1、0218生物3D打印一、生物3D打印概述二、3D打印骨组织工程支架三、3D打印皮肤四、3D打印人造血管五、组织、器官修复应用六、讨论Contents生物3D打印概述011120将生物材料或生物单元(细胞/蛋白质等)按仿生形态学,生物体功能,细胞特定微环境等要求用增材制造的方法制造出具有复杂结构,功能和个性化的生物材料三维结构或体外三维生物功能体。制造学拓展延伸单一结构材料、功能材料生物材料、生命体材料多学科交叉融合工程+材料+信息+生命科学 生物3D打印定义材料、学科范畴传统增材制造粉末胶水生物增材制造生物构造块 活体组织。两个喷头：生物墨水 生物纸生物墨水培养基（含人体细胞）打印的时候能够悬
2、浮细胞使之在纸上精确定位，把墨水分布在纸上的时候又要能分解成液体生物纸水凝胶，用作细胞生长的支架。 打印完一圈“生物墨”细胞以后,接着打印一张“生物纸”凝胶高精度：即分辨率高。该技术可以精确控制墨水喷射位置和墨水的量，有利于生物显微结构的建立，有利于局部痕量供给生物活性因子及药物，从而有利于控制组织的局部生长发育可以同时打印种子细胞和支架材料，更利于整体三维结构的构建。其可以使用多颜色墨盒的原理，从而实现同时打印组织/器官内的不同组分，使用不同的细胞、细胞外基质和生物活性因子，并且使用精确的配比构建速度快：能够快速的制造生物组织/器官，保证了生物材料的存活率，从而显著有利于再生医药、器官移植等
3、未来医学领域。可以按需制造出符合个体需求的单个器官或组织,真正实现医学的个性化需求。3D生物打印使用的种子细胞是来自患者自己身体的细胞,所以可以从根本上解决其他组织工程易发生的排异反应。国外韩国2009年,浦项科技大学的Lee和Cho在生物制造领域使用微型SLA技术生产组织支架。英国诺丁汉大学Sawkins教授细胞和蛋白兼容生物打印制造机械性强度结构用骨修复美国哈佛大学Kolsky教授基于生物3D打印构造出异构细胞结构的血管国内杭州电子科技大学徐恩铭自主研发生物3D打印机清华大学徐弢教授利用心肌细胞和生物材料模拟打印动物心脏四川大学康裕建教授利用Rollovessller3D打印平台，以生物墨
4、水结合其他材料打印后培育生成了具有生理功能的组织结构西安交通大学李涤尘教授2018年其研究成果“个性化下颌骨重建假体”产品获得了国内首个个性化产品CFDA注册，成为我国3D打印技术医学走向产业化的里程碑四个层次：第一层次:医疗模型和体外医疗器械的制造第二层次:永久植入物的制造生物相容,但非降解的材料第三层次:组织工程支架的制造生物相容且可降解的材料第四层次:体外生物结构体的制造细胞,蛋白及其它细胞外基质皮肤的生物3D打印仿生耳朵的3D打印肾脏的生物3D打印血管的生物3D打印3D打印骨组织工程支架0211203D打印骨组织工程 根据患者损伤部位的 CT、磁共振（MRI）等成像数据结合3D打印制造
5、技术，快速精确地制造具有个性化的骨组织工程支架，还可以利用 CAD 技术设计任意形状，任意孔道结构的三维支架，甚至可以在骨损伤的部位开展原位细胞打印修复。打印过程概括 将设计好的骨组织工程支架模型导入连接 3D 打印机的计算机内，利用 FDM 打印机将3D 打印线条打印成设计好的骨组织工程支架。采用不同参数对模型进行打印，在打印过程中仔细观察打印机进料、出丝是否顺畅以及填充是否有效等方面来确定最佳打印参数。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架聚己内酯具有优异的生物相容性和生物可降解性，已经获得FDA 认证可以用于临床，目前已经被广泛应用于骨组织工程支架的研究。牡蛎壳是天然形成的含有丰富氨基酸和微量
