1、基因诊断、PCR、测序等介绍罗俊明2013年6月PCRPCR技术l聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR，是一项在短时间内采用两引物大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。l每个循环之后，模板量为原来的2倍。它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。PCR原理阈值线（阈值线（Threshold）基线以上，阴性对照以上，与对数期相交，尽可能靠近基线。基线（基线（Baseline）本底，无扩增区域，一般为315Ct值之间Ct值值荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。PCR原理Y=AX+B线性的一次方程直线。常用指标有斜率(A)，截距(B)
2、，相关系数(R)一般A在-3.5-2.8之间，B在44，R无限接近于1，0.95PCR原理PCR原理实质就是体外基因复制技术原理实质就是体外基因复制技术MgMg2+2+dCTPdCTPdGTPdGTPdUTPdUTPdATPdATPTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 AmpEraseAmpErasePrimerPrimer靶序列靶序列加热变性加热变性95 95 C C靶序列引物退火靶序列引物退火55 55 C C引物延伸引物延伸72 72 C C双链解开引物与单链结合DNA复制PCR原理TaqManTM技术技术535353RQ53Taq3QR5533QTaqR553QTaqR35533Q
3、TaqR5lR引物探针Taq酶激发光源带荧光标记的单链DNAQ=淬灭基团R=报告基团在同时有淬灭和报告基团时不发光，Q与R分开时发光PCR 扩增模式图荧光PCR技术原理DNA双链双链正向引物正向引物反向引物反向引物第一轮扩增第一轮扩增Taq酶酶Taq酶酶n轮扩增轮扩增AX2n定量PCR技术原理之一荧光探针荧光探针内标控制系统（Hex、Cy5） 内标选取与靶基因无相关性的序列内标选取与靶基因无相关性的序列设计引物探针，设计引物探针，可在可在VIC通道检测荧光。通道检测荧光。利用全自动荧光利用全自动荧光PCR检测仪检测上述荧检测仪检测上述荧光信号，如反应体系正常，在光信号，如反应体系正常，在VIC
4、通道检通道检测结果将显示典型的测结果将显示典型的S型荧光增长曲线，型荧光增长曲线，反之则不显示反之则不显示S型荧光增长曲线。型荧光增长曲线。内标控制系统内标控制系统 (internal control)内标内标靶基因靶基因内标质控的作用 与靶基因无关与靶基因无关DNA或或RNA作为内标与作为内标与靶基因同步扩增，即在同样的反应条件下，靶基因同步扩增，即在同样的反应条件下，在一个反应试管内同步扩增一段靶基因序在一个反应试管内同步扩增一段靶基因序列和另一无关的内标序列，可纠正检测过列和另一无关的内标序列，可纠正检测过程中出现的假阴性，甚至是不同反应管间程中出现的假阴性，甚至是不同反应管间出现的差异
5、。出现的差异。定量标准品定量标准品l提供样品定量的标尺，通过直线拟合后定出 样本浓度l溯源至中国药品生物制品检定所 国家参考品扩增曲线荧光阈值Ct值扩增曲线荧光阈值Ct值Ct值的重现性CtCt值的代表意义值的代表意义 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率在扩增产物达到阈值线时，XCt=X0(1+Ex)Ct =N (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0 (1+
6、Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:logX0= -= -log(1+Ex)*Ct+log N (3) Ct= -= -1/log(1+Ex)*logX0+log N/log(1+Ex) (4)结论：结论：Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增到达阈值的循环数就可计算出样品中所含的模板量。定量反应性的确认l采用UDG 酶 和 dUTP 37摄氏度，UDG酶能水解掺有dUTP的DNA模板，达到消除污染的目的。l组分的高度集成，按比例混合，易于操作常见PCR仪器ABI Prism 7000/7300/7500/7500fast光源：卤素灯检测：四色荧光（CCD）可以检测：SYBR-Green
