1、第三章第三章 DNA与与RNA分析方法分析方法电泳电泳 电泳是分离、鉴定和纯化电泳是分离、鉴定和纯化DNA与与RNA片段的片段的标准方法，该方法操作简便、快速，可分辨其他标准方法，该方法操作简便、快速，可分辨其他方法方法(如密度梯度离心、纤维素柱等分离方法如密度梯度离心、纤维素柱等分离方法)无无法分离的法分离的DNA或或RNA片段。将低浓度的荧光片段。将低浓度的荧光 嵌嵌入染料染色后可直接确定入染料染色后可直接确定DNA或或RNA在凝胶在凝胶 中中的位置。检测的量可少至的位置。检测的量可少至1-10ng。并可从凝胶中。并可从凝胶中回收回收DNA条带，用于基因的克隆等操作。条带，用于基因的克隆等
2、操作。 根据凝胶介质的不同可分为根据凝胶介质的不同可分为琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和和聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。第一节第一节 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的线状高聚琼脂糖是从海藻中提取出来的线状高聚物，经过纯化后可作为分离物，经过纯化后可作为分离DNA或或RNA的介的介质。琼脂糖经某些化学修饰后可变为低熔点质。琼脂糖经某些化学修饰后可变为低熔点琼脂糖，其熔点和凝固点降低，但凝固后凝琼脂糖，其熔点和凝固点降低，但凝固后凝胶的强度无明显改变。琼脂糖的基本结构：胶的强度无明显改变。琼脂糖的基本结构： 琼脂糖凝胶分离琼脂糖凝胶分离DNA片段的原理片段的原理 琼脂
3、糖吸水形成胶球，不同大小的琼脂糖吸水形成胶球，不同大小的DNA分子通过胶球之间的孔隙时移动的速度不同，分子通过胶球之间的孔隙时移动的速度不同，DNA分子越小移动的速度越快，分子越小移动的速度越快，DNA分子越分子越大移动的速度越慢。大移动的速度越慢。一、普通琼脂糖凝胶电泳一、普通琼脂糖凝胶电泳 目的：检测、分离和纯化目的：检测、分离和纯化DNA或或RNA片段片段（0.5-25 kb）1. 凝胶浓度与待分离凝胶浓度与待分离DNA大小的关系大小的关系 琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（%） 线性线性DNA的的有效分离有效分离范围（范围（kb） 0.5 30 - 1 0.7 12 - 0.8 1.0 10 -
4、 0.5 1.2 7 - 0.4 1.5 3 - 0.2 2.0 2 - 0.12. 琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备1) 配胶配胶：按一定的比例加入琼脂糖和电泳缓冲液按一定的比例加入琼脂糖和电泳缓冲液 常见的电泳缓冲液。常见的电泳缓冲液。 缓冲液缓冲液 使用浓度使用浓度 储存液储存液TAE ( pH 7.5 8.0） 1 x : 40 mM Tris-乙酸 50 x : 242 g Tris 1 mM EDTA 57.1 g 冰乙酸 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)TPE (pH 7.5 8.0) 1 x : 90 mM Tris-磷酸 10 x : 108 g Tris
5、 碱 2 mM EDTA 15.5 ml 85% 磷酸 40 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)TBE (pH 8.3) 0.5 x : 45 mM Tris-硼酸 5 x : 54 g Tris 碱 1 mM EDTA 27.5 g 硼酸 20 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) 2）煮胶：）煮胶： * 注意要使琼脂糖充分胶化注意要使琼脂糖充分胶化 3）倒胶：）倒胶： * 注意要将固定框封闭好，防止漏胶注意要将固定框封闭好，防止漏胶琼脂糖凝胶的制备过程琼脂糖凝胶的制备过程3. 凝胶电泳凝胶电泳 在电泳槽中加入电泳缓冲液至胶面上在电泳槽中加入电泳缓冲液至胶面上3-5mm，将
6、将DNA样品加入到凝胶的梳孔中，样品加入到凝胶的梳孔中，先在较高电场先在较高电场下电泳下电泳5min，然后在正常电场下电泳。一般琼脂，然后在正常电场下电泳。一般琼脂糖凝胶电泳时加在胶上的糖凝胶电泳时加在胶上的电压不超过电压不超过5V/cm。 在低电压时，线状在低电压时，线状DAN片段的迁移速率与所片段的迁移速率与所加的电压成正比，但随着电场强度的增加，高分加的电压成正比，但随着电场强度的增加，高分子量子量DNA片段的迁移率以不同的幅度增长。随着片段的迁移率以不同的幅度增长。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。影响凝胶影响凝胶DNA电泳的因素电
