1、1TQ-S液相色谱液相色谱-质谱联用仪质谱联用仪的原理及应用的原理及应用生物工程生物工程/制药工程制药工程 校内实训实习校内实训实习色谱色谱-质谱联用仪的构造组成质谱联用仪的构造组成3色谱色谱-质谱联用仪质谱联用仪色谱的分离能力色谱的分离能力质谱的定性功能质谱的定性功能实现对复杂混合物更实现对复杂混合物更准确的定量和定性分准确的定量和定性分析。而且也简化了样析。而且也简化了样品的前处理过程，使品的前处理过程，使样品分析更简便。样品分析更简便。4色谱质谱联用的分类色谱质谱联用的分类u 气相色谱气相色谱-质谱联用质谱联用：开发最早的色谱联用仪器，开发最早的色谱联用仪器，适宜分析适宜分析小分子、易挥
2、发、热稳定、能气化的化合物。小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物。u 液相色谱液相色谱-质谱联用质谱联用：适宜分析大分子（包括蛋白、多肽多适宜分析大分子（包括蛋白、多肽多聚物等）、不挥发、热不稳定、极性的化合物。聚物等）、不挥发、热不稳定、极性的化合物。u 毛细管电泳毛细管电泳-质谱联用质谱联用：近年发展迅速，特别对生物大分子近年发展迅速，特别对生物大分子的分类分析十分有用。的分类分析十分有用。5质谱仪包括质谱仪包括真空系统、进样系统、离子源、质量分析真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统。器、检测器和数据处理系统。真空系统真空系统Vacuum System进样系统进样
3、系统Sample Inlet检测器检测器Detector数据处理系统数据处理系统Data System质量分析器质量分析器Mass Analyser离子源离子源Ionization Source质谱仪质谱仪6u 一般质谱仪都采用一般质谱仪都采用机械真空泵（前级低真空泵）机械真空泵（前级低真空泵）预抽预抽真空，再用高效率真空，再用高效率油扩散泵或分子涡轮泵（高真空泵）油扩散泵或分子涡轮泵（高真空泵）连续地运行以保持真空。连续地运行以保持真空。u 只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达检测只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达检测器，真空度不够则灵敏度低。若真空度过低，则会造器，真空度不够
4、则灵敏度低。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离成离子源灯丝损坏、本底增高、图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。子源的调节、加速极放电等问题。真空系统真空系统u 质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须处于质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须处于高真高真空状态空状态。7进样方式：进样方式：1 直接进样直接进样2 仪器联用的进样仪器联用的进样 （GC、LC） 进样系统进样系统进样系统是将分析样品引入到离子源的装置。进样系统是将分析样品引入到离子源的装置。8 离子源离子源根据电离方式的不同，常用的有根据电离方式的不同，常用的有:电子轰击电离源电子轰击电离源
5、 electron impact ionization source, EI化学电离源化学电离源 chemical ionization source, CI快原子轰击电离源快原子轰击电离源 fast atom bombardment source, FAB电喷雾电离源电喷雾电离源 electrospray ionization source, ESI大气压化学电离源大气压化学电离源 atmospheric pressure chemical ionization source, APCI基质辅助激光解析电离源基质辅助激光解析电离源 Matrix-Assisted Laser Desorpti
6、on Ionization, MALDI 离子源将欲分析样品的原子或分子电离，得到带电离子，离子源将欲分析样品的原子或分子电离，得到带电离子，并对离子进行加速使其进入质量分析器。并对离子进行加速使其进入质量分析器。9EI源应用最为广泛，特别是气相色谱源应用最为广泛，特别是气相色谱-质谱联用仪中应用最多的质谱联用仪中应用最多的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。离子源，它主要用于挥发性样品的电离。原理：由进样系统进入的气体样品到达离子源，与灯丝发出的原理：由进样系统进入的气体样品到达离子源，与灯丝发出的电子发生碰撞使样品分子电离。电子发生碰撞使样品分子电离。电子轰击电离源电子轰击电离源 EI电子
7、轰击电离源示意图电子轰击电离源示意图10特点：特点：u谱图简单，最强峰为分子离谱图简单，最强峰为分子离子峰和准分子离子峰，碎片离子峰和准分子离子峰，碎片离子峰很少。子峰很少。u可用于负离子质谱，多数有可用于负离子质谱，多数有机化合物的负离子机化合物的负离子CI质谱图质谱图灵敏度要比其正离子的灵敏度要比其正离子的CI质质谱图高谱图高2-3个数量级。个数量级。u不适用难挥发试样。不适用难挥发试样。+气体分子气体分子试样分子试样分子+准分子离子准分子离子电子电子化学电离源化学电离源 CICI源原理：利用反应气体的离子和样品分子发生分子源原理：利用反应气体的离子和样品分子发生分子-离子反应离子反应而生