7、，FAM， HEX，TET，TAMRA， VIC最大样本量：96ROCHE LightCycler光源：发光二极管(LED)检测：6(荧光计）可以检测：SYBR-Green，FAM，HEX，VIC， LightCycler红色染料最大样本量：32 常见PCR仪器ABI StepOne/StepOnePlus光源：发光二极管(LED)检测：光敏二极管（PMT）可以检测：SYBR-Green，FAM， HEX，TET，TAMRA， VIC最大样本量：48/96可设置梯度温度，相邻5以内Roche 480光源：疝灯检测：冷CCD可以检测：SYBR-Green，FAM， HEX，TET，TAMRA，
8、VIC最大样本量：96/384常见PCR仪器Mx3000pRotor Gene 3000MJ Opticon 2BioradCFX96PE5700Bioneer细胞膜4 基因诊断3 免疫学诊断临床诊断细胞核DNA转录 mRNA翻译蛋白质1 形态学诊断2 生化诊断分子诊断分子诊断基因诊断的物质基础及基因诊断的物质基础及与与其它诊断方法的区别其它诊断方法的区别广义的分子诊断包括临床生化、免疫和核酸检测，但目前主要指用各种生物学技术检测样本当中的遗传物质（DNA &RNA），诊断疾病、判断预后，监测和指导治疗效果。分子诊断定义PCR检测方式的演变29应用领域的拓展30分子诊断技术的特点演变n 由确认
9、疾病到预防疾病n 从以治疗为导向到与治疗互进n 单一渠道到多渠道31诊断的对象n基因的有无n基因的表达水平（RNA）n基因的变化（拷贝数变化、重排，缺失，突变导致的多态性）32分子诊断未来趋势自动化自动化标准化标准化检测指标多元化检测指标多元化无创性无创性时效性时效性33总结1PCR仍然是目前分子诊断领域最为有力的技术手段。荧光PCR技术已经成为临床诊断广泛应用的工具。2 PCR的重要组分包括模板、酶、引物（探针）、镁离子和缓冲液。任何一个组分出现问题都会导致PCR反应的失败。3 PCR 试剂盒除了PCR反应必需的组分外，还有质控品、标准品和内标控制系统。这都是对试剂盒的质量进行保证的有效措施
10、。34总结分子诊断技术一直在演化当中，从其轨迹来看，我们不难发现以下特点：由确认疾病到预防疾病、从以治疗为导向到与治疗互进、单一渠道到多渠道。透过前面的叙述，我们不难分子发现分子诊断的发展趋势具有以下几个特征：自动化、标准化、检测指标多元化，无创性和时效性。测序测序(Sequencing) 在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。测序原理核酸序列分析的目的意义和策略（一）序列分析
11、的目的，2种：确证性测序 通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。（已知基因序列）从头序列 目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未知基因序列）（二）测定在生物医学领域相应应用，2个方面：对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。（三）序列分析的策略 测序目的不同或靶DNA片段大小有区别，则序列分析的具体方案有所不同，所以测序之前应根据相应情
12、况制订序列测定的策略。测序的常用方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。Sanger双脱氧链末端终
13、止法所需条件：1、ssDNA模板2、DNA聚合酶3、带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物4、4种dNTP链终止剂（chain-reminator）-2，3-二脱氧核糖核酸酶 当3-OH由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过5磷酸形成3，5磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相同的4组引物-模板混合物，每一组加4种dNTP，其中1种用32P（或35S）标记，加1种ddNTP，每组将产生一种特异性的以ddNTP为末端的不同长度的核苷酸链，经PAGE分离，即可读出被测定的全部顺序（dNTP和ddNTP竞争结合底物）。 在DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA
14、链上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的5末端，而3不同的DNA片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列。原理P100实验所需原料模板 引物DNA聚合酶放射性核素标记的dNTPdNTP和ddNTP反应缓冲液终止液聚丙烯酰胺凝胶（一）模板 纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以用作Sanger法测定的模板。模板的质量和所用的DNA聚合酶的种类是至关重要的。 通常采用M13噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果最佳，用变性双链DNA作模板则难获此效果。小量制备质粒DNA常被寡核苷
15、酸小分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清。采用小量制备质粒DNA测定未知DNA克隆片段的序列，并不可取，如果用CsCl-溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒DNA，测序结果会好得多，但又耗费大量的人力和物力。（二）引物 酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。 在许多情况下可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。也可用Sanger法测定变性双链DNA模板序列（如变性质粒DNA）。以上两种情况都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未
16、知DNA序列互补的引物。M13噬菌体重组子的通用测序引物一般长15-29bp，与紧靠M13mp18多克隆位点区的HindIII或M13mp19多克隆位点区EcoRI位点的序列互补。这些引物同样也可用于PUC质粒的DNA进行“双链”测序，并且已经商品化。（三）DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow大片段 Klenow大片段-DDDPI是由分子量109KD一条多肽链组成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成2个片段，1个片段分子量为76KD，有聚合酶，35外切酶活力，此片段称为Klenow片段，另一片段34KD，有5外切酶活力。 此酶是末端终止法最早采用的酶，用它进行测序常常产生较高的本底和
17、假带，催化链延伸反应的能力也较差，通常只能读出距引物250个核苷酸以内的序列。此酶价格便宜，容易获得，对于已知序列DNA次级克隆的鉴定仍有应用价值。2、测序酶（Sequenase） 测序酶是经过改造的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了35外切酶活性。活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA序列的首选酶。该酶及名称是HSB公司的专利。试剂盒已商品化。3、TaqDNA聚合酶 Taq酶用于序列测定，除具有很好的链延伸性能外，还可以在高温（70-80）进行反应的优点，因而能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测定的影响，将PCR与末端终止法测序结合进行，只需少量模板。（
18、四）放射性同位素标记的dNTP 传统32P-dNTP，由于32P衰变过程中产生高能的射线，导致放射自显影图谱条带扩散，分辨率低，限制了识读序列的数量。另外，由于32P对DNA样品辐射分解作用很强，通常都在测序反应后24小时内上样电泳，否则无法得到满意的结果。 -32S-dNTP近年来得到广泛使用，它解决了32P的两大缺点，具有很高的分辨率，较低的本底。测序反应产物-20保存一周并不明显影响反应结果。 dNTP/ddNTP=1:100时，DNA谱带的分离效果最佳。（五）用于测序的变性凝胶电泳 胶长40cm，厚度均匀 48%丙烯酰胺 7mol/L尿素 Sanger法测序主要反应（一）制胶（二）模板
19、变性（双链）（三）测序反应 1、模板引物退火 2、链延伸、链标记、链终止反应 3、上样电泳 4、读片（序） （必须经过实践才能获得技巧）化学降解法 化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以-消除反应，在3和5位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。4种核苷酸的特异裂解和鉴别