7、泳的因素1）琼脂糖的浓度）琼脂糖的浓度2）DNA的构象的构象：分子量相同的分子量相同的超螺旋环状超螺旋环状（I型）、型）、 带切口环状带切口环状（II型）和型）和线状线状（III型）型）DNA在凝胶在凝胶 中的运动速度不一样。它与凝胶的琼脂糖浓度、中的运动速度不一样。它与凝胶的琼脂糖浓度、 电流强度、缓冲液离子强度和电流强度、缓冲液离子强度和DNA超螺旋度有关超螺旋度有关3）电场方向：）电场方向： 电场方向不变时，较长的电场方向不变时，较长的DNA分子（分子（50-100kb）在琼脂糖凝胶上的迁移速率相同。但如果周期性的在琼脂糖凝胶上的迁移速率相同。但如果周期性的改变电场的方向，改变电场的方向
8、，DNA的分辨率将发生改变。的分辨率将发生改变。4）碱基组成与温度：）碱基组成与温度： DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为与碱基组成和在琼脂糖凝胶中的电泳行为与碱基组成和电泳温度变化关系不大，不同大小的电泳温度变化关系不大，不同大小的DNA片段在片段在4 oC 30 oC相对迁移率不变。相对迁移率不变。5）嵌入染料：）嵌入染料： 溴化乙锭堆积在溴化乙锭堆积在DNA碱基之间，能拉长线状和碱基之间，能拉长线状和带切口带切口DNA，使线状，使线状DNA的迁移率降低的迁移率降低15%。6）电泳缓冲液的组成：）电泳缓冲液的组成： 离子强度低，迁移率低。离子强度高，迁移率离子强度低，迁移率低。离子强度高，迁移
9、率高，但会引起凝胶发热。高，但会引起凝胶发热。4. DNA的检测的检测 琼脂糖经溴化乙锭染色后在紫外灯下进行检测琼脂糖经溴化乙锭染色后在紫外灯下进行检测凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统 WD-9413A型型DNA分子量的测定分子量的测定常用标准分子量：常用标准分子量：DNA（48.5 kb）, pBR322(4.36 kb) DNA-EcoR I: 21226, 7421, 5804, 5643,4878, 3530 (bp)DNA-Hind III: 23130, 9416, 6557,4361, 2322, 2027,564, 125 DNA-EcoR I- Hind III: 21226
10、,5148, 4973, 4268, 3530, 2027, 1904, 1584, 1375, 947, 831, 564,125 pBR322 DNA-Hae III: 587, 540, 504, 458, 434, 267,234,213,192,184,124,123,104,89,80,64,57, 51,21,18,11,8DNADNA分子量的测定分子量的测定 方法一：方法一： 根据已知不同大小根据已知不同大小DNADNA片段的相对迁移率片段的相对迁移率( (从原点到峰尖的距离从原点到峰尖的距离) )求出待测求出待测DNADNA片段的大小。片段的大小。方法二：估算法方法二：估算法
11、 根据标准分子量的大小估算待测分子量的大小。根据标准分子量的大小估算待测分子量的大小。5. DNA片段的回收片段的回收1）DEAE - 纤维素膜电泳回收纤维素膜电泳回收： 利用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离利用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后片段，然后在紧靠目的在紧靠目的DNA的前方切下一裂隙，将一经处理的的前方切下一裂隙，将一经处理的DEAE-纤维素膜插入裂隙中，继续电泳，直至所有的纤维素膜插入裂隙中，继续电泳，直至所有的DNA均收集均收集到膜上，然后取出膜，依次用低离子强度的缓冲液、高离到膜上，然后取出膜，依次用低离子强度的缓冲液、高离子强度的缓冲液洗脱。子强度的缓冲液洗脱。2)
12、 透析袋电洗脱：将切下的含透析袋电洗脱：将切下的含DNA的凝胶带置于透析袋中，的凝胶带置于透析袋中，在低电压（在低电压（2V/cm）下电泳。该方法主要用于分离大量）下电泳。该方法主要用于分离大量DNA片段（片段（500g）。）。电泳电泳500 2000 bp ，2h；2000 4000 bp ，4 h。 电泳完毕后电泳完毕后100 V反向反向30 S。 得率：得率：1 kb时：为时：为80 90 %， 1 kb 时为时为50 60%。透析袋回收透析袋回收DNA片段过程片段过程3）低熔点琼脂糖凝胶分离）低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段片段 将将DNA在在1%的低熔点琼脂糖中电泳，切下目的的低熔点琼
13、脂糖中电泳，切下目的DNA凝胶带，置于凝胶带，置于65 熔化，加入足够的熔化，加入足够的TETE缓冲液（缓冲液（pH 8.0pH 8.0）, ,降低至琼脂糖的浓度为降低至琼脂糖的浓度为0.4%0.4%。然后以乙醇沉淀，最后将沉。然后以乙醇沉淀，最后将沉淀溶于淀溶于TETE缓冲液中。缓冲液中。4 4）利用试剂盒从凝胶中回收）利用试剂盒从凝胶中回收DNADNA片段片段 DEAE DEAE 纤维素柱法纤维素柱法 玻璃珠法玻璃珠法 硅胶膜硅胶膜 二、脉冲场凝胶电泳二、脉冲场凝胶电泳( 10 - 2000 kb)1. 倒转场凝胶电泳倒转场凝胶电泳： 通过周期性地改变电场的方向而使不同大小的DNA片段分离