8、成样品分子离子。而生成样品分子离子。化学电离源示意图化学电离源示意图11快原子轰击电离源快原子轰击电离源 FABFAB源原理：源原理：氩气被电子轰击而电离，生成的氩离子被电子透镜氩气被电子轰击而电离，生成的氩离子被电子透镜聚焦并加速生成动能可控的离子束，经过中和器中和掉离子束所聚焦并加速生成动能可控的离子束，经过中和器中和掉离子束所带的电荷，成为高速定向运动的中性原子束，用此原子束轰击样带的电荷，成为高速定向运动的中性原子束，用此原子束轰击样品使其电离。品使其电离。特点：特点：u适用于分析大分子适用于分析大分子量、难气化、热稳定量、难气化、热稳定性差的样品。性差的样品。快原子轰击电离源示意图快
9、原子轰击电离源示意图12特点：特点： 1. 是一种软电离方式，适于分析极性强的有机化合物。是一种软电离方式，适于分析极性强的有机化合物。2. 容易形成多电荷离子，可以测量大分子量的蛋白质。容易形成多电荷离子，可以测量大分子量的蛋白质。3. 主要应用于液相色谱主要应用于液相色谱-质谱联用仪。质谱联用仪。电喷雾电离源电喷雾电离源 ESI电喷雾电离源示意图电喷雾电离源示意图ESI源原理：源原理：流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进入用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进入后端检测。后端检测。
10、13大气压化学电离源大气压化学电离源 APCICoronaNebulizer APCIHPLCinlet+特点：特点：u 属于属于“软软”电离方式，适电离方式，适于分析质量数小于于分析质量数小于2000u的的弱极性小分子化合物。弱极性小分子化合物。u 只产生单电荷离子，主要只产生单电荷离子，主要是准分子离子，很少有碎片是准分子离子，很少有碎片离子。离子。u 主要应用于液相色谱主要应用于液相色谱-质质谱联用仪。谱联用仪。大气压化学电离源示意图大气压化学电离源示意图APCI源原理：喷嘴下游放置一个针状放电电极，进行高压放电，源原理：喷嘴下游放置一个针状放电电极，进行高压放电，使空气中某些中性分子电
11、离，产生使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+ 和和O+ 等离子，等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与样品分子进行离子溶剂分子也会被电离，这些离子与样品分子进行离子-分子反应，分子反应，使样品分子离子化。使样品分子离子化。 14 MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少. 基质辅助激光解析电离源基质辅助激光解析电离源 MALDI基质辅助激光解析电离源示意图基质辅助激光解析电离源示意图MALDI源原理：待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使
12、源原理：待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。样品分子进入气相并得到电离。 15常用的质量分析器有：常用的质量分析器有：磁质量分析器（磁质量分析器（Magnetic Sector Analyzer） 四极四极杆质量分析器（杆质量分析器（quadrupole mass analyzer）飞行时间飞行时间质量分析器（质量分析器（time of flight
13、, TOF ）离子阱离子阱质量分析器（质量分析器（ion trap）质量分析器质量分析器 质量分析器是质谱仪的核心质量分析器是质谱仪的核心, 质量分析器的作用是将离子源质量分析器的作用是将离子源产生的离子按产生的离子按m/z顺序进行分离并排列。顺序进行分离并排列。 16磁质量分析器是根据离子束在一定场强的磁场中运动时，其运动磁质量分析器是根据离子束在一定场强的磁场中运动时，其运动的曲率半径与离子的质荷比和加速电压有关。是质谱仪中最早使的曲率半径与离子的质荷比和加速电压有关。是质谱仪中最早使用的质量分析器。分为单聚焦磁质量分析器和双聚焦磁质量分析用的质量分析器。分为单聚焦磁质量分析器和双聚焦磁质
14、量分析器。器。磁质量分析器磁质量分析器单聚焦磁质量分析器示意图单聚焦磁质量分析器示意图双聚焦磁质量分析器示意图双聚焦磁质量分析器示意图特特点：点：单聚焦磁质量分析器分辨率低，双聚焦磁质量分析器分单聚焦磁质量分析器分辨率低，双聚焦磁质量分析器分辨率很高。辨率很高。17传统的四极杆质量分析器是由四根笔直的传统的四极杆质量分析器是由四根笔直的棒状电极棒状电极与轴线平行并与轴线平行并等距离的置悬着构成，棒的理想表面为双曲面。等距离的置悬着构成，棒的理想表面为双曲面。在一定在一定DC/VC作作用下，只有用下，只有m/z满足一定要求的离子才能通过四极杆到达检测器，满足一定要求的离子才能通过四极杆到达检测器
15、，其他离子被滤掉。其他离子被滤掉。四极杆质量分析器四极杆质量分析器四极杆质量分析器具有重量轻、体积小、造价低廉等优点四极杆质量分析器具有重量轻、体积小、造价低廉等优点。+四极杆质量分析器示意图四极杆质量分析器示意图18用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器。度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器。Ion SourceDrift RegionDetecto