20、方法如下：作用的碱基作用的碱基试剂与反应试剂与反应碱基释放碱基释放DNA断裂断裂强强G/弱弱A稀释稀释250倍硫酸二甲酯，在倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20060分钟，分钟，DNAG的的N7和和A的的N3甲基化甲基化甲基化嘌呤不稳定，甲基化嘌呤不稳定，在中型在中型PH加热被破坏加热被破坏在在0.1M碱中，碱中，9015分钟，戊糖脱落，分钟，戊糖脱落，DNA链断裂，链断裂，G断裂断裂比比A快快5倍倍A同上同上0.2NHCl、0、60分分钟，碱基被破坏钟，碱基被破坏同上，同上，A断裂比断裂比G快快C+T15-18M联苯胺、联苯胺、2050分
21、钟，嘧啶环被破坏释放分钟，嘧啶环被破坏释放0.5M哌啶处理，断哌啶处理，断裂裂DNA键，键，C与与T有有同样速率同样速率C2MNaCl，联氨处理方法同上，联氨处理方法同上，100分钟，此时，分钟，此时，T的破坏被抑制，只有的破坏被抑制，只有C被破坏释放被破坏释放同上，只在同上，只在C处断裂处断裂DNA链链化学裂解法测序的原理1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物4、电泳分离，放射自显影得到互相错
22、落的梯形图谱，即可读出DNA序列在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是： G反应-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应-在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。碱基特异性修饰及裂解反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和A
23、C+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶C（一）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料。（二）碱性磷酸酶处理消除5磷酸。（三）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5-OH）末端。（四）使标记片段变性为单链。（五）分成4-5个反应体系，按上述程序（表或4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），DNA链上每50-100碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DN
24、A片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。（六）电泳（七）放射自显影（八）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。化学法测序的基本步骤化学裂解法的特点和优点特点：1、不需酶催化2、 5 和3 端均可标记，可从两方向测同一DNA3、操作繁琐、费时、分辨率较低优点： 化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。
25、DNA测序自动化和大规模测序特点原理同末端终止法标记物为荧光染料激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高测序速度快 200bp/h DNA自动测序与手工测序的不同点1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑A为绿色T为红色G为黑色C为蓝色第一代第一代DNADNA测序技术：测序技术：传统的化学降解法、
26、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术统称为第一代DNA测序技术。第二代第二代DNADNA测序技术：测序技术：最显著的特征是高通量，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序。-焦磷酸测序第三代第三代DNADNA测序技术：测序技术：特点是单分子测序。在纳米孔测序技术中，DNA分子依靠核酸外切酶以一次一个碱基的速度通过小孔。这个酶能清楚地区分出4个DNA碱基编码：A、C、G、T，也可以检测出该碱基是否被甲基化，一个单孔能在大约70天左右测定一个完整的基因序列。常见的测序仪lABI系列3773103730/3730XL35003130/3130XL3100DNA序列分析序列