14、的方法 a) 可分离的最大片段 ( kb): 0.13(T+40)V1.1(3-A)0.6t0.875 b) 可分离的最小片段 (kb)： 0.75 可分离的最大片段* T(温度 ), V(电场强度 V/cm), A (琼脂糖的百分浓度), t (脉冲时间,对于倒转电场指反向时间,单位S)脉冲场凝胶电泳示意脉冲场凝胶电泳示意 胡冬梅，陈世平。肺炎克雷伯菌的耐药性及PFGE电泳核型。中华微生物学和免疫学杂志, 2000年第20卷第 4期2. 钳位均匀电场电泳钳位均匀电场电泳* 通过周期性地改变电场的角度而分离大分子DNA* 可分离的最大片段:： 0.034 (T+40) V1.1(3-A)0.6
15、t0.875 (kb) * 可分离的最小片段 0.75 最大可分离片段 * 10 kb片段迁移速率(cm/h)： 0.0012(T+25) V1.6cos(/2)/A (改向角度)钳位琼脂糖凝胶电泳示意钳位琼脂糖凝胶电泳示意第二节第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native poly- acrylamide gel electrophoresis, PAGE) 目的：分离和纯化较小的双链目的：分离和纯化较小的双链DNA片段片段1丙烯酰胺的浓度与分离的丙烯酰胺的浓度与分离的DNA片段的关系片段的关系 丙烯酰胺浓度(% w/v
16、) 有效分离范围(bp) 二甲苯青FF 溴酚蓝* 3.5 1000 2000 460 100 5.0 80 500 260 65 8.0 60 400 160 45 12.0 40 200 70 20 15.0 25 150 60 15 20.0 6 100 45 12 * 迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂 常见的有两种：常见的有两种： 溴酚蓝溴酚蓝(bromophenol blue，Bb)呈蓝紫色呈蓝紫色 二甲苯青二甲苯青(xylene cyanol，Xc)呈蓝色。呈蓝色。v 溴酚蓝的分子量为溴酚蓝的分子量为670，在不同浓度凝胶中，迁移，在不同浓度
17、凝胶中，迁移速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由速度基本相同，它的分子筛效应小，近似于自由电泳，故被普遍用作指示剂。电泳，故被普遍用作指示剂。 在在0.6、1、2的琼脂糖凝胶电泳中，溴的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与酚蓝的迁移率分别与1kb、0.6kb和和0.15kb的双链线的双链线性性DNA片段大致相同。片段大致相同。 在在5的聚内烯酰胺凝胶和的聚内烯酰胺凝胶和78mol/L尿素尿素PAG中，分别与中，分别与65mer和和35mer的寡聚核苷酸迁移率相的寡聚核苷酸迁移率相同。同。 v 二甲苯青的分子量为二甲苯青的分子量为554.6，携带的电荷量比溴酚蓝少，携带的电荷量比溴酚蓝少
18、，在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢在凝胶中迁移率比溴酚蓝慢，在，在5PAG含含78mol/L 尿尿素素PAG的胶中迁移率分别相当于的胶中迁移率分别相当于260mer和和130mer的寡核的寡核苷酸。苷酸。v 根据分离样品中根据分离样品中DNA分子的大小，可以参照指示剂分子的大小，可以参照指示剂 Bb 和和Xc的迁移情况决定是否停止电泳指示剂。一般加在电泳的迁移情况决定是否停止电泳指示剂。一般加在电泳上样缓冲液中，为了使样品能沉入胶孔，还要加入适星的上样缓冲液中，为了使样品能沉入胶孔，还要加入适星的蔗糖、聚蔗糖蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。或甘油以增加比重。2. 聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶
19、的制备原原 理理： 由过硫酸铵提供并可被由过硫酸铵提供并可被TEMED（N, N, N, N-四甲四甲基乙二胺）所稳定的自由基引发的一个链式反应基乙二胺）所稳定的自由基引发的一个链式反应,使丙烯使丙烯酰胺单体聚合成长链。双功能基团酰胺单体聚合成长链。双功能基团N,N-亚甲基双丙烯酰亚甲基双丙烯酰胺参与聚合反应时，链与链之间铰链成凝胶，其孔径由胺参与聚合反应时，链与链之间铰链成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。链长和交联度决定。 * 使用使用 TBE电泳缓冲液电泳缓冲液 * 凝胶在垂直装置中制备凝胶在垂直装置中制备聚丙烯酰胺凝胶形成过程示意聚丙烯酰胺凝胶形成过程示意聚丙烯酰胺凝胶制胶装置聚丙烯酰胺
20、凝胶制胶装置 3电泳：低电压（电泳：低电压（1- 8 V/cm）电泳，防止电流）电泳，防止电流 通过时产生的热量引起小片段通过时产生的热量引起小片段DNA变性。变性。 * DNA条带迁移率与碱基组成和序列特征有关条带迁移率与碱基组成和序列特征有关 4特点特点: I 分辨率高，分辨率高，DNA的长度仅相差的长度仅相差0.2% (1 bp) ii 所装载的所装载的DNA量远大于琼脂糖凝胶量远大于琼脂糖凝胶( g) iii 回收的回收的DNA的纯度很高的纯度很高 二、变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳二、变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳目目 的：的： 分离纯化单链分离纯化单链DNA分子分子原原 理理： 凝胶在可抑制核