6、金属元素的矿物质盐的生物活性材料。牡蛎壳具有低免疫原性、良好的生物相容性、可降解性、骨传导性以及成骨性能。牡蛎壳粉与聚己内酯的结合可以提高支架的骨诱导能力。将聚己内酯颗粒和牡蛎壳粉在 40的干燥箱中干燥 24 小时，备用。按表中的比例称取聚己内酯颗粒和牡蛎壳粉，机械搅拌混合均匀后，加入到双螺杆挤出机进料筒内，以 40rpm/min 的喂料速度投料到双螺杆挤出机中挤出。对挤出样条进行冷却定型，然后进行造粒，造好的粒料进行烘干。123将粒料投放到 3D 打印线材专用挤出机加工成细丝，挤出温度为 80，得到直径为 1.750.2mm 的 3D 打印线材。用 Solidworks 软件设计三维多孔骨组
7、织工程支架模型，如图。采用这种隔层交叉的方式设计模型并打印出PCL/HA 三维骨组织工程支架，采用这种设计的支架可以获得较小直径的孔洞结构以及较大的孔隙率，实验证明这种空间结构更加有利于细胞粘附和增殖。45得到的打印线材经由3D打印机打印出计算机辅助设计的复合支架，3D打印机打印参数设置如下：打印温度：150，热床温度：37，挤出头移动速度：50rpm/min，挤出速度：120rpm/min。制得含有不同比例牡蛎壳粉的聚己内酯/牡蛎壳粉复合三维多孔骨组织工程支架。6形貌表征热分析孔隙率测定红外光谱测试力学性能测试聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的表征体外降解测试体外蛋白吸附能力测试细胞毒性测试
8、体外溶胀性测试体外矿化能力测试聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的表征3D打印骨组织工程支架021120聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的表面和断面形貌图支架的形貌和孔洞是评价骨组织工程支架的重要参数，具有大小合适、相互贯通的三维孔洞结构的骨组织工程支架，对骨细胞和新生组织在支架上的生长有明显的促进作用。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的表面和断面形貌图表面低倍全貌聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的表面和断面形貌图表面SEM形貌聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的表面和断面形貌图断面SEM形貌聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的表面和断面形貌图由图可知，所有支架具有齐整的表面形态，都呈多孔性，具有高
9、度规则，相互贯通的三维孔洞结构，十分有利于细胞粘附和新骨组织的形成。从断面SEM图可知，牡蛎壳粉在支架中分布均与，高含量的牡蛎壳粉在支架中出现了团聚现象。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的力学性能骨组织工程支架应该具有一定的力学强度，而且还应根据不同骨缺损部位原位骨组织的力学强度的不同而改变。支架的力学强度过大会削减骨生长所需的正常应力，造成“应力遮挡”，可能导致骨质疏松。理想的骨组织支架应具有骨缺损部位相适应的力学强度。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的力学性能聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的压缩强度聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的力学性能从图中可以看出支架压缩强度在8-12MPa之间，