27、分析1测序测序 PCR25个循环96 10 sec50 5 sec60 4 min循环结束后4保存。将PCR管放入PCR仪：在0.2ml MicroAmp PCR管中加入：反应混合物4.0ul引物(0.8pmol/ul)2.0ul模板250ng加加ddH2O至至10.0ulDNA序列分析序列分析2PCR产物纯化产物纯化90 2min，快速放于冰上，取1.5ul上样。PCR反应液稍离心，加1ul 3M NaOAC（pH4.6）和25ul 95%乙醇，充分混合，在室温下放置15min以上（不超过24 h）；13000rpm 20 min；用Tip吸弃上清液；加250ul 70%乙醇，混合；1300
28、0rpm 离心5 min，用Tip吸弃上清液；干燥沉淀，加上样缓冲液3.5ul；DNA序列分析序列分析3测序胶制备测序胶制备(1) 洗净玻璃板、梳子、间隔条、针筒和电泳槽等并凉干；(2) 胶板制备； 胶液制备：尿素18g40%丙烯酰胺5mlddH2O25ml离子交换树脂0.5g搅拌至尿素完全溶解(2000bp: 20-50ng 500-1000bp:5-20ngBigDye ：4ul 测序引物：3.2pmol纯水 补足体积总体积 10ul反应条件：96 C 1 min (96 C 10 sec 50 C 5 sec 60 C 4 min) x 25个循环 4 C保温1、测序反应2、醋酸钠/乙醇
29、法纯化PCR产物A、 每管加入2 L 125 mM EDTA到管底，每管加入2 L 3M NaAc到管底。B、 每管加入30 L 100%酒精，震荡混匀，避光室温放置15 min。C、 12000rpm离心20 min，去上清。D、 每管加入30 L 70% 酒精，12000rpm离心10 min，去上清。E、重复上步1次。3、电泳前PCR产物的处理A、室温挥发净酒精，加入10 L Hi-Di Formamide（高质量的去离子甲酰胺）振荡溶解DNA。B、 溶解后的样品在 95 C变性5 min，迅速置冰中冷却4 min后，准备上样电泳。（二）安装毛细管只有在计算机开着,3100 Data C
30、ollection软件正常运行,主机处于绿灯亮的条件下才能进行装毛细管的操作。1、按Tray使自动进样器回到左前方。2、打开门，按如下放置。2号及4号的水最好每天都更换，1号缓冲液每7天必须更换36厘米长毛细管束: 用于快速测序分析(测序长度约450bp nt ,准确度98.5%)50厘米长毛细管束: 用于标准测序分析(测序长度约650bp nt ,准确度98.5%) 80厘米长毛细管束: 用于长片断测序分析(测序长度约950bp nt ,准确度98.5%3、打开恒温加热炉的门，安装梳子卡子。4、取出毛细管，先安装毛细管针端。左手提住毛细管束端，右手小心将毛细管针端卡子推入恒温加热炉下部的卡槽
31、中(别碰到槽边)，中指轻轻压住卡子，拇指将左边插销推紧（力稍大一些），然后倒转，中指延续按住卡子中部，将右边销推入。5、推上靠近毛细管针端那个标记字母为C的夹子6、在毛细管束端裝上大旋钮和小固定圈，将其向左下方弯曲成型，并插入上胶块的旋钮孔中到底7、卡好靠近毛细管束端的标记为C的卡子，左右移动检测窗口使它位于仪器检测孔正对的位置8把上胶块推回到底位置，将检测器四个角推进到仪器检测孔中去，轻轻拧紧上胶块旋钮，松紧以不漏胶为目标9、盖上检测器盖，轻轻拧紧固定螺丝，关闭加热炉门，放回卡条，关仪器门。10、运行spatial calibration进行毛细管空间定位校准。（三）灌胶在仪器装好毛细管后才
32、能灌上下胶块的胶，目标是把上下胶块中的灌胶通道及之间的连接管预先充满胶液而不引入任何大小气泡。在灌胶前小时从冰箱取出相应的胶回温：POP 6 测序观察胶液：应是无沉淀的透明液体，若发现有析出物可于水浴使之溶解。1、把胶液抽进贮胶针筒中，（抽取的m L数约为0.5+0.07做样次数）倒置排出针筒内气泡，用镜头纸把挤出来的胶液擦干净。2、把针筒裝到上胶块左边，拧紧。3、 把250uL 灌胶针筒裝到上胶块右边，拧紧。4、仔细检查连接管两头的接头、毛细管束端固定钮是否拧紧。5、慢慢压挤针筒上的活塞杆把胶液挤进：上胶块-连接管-下胶块这个过程中注意不要太快以免引入气泡。6、用镜头纸擦掉下胶块满出的胶液。
33、7、 装上阳极缓冲液杯（缓冲液加到杯上刻线以下即可，太满会在裝上时溢出，太浅则阳极电极浸不到缓冲液）a. 在挤压针筒的同时提升uL针筒把胶液吸约uL进去。b. 见下面左侧图示，在挤压uL针筒的同时压住针阈，经秒左右放开针阈，这时气泡会快速进入管道中。c.若还有气泡，重复一。排气泡方法：（四）样品孔的配制正确装配后不会看到密封板的橡皮（五）软件设置1. 开启稳压电源开关，运行5分钟。2. 开启计算机显示器开关。3. 开启计算机电源开关，计算机自检。然后出现Begin Logon 对话框，同时按下CTRLALTDELETE键，进入LOGONINFORMATION窗口4. 用户名为3100 User
