1、1分子生物学分子克隆技术23n 基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。n 基因工程的基本特点是，分子水平基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。操作，细胞水平表达。4n 重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。n 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。基因工程的核心技术是DNA重组技术5n分子克隆
2、技术分子克隆技术 又称为重组又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。体外操作程序。 供体、受体、载体是重组供体、受体、载体是重组DNADNA技术的三大基本元件。技术的三大基本元件。6 重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在
3、受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。7n 获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。8细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序9l 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。10基因工程的工具酶基因工程的工具酶“手术刀手术刀” 专司切割之职，内切酶专司切割之职，内切酶
4、“缝纫针缝纫针” 具有连接之功，连接酶具有连接之功，连接酶“复印机复印机” 行使复制之责，行使复制之责，DNA聚合酶聚合酶11(“交通工具车子交通工具车子”)载体载体n有了切割与缝合（有了切割与缝合（ligase）基因基因DNA的工具，还得的工具，还得有一个有一个“车子车子”将重组将重组DNA送到宿主细胞中去。送到宿主细胞中去。 12逆转录酶逆转录酶使真核基因的制备成为可能。使真核基因的制备成为可能。 （1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。 （2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表
5、达系统剪接出在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的没有成熟的mRNA就不就不能得到相应得产物。能得到相应得产物。 （3）经过逆转录）经过逆转录mRNAcDNA (complementory DNA)得得到的到的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。隆就方便得多。 13四、分子克隆的技术支撑四、分子克隆的技术支撑n核酸凝胶电泳技术n核酸分子连接技术n细菌转化技术nDNA序列分析技术n寡核苷酸合成技术n基因定点突变技术n聚合酶链反应（PCR）技术nDNA序列测定技术14核酸凝胶电泳核酸凝胶电泳15细菌转化技术细菌转化技术（包括感受态
6、细胞制备）（包括感受态细胞制备）16聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）技术）技术17大规模生产生物活性物质大规模生产生物活性物质野生细胞野生细胞分离工程酶分离工程基因工程蛋白质工程途径工程工程细胞发酵工程酶工程细胞工程生物活性物质1819 用携带了外源基因的农杆菌用携带了外源基因的农杆菌TiTi质粒转化植物原生质粒转化植物原生质体，发育成具有新性状的完整植株质体，发育成具有新性状的完整植株转基因植物。转基因植物。 20基因工程的工具酶基因工程的工具酶“手术刀手术刀” 专司切割之职专司切割之职“缝纫针缝纫针” 具有连接之功具有连接之功“复印机复印机” 行使复制之责行使复制之责内切酶内切酶连接酶
7、连接酶聚合酶聚合酶21内切酶内切酶“手术刀手术刀” 专司切割之职专司切割之职“缝纫针缝纫针” 具有连接之功具有连接之功“复印机复印机” 行使复制之责行使复制之责内切酶内切酶连接酶连接酶聚合酶聚合酶22内切酶23同裂酶(Isoschizomers）24同尾酶25星活性*n所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。 nDifferences which can lead to star activity include low
8、ionic strength, high pH, and high ( 5% v/v) glycerol concentrations.nHigh Fidelity (HF) Restriction Enzymes can be used to reduce star activity.2627DNA聚合酶nTaq酶用Taq酶扩增DNA时常使片段3端凸出一个A。nPfu酶产生平末端产物。28连接酶nT4 DNA Ligase (invitrogen)16C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。29基因工程的载体-用于扩增30克隆载体必备条件克隆载体必备条件（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗性基
9、因（3）具有若干限制酶单一识别位点（4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。31表达型基因工程的载体-以PET32为例32多克隆位点33宿主n要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子34目的产物目的产物目的基因不溶性的高效表达n过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。n举例：胰岛素与-半乳糖苷酶形成包涵体n优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。n缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的n适合：不需要翻
10、译后修饰的蛋白质产物35目的基因的高效分泌表达n概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外n优点： 防止宿主菌对表达产物的降解；有利于蛋白质正确折叠，形成天然构象减轻宿主细胞代谢负荷有利于分离n需要在质粒设计时加入一段信号肽基因36基因克隆操作过程37克隆示意图38克隆示意图39克隆技术流程n分n切n连n转n筛40分n分离（来自生物组织）、扩增（设计引物，PCR扩增）nmRNA-DNA-扩增41引物设计与订购n酶切位点双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液。n引物订购42保护碱基431.用限制性酶消化限制性酶消化 DNA 样品样品44单酶切45双酶切46选择合适的双酶切缓冲
11、液472.用限用限制性内制性内切酶消切酶消化化质粒DNA 483.连接样品DNA和质粒DNA的消化产物49连接前最好要定量n连接比例摩尔比例为：插入片度：质粒=10:1-5:1为佳。n质粒几十个ng为佳。50双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末
12、端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。51冷循环器524.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞n转化细菌有两个基本方法。一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体；二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。53用氯化钙化学转化用氯化钙化学转化54用氯化钙化学用氯化钙化学转化55电激转化电激转化56一个电激转化程序n加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细菌中n将混合物放入一个预冷的电激杯中n施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8 to 12msn立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡
13、 2-4 小时。分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有抗菌素的LB 琼脂平板上， 保温培养1天。 575. 细菌在加有在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选n连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连；三是要插入的序列与质粒相连。第一种连接结果没有菌落形成。第二种连接结果表现为蓝色菌落。只有后一种结果是符合需要的，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。 58灭菌器59加IPTG和X-GAL60倒平板61 互补互补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 62筛选结果n蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的 L
14、acZ序列编码的功能性的功能性的 片段。片段。n白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上 LacZ序列上有上有插入片段。插入片段。63乳糖和诱导物IPTG的化学结构 64X-galnX-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。65X-gal水解66筛选结果模式图67蓝菌落n建议用DH5做宿主菌。 68蓝白菌落69电泳仪70n经过双酶切、PCR等鉴定，送阳性克隆测序。n提取正确的克隆菌中的质粒，转入表达型的菌株，如BL21等。诱导表达蛋白71鉴
15、定方法72 PCR鉴定鉴定73 原位杂交原位杂交74鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫学方法免疫学方法 75蛋白质的纯化76谢谢！77多利诞生的过程多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。助和启发。 多利诞生的过程：多利诞生的过程： 1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。 2.取出第二
16、只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因（基因（“掉包掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。 3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样）将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。，最后产下多利。 这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。 787980目的基因高效表达规律目的基因高效表达规
17、律1.目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式2.对于翻译后需要修饰蛋白质结构，能够进行目的蛋白结构修饰的表达方式3.能够将目的蛋白分泌到细胞周质、特别是分泌到细胞外的分泌型表达方式4.降低不含目的基因细胞的比例，保持目的基因的稳定性，使目的基因在宿主细胞内长时间超持和表达5.通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞，提高细胞密度6.在宿主细胞选择、质粒构建、培养基设计都应该考虑有利于产物的分离提纯81n概述n基因克隆工具酶n基因克隆载体n目的基因的分离n基因克隆操作过程n目的基因在宿主中的表达82CIAP去除5磷酸外源DNA限制性内切酶酶切5P3OH5P3OH5P5P3OH3OHT4连接酶连接5OH5OH3 OH转化E.Coli限制性内切酶酶切载体多克隆位点3 OH筛选重组子，测序