21、酸中碱基配对的试剂凝胶在可抑制核酸中碱基配对的试剂 (尿素，甲醛）尿素，甲醛）的存在下聚合，变性的的存在下聚合，变性的DNA在凝胶中的迁移率与碱基的在凝胶中的迁移率与碱基的组成及序列无关，只与组成及序列无关，只与DNA的片段大小相关。的片段大小相关。应应 用：用： 放射性探针的分离，放射性探针的分离，S1核酸酶产物的分析，核酸酶产物的分析，DNA测测序反应产物的分析等。序反应产物的分析等。 变性的梯度凝胶电泳变性的梯度凝胶电泳Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌
22、、古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒细菌、古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和容易操作等特点，适合于调查种群的时空变化，容易操作等特点，适合于调查种群的时空变化，并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。探针杂交分析鉴定群落成员。 变性的梯度凝胶电泳变性的梯度凝胶电泳 由由 Fisher和和 Lerman于于1983年创立。以后该技术和年创立。以后该技术和PC
23、R技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用利用梯度变性胶梯度变性胶来分离来分离 DNA片段。电泳开始时，片段。电泳开始时，DNA在在胶中的迁移速率仅与分子大小有关，而一旦胶中的迁移速率仅与分子大小有关，而一旦 DNA泳动到泳动到某一点时，即到达该某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得变性浓度位置时，使得 DNA双双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用
24、的变性剂有尿素从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性剂有尿素 (urea)和甲酰胺和甲酰胺 (formamide)。 一：核酸的提取；一：核酸的提取； 二：二： 16SrRNA、18SrRNA或功能基因如可溶性甲烷加单或功能基因如可溶性甲烷加单氧酶羟化酶基因氧酶羟化酶基因 (mmo X)和氨加单氧酶和氨加单氧酶 -亚单位基因亚单位基因 (amo A)片段的扩增；片段的扩增； 三：通过三：通过DGGE分析分析 PCR产物产物 DGGE分析微生物群落的一般步骤如下：分析微生物群落的一般步骤如下： Bacterial 16S rRNA genes were PCR-amplied using a
25、 universal primer complementary to position 517-534 (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3) and a bacterial primer complementary to position 341-358 plus a GC clamp (5-CGCCCGCCGCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3) (Muyzer et al. 1993).Lasse Riemann et al. Deep-Sea Research II, 1999, 46, 1791-1811 Th
26、e depth range covered by each sample is S1 (1-85 m); S2 (0-60 m); S11(0-80 m); S15 (0-70 m); N7 (0-60 m). DGGE也有缺陷，其中之一是只能分离较小的片段，也有缺陷，其中之一是只能分离较小的片段，使用于系统发育分析比较和探针设计的序列信息量受到使用于系统发育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制。在某些情况下，由于所用了限制。在某些情况下，由于所用基因的多拷贝基因的多拷贝导致一导致一个种类多于一条带，因此不易鉴定群落结构到种的水平。个种类多于一条带，因此不易鉴定群落结构到种的水平。此外，该技术具有内在的如单一细菌种类此外，该技术具有内在的如单一细菌种类 16S rDNA拷贝拷贝之间的之间的异质性异质性问题，可导致自然群落中微生物数量的过问题，可导致自然群落中微生物数量的过多估计。多估计。 DGGE是分析微生物群落的一种有力的工具。不过是分析微生物群落的一种有力的工具。不过为了减少为了减少 DGGE和其它技术的缺陷，建议研究者结合和其它技术的缺陷，建议研究者结合 DGGE和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微生物的群落结构和功能。生物的群落结构和功能。