34、 ,输入密码 ,点击OK，登录进入NT系统，计算机会自动启动OrbixWeb Demon 软件5. 等NT软件完成启动后,开启3100主机电源开关6. 双击3100 DATDCOLLECTION快捷键(或从路径start PE Biosystems 3100 Data Collection)进入数据采集软件，随后显示3100 DATDCOLLECTION VERSION 1.01软件窗口。 7、从DATACOLLECTIONSOFTWARE中选择单击PALTEVIEW打开另一窗口，选择点击NEW进入PLATEEDITOR。 8、选择Sequencing 后给定样品板名，按Finish。9、出现
35、样品表，依照样品在样品板中的位置，给出每个样品名 DYESETE（BigDye V.2）或Z (BigDye V.3)MOBILITYFILE DT3100 POP6BD V2.mob （BigDye V.2） 或 DT3100POP6BDV3.mob （BigDye V.3）BIOLIMS PROJECT 3100-PROJECT 1 RUN MODULE Stdseq50_POP6DefaultModule（正常测序50厘米毛细管） 或 RapidSeq36_POP6DefaultModule （快速测序36厘米毛细管） ANALYSIS MODULE BC-3100_SeqOffFtOf
36、f.saz （正常测序） 或 BC-3100RR_SeqOffFtOff.saz （快速测序） 10、完成点击OK，把己经上好标准样品的96孔样品盒装到3100主机的自动进样器的样品架上，这时软件上或样品架图会由灰色变成黃色，表示出位置上己经有样品架。11、点击待命板记录表（PENDINGPLATERECORDS）中选中刚刚编好的样品板名（PLATENAME）， 然后根据样品架位置联接起来；到己联接样品板记录表（LINKEDPLATERECORDS）中选A或B，然后点击绿色的开始运行快捷按钮，运行开始。（六）电泳样品分子用电进样的方法进入已灌满了胶的毛细管的进样端。然后在毛细管两端加上电压开始
37、电泳。电泳时带电的DNA片断在电场作用下朝毛细管另一端运动，片断越短跑得越快（七）激发和检测当DNA片断运动到检测窗口时碰到激光束而使标记在上面的荧光素发出荧光信号，此荧光信号被CCD检测器所捕获 。（八）数据收集和分析注意事项PCR产物测序1、产物必须纯化，除去未反应的引物、dNTP、引物二聚体等成分；2、模板不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后再测序；3、纯化好的 PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应；4、提供测序引物（5pmol/l）。不适合测序的引物1、简并引物简并引物：在模板上有多个结合位点，影响结果；2、随机引物随机引物：一般比较短，Tm比较低，在测序的
38、条件下与模板结合不好；3、过长的引物过长的引物：一般要求不大于24bp，最多不超过30bp，否则结合位点多，纯度低；4、有特殊标记的引物有特殊标记的引物：大的标记基团直接影响DNA迁移率，导致峰型不好或错误；5、不纯的引物不纯的引物：纯度需要大于90%，PAGE纯化级别的可以使用。1 反应混合物反应混合物2 测序引物测序引物（0.8pmol/ul）3 10TBE缓冲液缓冲液（pH 8.3）4 40%丙烯酰胺贮液丙烯酰胺贮液5 尿素尿素 （抑制碱基配对）（抑制碱基配对）6 TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二四甲基乙二胺胺)7 10%过硫酸铵（过硫酸铵（W/V，现配现，现配现用）用）8上样缓冲
39、液（上样缓冲液（5:1甲酰胺甲酰胺:25mM EDTA,50mg/ml蓝色葡聚糖）蓝色葡聚糖）9 dH2O/ddH2O10. NaAC（3M ，pH4.6）11. 95%乙醇乙醇12. 70%乙醇乙醇DNA序列分析序列分析Tris108.0gNa2EDTA2 H2O8.3g硼酸硼酸55.0gddH2O至至1000ml再过滤（再过滤（0.2um孔径）孔径）染色染色ddNTP，dNTP，AmpliTaq DNA 聚合酶，聚合酶，MgCl2，Tris-HCl缓冲液缓冲液pH9.0DNA序列分析序列分析测序仪测序仪PCR仪仪Eppondorf离心机离心机水浴锅水浴锅制冰机制冰机tip枪枪冰盒冰盒eppendorf管管PCR管管