10、松质骨的压缩强度在1-20MPa，支架的力学强度和松质骨的力学强度相匹配，满足松质骨修复的要求。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的体外降解性能组织工程支架要具备与植入部位相匹配的生物可降解性能，而且支架在降解过程中不能产生对组织有害的物质，不能破坏修复组织的内环境。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织在体外完全降解大概两年以上。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的蛋白吸附能力支架材料对蛋白的吸附能力是用来修复支架的重要指标之一。支架的蛋白吸附能力越强就越有益于细胞和新生组织在其上面的增殖和生长。聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的蛋白吸附能力聚己内酯/牡蛎壳粉骨组织工程支架的蛋白吸附能力由图可知，含有牡蛎壳粉
11、的支架的蛋白吸附能力比单纯的聚己内酯支架有明显的提升。而且随着牡蛎壳粉含量的增加，支架蛋白吸附能力也增加。3D打印皮肤031120一、简介二、打印技术三、打印过程四、制约因素Contents 3D打印技术与生命科学相结合为创建人工器官、组织打开了一扇门，而创建人工皮肤是这些学科所探索的其中一个应用方向。3D打印的人工皮肤或将改变烧伤患者的皮肤修复治疗方式与化妆品研发过程中所需的测试方式。3D打印皮肤 新加坡制造科技学院的最新一项研究成功地将3D生物打印的不同层细胞叠加在一起。新加坡制造科技学院所创造的打印方法通过喷墨的方式来进行3D打印。新加坡研究学者将着色细胞、黑素细胞，角化细胞和纤维母细胞
12、（后两者为制造皮肤必不可少的细胞种类）结合在一起。他们利用RegenHu生物工厂打印系统，将充满细胞的3D打印墨水通过滴状融合的过程打印出来。这种结合的方式不仅促成了三种细胞种类的结合，还能以此来控制打印皮肤的毛孔大小。通过改变3D打印胶原质和纤维母细胞的矩阵模型来实现多级孔结构，让其看起来更像原生皮肤。挤出-喷墨混合打印技术研究者们采用了一种混合3D打印方式，所谓的混合也就是使用多个打印头，将挤出式3D打印挤出头和喷墨式3D打印喷头同时使用。该制作流程一共需要4个打印头A打印头是一个挤出式的打印头，用来打印作为支撑材料的水凝胶材料。（该材料在细胞孵化期之前会被去除）B打印头是用来打印聚已内酯
13、的，之前介绍过，聚已内酯在打印过程中是用来做网状支撑结构的。（也就是整个打印结构的骨架）C打印头用来打印包含胶原蛋白（皮肤当中的主要结构蛋白）的生物墨水材料的。D打印头是一个喷墨式3D打印喷头，用来打印角质细胞。（人体表皮组织当中最重要的细胞类型，它是一道用于保护真皮组织的屏障通过逐层打印方法，3D打印的结果创造出了半稳固的皮肤样品。3D打印的皮肤不仅在制药和化妆品检测方面具有价值，还可以为烧伤或事故受害者提供皮肤移植物来改变身体状况。目前工程皮肤构造已被用于这些方向，但它们不具有天然皮肤的许多特征，如毛囊，汗腺和色素沉着。这四个打印头依次按照如下的打印流程进行打印，得到我们所需要的皮肤组织：
14、1、B打印头打印聚已内酯底层框架2、A打印头打印水凝胶支撑3、如此一层一层向上往复4、B打印头挤出聚已内酯隔膜5、C打印头打印出真皮层（包含角质蛋白）的生物墨水，同时B打印头打印边缘的聚已内酯外墙结构，从而围住内部的可流动结构6、D打印头打印最上层的表皮结构（角质细胞）7、打印过程结束，去除底部的水凝胶支撑材料，加入增殖培养基，使结构完全浸入其中，于37环境下培养3天8、之后加入分化培养基，通过气-液交界面培养的方式进行培养，最终使皮肤组织成熟打印示意图上图左为通过3D打印手法得到的细胞致密度，右为通过传统手工手法得到的细胞致密度。通过对比，可以发现通过3D打印手法得到的细胞结构相较于传统手法