16、rReflection配离子反射镜的飞行时间质谱示意图配离子反射镜的飞行时间质谱示意图飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器特特点：点： 1）检测离子的质荷比范围非常宽；）检测离子的质荷比范围非常宽；2）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；3）扫描速度快，适合研究极快过程）扫描速度快，适合研究极快过程。19离子阱离子阱与与四极四极质量分析器的原理质量分析器的原理类似，当高频电压幅值和高频电类似，当高频电压幅值和高频电压频率固定为某一值时，只能使压频率固定为某一值时，只能使某一质荷比的离子在阱内一定轨某一质荷比的离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，道
17、上稳定旋转，改变端电极电压，不同不同m/z离子飞出阱到达检测器。离子飞出阱到达检测器。离子阱质量分析器离子阱质量分析器特特点：点：u单一的离子阱可实现多极单一的离子阱可实现多极“时间上时间上”的串联质谱；的串联质谱；u结构简单、价格便宜，性价结构简单、价格便宜，性价比高；比高；u灵敏度高；灵敏度高；u质量范围大。质量范围大。20检测器检测器电子倍增器运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表电子倍增器运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表面，使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，面，使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，使二次电子获得不断倍增，最后由阳极
18、接受电子流，使离子束信使二次电子获得不断倍增，最后由阳极接受电子流，使离子束信号得到放大。号得到放大。电子倍增器示意图电子倍增器示意图质谱仪常用的检测器有直接电检测器、电子倍增器、闪烁检质谱仪常用的检测器有直接电检测器、电子倍增器、闪烁检测器和微通道板等。测器和微通道板等。 22质谱谱图质谱谱图质谱图：质谱图：以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的图就是质谱图。质荷比为横坐标所作的图就是质谱图。质荷比：质荷比：离子质量（以相对原子量单位计）与它所带电荷离子质量（以相对原子量单位计）与它所带电荷（以电子电量为单位计）的比值，写作（
19、以电子电量为单位计）的比值，写作m / z 。峰：峰：质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰。离子丰度：离子丰度：检测器检测到的离子信号强度。检测器检测到的离子信号强度。基峰：基峰：在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰。峰称作基峰。总离子流图总离子流图:在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图或扫描次数所作的图,也称也称TIC图图.TQ-S的结构示意图的结构示意图23进样方式进样方式直接进样：直接进样：（使用注射泵）（使用注射泵
20、）LC液流不经过色谱分离：自动定量环进样至液流不经过色谱分离：自动定量环进样至LC液流（使用注液流（使用注射泵）；射泵）；手动定量环进样至手动定量环进样至LC液流；液流；进样至进样至LC液流（使用注射泵）；液流（使用注射泵）；自动进样器进样至自动进样器进样至LC液流液流LC流路经过色谱分离：流路经过色谱分离： 自动进样器经自动进样器经LC液流进样到色谱柱液流进样到色谱柱24扫描类型扫描类型一、全扫描一、全扫描在指定的扫描时间内，质量分析仪不间断地从第一个质量数在指定的扫描时间内，质量分析仪不间断地从第一个质量数扫到最后一个质量数，提供分析物的完整质谱，用于确认未知化扫到最后一个质量数，提供分析
21、物的完整质谱，用于确认未知化合物。合物。二、选择的离子监控（二、选择的离子监控（SIM）可监控某个离子或一组离子，适用于已知目标化合物分析，可监控某个离子或一组离子，适用于已知目标化合物分析，探测复杂混合物中的微量目标化合物时很有用。探测复杂混合物中的微量目标化合物时很有用。三、选择反应监控（三、选择反应监控（SRM）可监控某个反应或几组反应，如离子的裂解或中性基团丢失。可监控某个反应或几组反应，如离子的裂解或中性基团丢失。四、自动四、自动SIM质谱仪会在预扫描中自动选择最强烈的质谱仪会在预扫描中自动选择最强烈的m/z值，为它们建立值，为它们建立一个一个SIM扫描列表，然后采集和记录这些选定质
22、量的离子。可在扫描列表，然后采集和记录这些选定质量的离子。可在任何模式中的全扫描上执行。任何模式中的全扫描上执行。正、负离子模式的选择：正、负离子模式的选择：选择的一般原则为： 正离子模式：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。 负离子模式：负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。流动相的选择流动相的选择 LCMS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷
23、雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸铵10一5 mmol/l。 送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。流量和色谱柱的选择流量和色谱柱的选择 不加热ESI的最佳流速是150ulmin，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm内径的微柱，TIS源最高允许lmlmin，建议使用200400ulmin APCI的最佳流速lmlmin，常规的直径4.6mm柱最合适。 为
24、了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。辅助气体流量和温度的选择辅助气体流量和温度的选择 雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。 选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。29避免使用的溶剂添加
25、剂避免使用的溶剂添加剂（1）碱金属卤化物及其酸溶液）碱金属卤化物及其酸溶液 (如：碘化锂、氯化钾、氯化如：碘化锂、氯化钾、氯化钠、盐酸、氯仿等钠、盐酸、氯仿等)。（2）有机胺，尤其三乙胺会影响正离子模式离子化。）有机胺，尤其三乙胺会影响正离子模式离子化。（3）三氟乙酸，会影响负离子模式离子化。）三氟乙酸，会影响负离子模式离子化。（4）含过氧化物或者可能含有过氧化物的色谱纯醚，如）含过氧化物或者可能含有过氧化物的色谱纯醚，如THF、二氧六环、二丙基乙醚。二氧六环、二丙基乙醚。（5）禁用：强酸、强碱、不挥发性酸及相应的盐（如磷酸盐、）禁用：强酸、强碱、不挥发性酸及相应的盐（如磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸
26、盐等）、表面活性剂（如硼酸盐、柠檬酸盐等）、表面活性剂（如SDS）、离子对试）、离子对试剂、含强络合剂的溶液（如剂、含强络合剂的溶液（如EDTA）。）。LC-MS中常见的本底离子中常见的本底离子 m/z 50-150, 溶剂离子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 m/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 m/z 316, 2mm 离心管的产生的特
27、征离子 m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子 m/z391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843 m/z413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668 m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793 在质谱仪测定的质量范围内，由离子的在质谱仪测定的质量范围内，由离子的质荷比和其相对丰度构成质谱图。质荷比和其相对丰度构成质谱图。质谱中的图质谱中的图总离子流图总离子流图:在选定的质量范围内，所有离在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图子强度的总和对时间或扫描次数所
28、作的图,也称也称TIC图图.32分子离子：分子离子：样品分子失去一个电子而形成的单电荷离子，它样品分子失去一个电子而形成的单电荷离子，它代表样品的分子量。代表样品的分子量。准分子离子：准分子离子：指与分子存在简单关系的离子，通过它也可以确指与分子存在简单关系的离子，通过它也可以确定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是M+H+，M-H ，M+Na+等。等。碎片离子：碎片离子：分子离子或准分子离子裂解生成碎片离子，碎分子离子或准分子离子裂解生成碎片离子，碎片离子还可能进一步裂解成质量更小的碎片离片离子还可能进一步裂解成质量更小的碎片离子，碎片离子是解析质谱图，
29、推断分子结构的子，碎片离子是解析质谱图，推断分子结构的重要信息。重要信息。质谱中的离子质谱中的离子33 质谱中的离子质谱中的离子母离子与子离子：母离子与子离子：任何一个离子进一步裂解为质荷比较小的离任何一个离子进一步裂解为质荷比较小的离子，前者是后者的母离子或前体离子，后者是子，前者是后者的母离子或前体离子，后者是前者的子离子。前者的子离子。同位素离子：同位素离子：由元素的重同位素构成的离子。各种元素的同由元素的重同位素构成的离子。各种元素的同位素基本上按照其在自然界的丰度比出现在质位素基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中，有利于确定化合物及碎片的元素组成。谱中，有利于确定化合物及碎片的元素组成。亚稳离子：亚稳离子：由离子源到检测器的飞行途中裂解的离子。可由离子源到检测器的飞行途中裂解的离子。可以指示离子产生的途径，对结构判断很有用。以指示离子产生的途径，对结构判断很有用。34 质谱中的离子质谱中的离子单电荷离子：单电荷离子：带有带有1个电荷的离子，个电荷的离子，z=1。多电荷离子：多电荷离子：带有带有2个或更多电荷的离子，如个或更多电荷的离子，如 z2。奇电子离子（奇电子离子（OE）：）：带未成对电子的离子，以符号带未成对电子的离子，以符号“+”表示。表示。偶电子离子（偶电子离子（EE）：）：外层电子完全成对的离子，以符号外层电子完全成对的离子，以符号“+” 表示。表示。
