞色素细胞色素c c是呼吸链的重要成员，是由线粒体是呼吸链的重要成员，是由线粒体DNADNA编码的蛋白质。编码的蛋白质。 细胞凋亡信号细胞凋亡信号 线粒体膜通透性增加，线粒体膜通透性增加，Cytc Cytc 释放到胞浆释放到胞浆 与与Apaf-1Apaf-1和和caspase-9caspase-9结合成复结合成复合体合体，诱导凋亡。，诱导凋亡。2 2 凋亡蛋白酶激活因子凋亡蛋白酶激活因子-1-1（Apoptotic Apoptotic protease activating factor-1, A
30、paf-1protease activating factor-1, Apaf-1） 在正常情况下在正常情况下Apaf-1Apaf-1以无活性的单体存在以无活性的单体存在于细胞质，在凋亡信号的作用下，其于细胞质，在凋亡信号的作用下，其N-N-端与端与Caspase-9Caspase-9结合，其结合，其C C端与细胞色素端与细胞色素C C结合。形成结合。形成Cytc-Apaf-1-Caspase-9 Cytc-Apaf-1-Caspase-9 复合体复合体-凋亡酶体凋亡酶体（apoptosome)apoptosome)。首先激活。首先激活caspase-9caspase-9，然后激，然后激活下游
31、的活下游的caspase 3caspase 3，6 6，7 7等，诱导细胞凋亡。等，诱导细胞凋亡。3 3 凋亡诱导因子（凋亡诱导因子（Apoptosis Apoptosis inducing factor, AIFinducing factor, AIF） 凋亡诱导因子是一类存在于线粒体内外膜间隙凋亡诱导因子是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白，具有的保守的黄素蛋白，具有双重功能双重功能。在细胞正常的。在细胞正常的生理状态下，生理状态下，AIFAIF作为作为线粒体氧化还原酶线粒体氧化还原酶，能催化，能催化细胞色素细胞色素c c（Cyt-cCyt-c）和）和NADNAD之间的电子传递，当
32、细之间的电子传递，当细胞受到凋亡的刺激时，线粒体膜通透性改变，胞受到凋亡的刺激时，线粒体膜通透性改变，AIFAIF从 线 粒 体 转 位 到 核 内 ， 与 线 粒 体 蛋 白 质从 线 粒 体 转 位 到 核 内 ， 与 线 粒 体 蛋 白 质endonuclease G (Endo G)endonuclease G (Endo G)一起一起引起细胞染色体的引起细胞染色体的凝聚和凝聚和DNADNA大的片段化大的片段化。apoptosis-inducing factor 四、四、Bcl-2Bcl-2家族家族 Bcl-2Bcl-2家族成员都含有家族成员都含有1-41-4个个Bcl-2Bcl-2同
33、源结同源结构域构域（BH1-4BH1-4），并且通常有一个羧端），并且通常有一个羧端跨膜结跨膜结构域构域(transmembrane region ,TM)(transmembrane region ,TM)。其中。其中BH4BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3BH3是与促进是与促进凋亡有关的结构域凋亡有关的结构域。根据功能和结构可将。根据功能和结构可将Bcl-Bcl-2 2基因家族分为两类，一类是基因家族分为两类，一类是抗凋亡的（抗凋亡的（anti-anti-apoptoticapoptotic），），如：如：Bcl-2Bcl-2、Bcl-xlBcl-xl、B
34、cl-wBcl-w、M c l - 1M c l - 1 ； 一 类 是； 一 类 是 促 进 凋 亡 的 （促 进 凋 亡 的 （ p r o -p r o -apoptoticapoptotic），），如：如：BaxBax、BakBak、BadBad、BidBid、BimBim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3BH3结构，结构，如如BidBid、BadBad。（一）（一） Bcl-2Bcl-2和和Bcl-xlBcl-xl1 1 为膜结合蛋白为膜结合蛋白2 2 降低线粒体膜通透性，抑制降低线粒体膜通透性，抑制CytcCytc、AIFAIF等释放。等释放。4 4 抑
35、制自由基的产生，抑制氧化剂对细胞凋亡的诱抑制自由基的产生，抑制氧化剂对细胞凋亡的诱导作用。导作用。5 5 许多抗癌药物如紫杉醇可使许多抗癌药物如紫杉醇可使bcl-2bcl-2磷酸化而失活。磷酸化而失活。从而诱导肿瘤细胞凋亡。从而诱导肿瘤细胞凋亡。6 HIV6 HIV病毒蛋白水解酶可水解病毒蛋白水解酶可水解Bcl-2, Bcl-2, 诱导诱导T T淋巴细淋巴细胞凋亡。胞凋亡。 虽然虽然Bcl-2Bcl-2蛋白存在于蛋白存在于线粒体膜、内线粒体膜、内质网膜以及外核膜质网膜以及外核膜上，但主要定位于上，但主要定位于线线粒体外膜粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡
36、蛋白则主要定位于细胞而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道粒体外膜形成跨膜通道 ，或者开启线粒，或者开启线粒体的体的PTPT孔，从而导致线粒体中的凋亡因孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活子释放，激活caspasecaspase，导致细胞凋亡。，导致细胞凋亡。（二）（二） BaxBax、Bcl-xsBcl-xs、BadBad1 Bax1 Bax在线粒体外膜形成寡聚体，形成通道使线粒在线粒体外膜形成寡聚体，形成通道使线粒体膜的通透性增加，促进
37、体膜的通透性增加，促进CytCCytC、Apat-1Apat-1等的释放，等的释放，激活激活caspasecaspase，促进凋亡，促进凋亡 。2 2 当细胞内当细胞内BaxBax含量远大于含量远大于Bcl-2Bcl-2和和BclBclxlxl时，时，Bax Bax 自身形成的二聚体自身形成的二聚体BaxBaxBaxBax，可诱导细胞凋亡。，可诱导细胞凋亡。 3 3 在凋亡信号作用下，在凋亡信号作用下，p53p53表达升高，表达升高，p53p53进一步诱进一步诱导导BaxBax表达增加，诱导细胞凋亡。表达增加，诱导细胞凋亡。bcl-2bcl-2 二聚体抑制凋亡，二聚体抑制凋亡，促进细胞增殖促进
38、细胞增殖baxbax 二聚体促进凋亡二聚体促进凋亡p53 p53 促进促进 baxbax 蛋白的合成蛋白的合成第三节第三节 细胞凋亡通路细胞凋亡通路目前发现细胞凋亡有目前发现细胞凋亡有3 3条通路：条通路：死亡受体通路死亡受体通路线粒体通路线粒体通路内质网通路内质网通路第三节第三节 细胞凋亡通路细胞凋亡通路1 1 死亡受体通路（外源性凋亡途经）死亡受体通路（外源性凋亡途经） 过程：过程： 配体（配体（TNF/FasL) TNF/FasL) 死亡受体死亡受体 接接头蛋白（头蛋白（FADD/ TRADDFADD/ TRADD） caspase-8(caspase- caspase-8(caspas
39、e-10) 10) 凋亡酶体（凋亡酶体（apoptosome) caspase-8 apoptosome) caspase-8 (caspase-10)(caspase-10)自身切割激活自身切割激活 激活激活caspase-3 caspase-3 细胞凋亡。细胞凋亡。一、细胞凋亡的三条通路一、细胞凋亡的三条通路Fasassociated protein withdeath domainTNF receptor-1associated death domain protein ApoptosisApoptosis2 2 线粒体通路（内源性凋亡途经）线粒体通路（内源性凋亡途经）过程：活性氧（氧自
40、由基）过程：活性氧（氧自由基）/ DNA/ DNA损伤损伤 BaxBax穿入线粒体膜穿入线粒体膜 cyt C cyt C 漏出线粒体漏出线粒体 cyt C + Apaf-1 + caspase-9 + cyt C + Apaf-1 + caspase-9 + A T P A T P 凋 亡 酶 体 （ 位 于 细 胞 液 ）凋 亡 酶 体 （ 位 于 细 胞 液 ） caspasecaspase9 9自身切割激活自身切割激活 水解激活水解激活caspase-3 caspase-3 细胞凋亡细胞凋亡3 3 内质网通路内质网通路过程：过程：内质网（内质网（ER)ER)内内CaCa2+2+错误折叠的
41、蛋白质积累错误折叠的蛋白质积累 ER ER膜上膜上BaxBax和和BakBak聚集聚集 激活膜上的激活膜上的caspase-12caspase-12（自我切割）（自我切割） 水解激活水解激活caspase-3 caspase-3 细胞凋亡细胞凋亡 二、细胞凋亡通路的调节二、细胞凋亡通路的调节是一种很重要的抑癌基因，其蛋白产物是转录因是一种很重要的抑癌基因，其蛋白产物是转录因子，是一种很强的细胞凋亡诱导因子。诱导子，是一种很强的细胞凋亡诱导因子。诱导p21p21表达、表达、抑制细胞增殖。抑制细胞增殖。p53 p53 对死亡受体通路和线粒体通路均有对死亡受体通路和线粒体通路均有调节作用。调节作用。
42、 Bax bcl-2 Bax bcl-2 线粒体膜通透性增加线粒体膜通透性增加 细胞凋亡细胞凋亡 FasFas表达增加，表达增加，Fas-FADDFas-FADD复合物增加复合物增加细胞凋细胞凋 亡。亡。 2.2.Bcl-2Bcl-2家族对线粒体通路和内质网通路有调家族对线粒体通路和内质网通路有调节作用。节作用。 Bcl-2Bcl-2家族：（家族：（1 1）在线粒体外膜形成寡聚体，）在线粒体外膜形成寡聚体，影响膜通透性，影响凋亡；（影响膜通透性，影响凋亡；（2 2）聚集在内质网膜）聚集在内质网膜上，影响膜通透性降低，影响内质网内钙离子积上，影响膜通透性降低，影响内质网内钙离子积累，影响细胞凋亡
43、。累，影响细胞凋亡。第四节第四节 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测一、细胞凋亡的形态学检测一、细胞凋亡的形态学检测 1 1、光学显微镜和倒置显微镜光学显微镜和倒置显微镜（1 1）未染色细胞未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。凋亡小体。（2 2）染色细胞染色细胞：常用：常用姬姆萨染色、瑞氏染色姬姆萨染色、瑞氏染色等。等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋
44、亡形态。（放线菌素（放线菌素D D） 姬姆萨染色（肝组织）。A：对照组；B：处理组，凋亡细胞核染色质致密分布于核膜下。AB图1光学显微镜所见：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色400图2透射电子显微镜所见：箭头所示大量凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜80002、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(一种高级的荧光显微镜 ) 一般以细胞核染色质形态学改变细胞核染色质形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主
45、要结合在DNA的的A-T碱基区碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光蓝色荧光。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学细胞核染色质的形态学改变改变分为三期：期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3、透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘 绕 ， 出 现 许 多 称 为 气 穴 现 象（cavitations）的空泡结构；a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b期细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 （人外周
46、血白血病T细胞）二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖依赖性磷脂结合蛋白性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针荧光探针，利用流式细胞流式细胞仪或荧光显微镜仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。Annexin V/PI双染色
47、法双染色法 PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在结合在细胞膜表面作为凋亡的指示细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料以检测细胞膜完整性的检测方法。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期细胞和死亡细胞晚期细胞和死亡细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红
48、染细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。结果判断结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。 三、线粒体膜势能检测三、线粒体膜势能检测 线粒体跨膜电位线粒体跨膜电位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 JC-1染料在正常细胞正常细胞内聚集在线粒体内，形成多聚
49、体，发红色荧光发红色荧光；而在凋亡细胞凋亡细胞内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光发绿色荧光。荧光显微镜或流式细胞仪检测。 用凋亡诱导剂诱导用凋亡诱导剂诱导P388细胞凋亡，在细胞凋亡，在37，5%CO2培养箱培养箱培养培养46h，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测，通过流式细胞仪分析。进行检测，通过流式细胞仪分析。四、四、DNA片断化检测片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50300kbp长的长的DNA大片段大片段, 或
50、180200bp整数倍的寡核苷酸片段整数倍的寡核苷酸片段。 大分子染色体大分子染色体DNA片段的测定片段的测定 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。其不能用普通的琼脂糖凝胶电不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。泳来分离。通常采用脉冲电泳技术。脉冲电泳技术。 180200bp整数倍的寡核苷酸片段整数倍的寡核苷酸片段在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱和脱氧核糖核苷酸末端转