15、更加紧密，也就意味着其相较于传统手法，能够获得更精确的组织形体，同时又能够在培养过程中较好地保持形体。皮肤生物打印流程皮肤生物打印流程和传统技术的比较 材料的研究与发展限制着技术的发展，适用于 3D 打印技术的生物材料将成为未来的研究热点。生物材料打印出的结构应具有足够的机械强度以持其形状和植入后所承受的外部应力。就喷墨成型技术而言，水凝胶作为材料基质，为了防止打印过程中堵塞喷头，生物墨水需要保持较低的粘度，因此具有较低的机械性能，这又不利于打印结构的成型。所以适合于 3D 打印技术的生物材料的研发一直面临着巨大的挑战。未来的发展将需要把重点放在新型生物材料的研发上，研发出具有适当机械性能、扩
16、散系数、生物相容性的材料，为3D 打印技术的医学应用奠定重要的基础。 提高 3D 打印技术的成型分辨率是其医学应用的另一研究方向。组织和器官的结构复杂，复杂的内部结构中含有多种类型的细胞，分辨率在微米级别因此提高 3D 打印技术的成型分辨率将是医学应用的一大难题。目前，喷墨成型技术的成型分辨率最高能达到 50m，而光固化成型技术的成型分辨率最高，能高达 20m。但此分辨率仍不能制造出内部结构复杂的组织和器官，因此医学应用的 3D 打印技术的成型分辨率仍有待进一步提高。3D打印人造血管041120重大事故受伤、大面积烧伤或肿瘤切除的病人经常需要对创面皮肤进行再造，目前的医疗技术只能对皮肤表层厚度
17、(真皮和表皮)不超过200m进行人工再造，而对包括皮下组织的几毫米厚完整皮肤系统还不能进行再造。因为涉及到血管组织，没有血管的养分供应，超过200m的人造皮肤就没法存活。为此，德国弗朗霍夫激光技术研究所牵头的跨学科团队承担了欧盟项目“ArtiVasc3D”，开发出3D打印技术制造人造血管。 视频：德国：3D技术“打印”人造血管3D 打印制造血管的关键是要找到合适的打印材料，其适合作为移植血管的物理特性和生物相容性，必须与内皮和毛细血管周围细胞组织相容，以及适合于3D打印的可加工特性。研究人员采用喷墨打印与立体光刻相结合的方法，打印出只有 20m 厚的多孔、多分叉人造血管。人造血管多分叉结构借助
18、于计算机的模拟设计，完全按照真实的血管结构打印。打印血管所用的材料是丙烯酸酯基的合成聚合物。这种材料可以使血管表面分布许多直径数百微 米的微孔。利用这种材料，研究人员首次成功地打印出了与真实血管功能类似的人造血管。 CU Boulder工程师开发了一种3D打印技术，可以重现血管的复杂几何形状，并且有朝一日可用于生产人造动脉和器官组织。这种3D打印方法允许对对象的坚固性进行局部控制。它具有细粒度，可编程的刚性控制，使研究人员能够模拟高度结构化但仍必须保持柔韧的复杂血管几何形状。通过严格控制氧气迁移及其随后的光照，研究人员可以自由地控制物体的哪些区域固化为更硬或更柔软 ，同时保持整体几何形状相同。
19、3D打印的复杂对象的SEM图像图b：氧抑制辅助印刷，其中固化区物理地限制在固化区域和氧气抑制层之间。 图c：不同紫外线照射剂量下双键转化率的深度分布。当剂量高于阈值时，双键转化率随剂量迅速增加。 3D打印的复杂对象的SEM图像图d：印刷水牛徽标的明场光学图像，具有独立图案的刚度和几何形状（二元刚度但平坦的表面）。高光学对比度表明交联密度的强烈差异。图e：沿b中虚线的光学对比度（黑线）和几何（蓝线）变化的量化显示对比度（刚度）的明显差异，但特征高度变化很小（1）在四川华西医院再生医学研究中心对一只恒河猴做了实验手术，科研人员将一段3D生物打印血管移植到猴子体内，猴子的基因和身体结构和人类比较接近
20、，选择的部位是猴子的腹主动脉，这段动脉的内径是6mm和人体下肢的动脉血管粗细相当。全球首创的3D生物打印血管和第一台3D血管打印机这台3D生物打印血管机可以打印出血管独有的中空结构和多层不同种类的细胞。在打印前要建立一个三维模型，三维模型的数据来源于CT和核磁共振，数据通过云平台完成三维图重建和渲染。然后选取一段要打印的血管，通过3D生物打印机打印出独特的和具有生物活性的组织和器官。打印喷头里喷出的无色墨汁是构成血管的关键材料，科研人员将其命名为生物砖，在生物砖的外面再打印出包裹材料。生物砖的大小比头发丝的直径还要小，直接取自人体的干细胞，经过精心培养后构成血管的基础材料。生物砖的外面是有保护
21、功能的外壳，里面就是人体的干细胞，根据不同组织的需求每个生物砖里放置十几个到上千个干细胞，经过培养增殖，培养好的血管直接移植到体内。组织、器官中的修复应用051120一、引言二、生物打印技术三、生物墨水四、三维生物打印趋势Contents组织和器官病变、创伤和正常生理功能衰竭是人类医学面临的最棘手的问题之一。临床统计数据显示，美国医院每年能完成 800 万例次组织移植手术，但并不能保证成功挽救每一条生命或避免残疾。此外，每年大约有 4 000 人在等待合适的器官时死亡，近 10 万人在未被列入等待器官移植时就已死亡。可见，组织或器官缺损的修复和功能重建是现代医学领域所面临的亟待解决的重大挑战。
22、虽然使用3D技术构建结构仿生的组织工程支架取得了令人称赞的结果，但这些技术的成型条件苛刻，如高温、紫外光照及有机溶剂等，不利于生长因子甚至细胞参与支架的构建。而且种植于支架的细胞往往游离在支架表面，难以长入支架内部，如何将细胞精确有序地排布在三维支架上，实现自然组织结构和功能，一直是限制组织工程发展的科学问题之一。生物打印是指能够将细胞、生长因子和支架结合在一起形成一个完整的整体结构，同时能够实现不同类型的细胞在支架内部的准确定位，通过细胞、生长因子以及支架之间的相互作用，实现组织功能化。挤出成型是将流体沉积技术与自动化三维打印技术相结合，通过挤压技术实现材料的三维结构打印。喷墨生物打印是选择
23、成分为培养基或者水凝胶的生物墨水，以液滴的形式精确地打印在接收平台的凝胶基质上，随后固化。激光辅助生物打印可分为两个类别，一是细胞打印使用激光对生物墨水进行局部加热，形成高压气泡，导致射流形成；二是过程涉及光聚合的成型技术使用细胞相容性较好的光敏聚合物作为打印材料，通过紫外光交联的形式精确控制交联区域，得到精确度较高的三维打印支架。在人工组织或器官制造过程中，生物墨水主要承担了构建三维结构和重建组织的功能，即让活体细胞按照预先设计好的形状来生长。因此，生物墨水合适与否直接决定生物三维打印技术能否应用于临床。3D打印技术在制备组织工程支架中具有无可比拟的优势。其中，生物打印技术可将细胞精确排布于
24、支架的内部，为细胞提供了类似细胞外基质的生长环境，使得复杂组织和器官的体外培育成为可能。与传统的3D打印技术相比，3D生物打印技术具有明显的优势。单一材料构成的生物墨水在可打印性、可交联性、力学性能和诱导干细胞增殖分化等方面往往难以满足组织和器官打印的要求。且与打印技术相比，生物墨水的组成对支架的成型和性能至关重要。因此，目前的研究重心在于研究各方面性能更好的生物墨水。相对于天然生物材料，人为设计的生物相容性聚合物水凝胶具有更好的力学性能和交联性能。N-丙烯酰基甘氨酰胺单体具有快速光交联的特性，通过复合黏土颗粒的3D打印支架被应用于骨组织修复。该支架具有很好的应变恢复性能和高度稳定性，同时黏土释放的镁硅离子有利于干细胞的成骨分化.讨论061120打印皮肤打印骨组织人造血管3D打印组织修复谢谢大家谢谢大家
