1、.1 光谱分析技术光谱分析技术.2光学导论光学导论光谱：复色光经色散系统分光后，按波长光谱：复色光经色散系统分光后，按波长（或频率）的大小依次排列的图像（或频率）的大小依次排列的图像.3光学导论光学导论基于测量物质的光谱而建立起来基于测量物质的光谱而建立起来的分析方法称为光谱分析法的分析方法称为光谱分析法吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱分子光谱分子光谱原子光谱原子光谱.4光学导论光学导论 吸收光谱吸收光谱 颜色的差异颜色的差异定性定性 颜色的深浅颜色的深浅定量定量.5光学导论光学导论发射光谱发射光谱化学发光化学发光热热/电激发发光电激发发光光致发光光致发光.6光学导论光学导论光谱分析法的准确分
2、类光谱分析法的准确分类分子光谱分子光谱 吸收吸收（根据吸收波段不同细分）（根据吸收波段不同细分） 紫外紫外-可见可见 红外红外 发射发射（根据发射原理不同细分）（根据发射原理不同细分） 光致发光：光致发光：荧光荧光、磷光磷光 化学发光化学发光.7光学导论光学导论光谱分析法的准确分类光谱分析法的准确分类原子光谱原子光谱 吸收吸收 发射发射（根据发射原理不同细分）（根据发射原理不同细分） 热热/电激发发光：电激发发光：发射发射 光致发光：光致发光：荧光荧光.8光学导论光学导论 光谱分析光谱分析光学分析！光学分析！光学分析光学分析 = 光谱分析光谱分析 + 非光谱分析非光谱分析 非光谱分析：基于物质
3、与辐射的相互非光谱分析：基于物质与辐射的相互作用，测量辐射的某些性质，如折射、作用，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等变化的分散射、干涉、衍射和偏振等变化的分析方法析方法.9光学导论光学导论光谱分析与非光谱分析的区别光谱分析与非光谱分析的区别光谱分析涉及光谱分析涉及“颜色颜色”“”“谱谱”“”“能能量量”的变化的变化非光谱分析涉及光的传播方向等物非光谱分析涉及光的传播方向等物理性质的变化，不涉及理性质的变化，不涉及“谱谱”.10光学导论光学导论光的本质：电磁辐射、波粒二象性光的本质：电磁辐射、波粒二象性波波波长波长、频率、频率、速度、速度 = c (真空中的真空中的) = 3
4、 108 ms-1波长波长：相邻两个波峰或波谷间的直线距离：相邻两个波峰或波谷间的直线距离 单位可以是单位可以是nm、m、cm、m频率频率：在：在1秒时间内经过某点的波数秒时间内经过某点的波数 （即每秒内振动的次数）（即每秒内振动的次数） 单位单位Hz (s-1)周期周期T：频率的倒数；波数：频率的倒数；波数：波长的倒数：波长的倒数.11光学导论光学导论 射射线线x射射线线紫外紫外光光红外红外光光微微波波无线无线电波电波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光电磁波谱：将电磁辐射按照波长或频率的电磁波谱：将电磁辐
5、射按照波长或频率的大小顺序排列起来即称为电磁波谱大小顺序排列起来即称为电磁波谱.12光学导论光学导论波波长长510-30.10.11010200200400名名称称射线射线x射线射线远紫外光远紫外光近紫外光近紫外光波波长长4 0 0 7507 5 0 1.01061.01061.01091.01091.01012名名称称可见光可见光红外光红外光微波微波无线电波无线电波.13光学导论光学导论粒粒光子：能量光子：能量E、普朗克常数、普朗克常数h、电子伏特、电子伏特eVh = 6.626 10-34 Js1J = 6.241 1018 eV= h= hc/当物质所吸收的电磁辐射能量能够满足该物质由低
6、能态(基态)跃迁至高能态(激发态)，将产生吸收光谱当物质通过电、热或光等激发至激发态，再从激发态过渡到低能态或基态时，将产生发射光谱.14吸收光谱吸收光谱发射光谱发射光谱.15光学导论光学导论某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态需要需要20 eV，请问该分子吸收光的波长？，请问该分子吸收光的波长？解：解：1 eV = 1.602 10-19 J 根据公式根据公式= hc/ 则则= hc/ = （6.626 10-34 3 108 ）/ （20 1.602 10-19 ） = 0.62 10-7 m = 62 nm.16紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法.
7、17什么是紫外-可见光谱远紫外光区：远紫外光区：10200 nm近紫外光区：近紫外光区：200400 nm UVC：200280 nm UVB：280320 nm UVA：320400 nm可见光区：可见光区：400780 nm红外光区：红外光区：780 nm1 mm.18什么是紫外-可见分光光度法基于基于分子外层价电子外层价电子跃迁跃迁产生的产生的在紫外在紫外-可见光谱区可见光谱区的的吸收光谱吸收光谱进行分析的一种常进行分析的一种常用的光谱分析方法。用的光谱分析方法。ultraviolet and visible (UV-vis) spectrophotometry.19基本原理分子的三种运
8、动状态对应分子的三种运动状态对应有一定的能级。即在分子有一定的能级。即在分子中存在着：中存在着： 电子能级电子能级 振动能级振动能级 转动能级转动能级这三种能级都是这三种能级都是量子化量子化的的.20分子能量的变化：分子能量的变化： E = Ee + Ev + Er Ee Ev Er基本原理.21基本原理分子吸收光（电磁波）后产生的能量的变化：分子吸收光（电磁波）后产生的能量的变化：chhEm 0.061.2520ev1电子电子Em 1.25251ev0.05 振动振动Em 2510000.05ev0.0001转动转动E.22基本原理带状光谱带状光谱发生电子跃迁时必然发生电子跃迁时必然要发生振
9、动能级和转要发生振动能级和转动能级的跃迁，这使动能级的跃迁，这使得紫外得紫外-可见吸收光可见吸收光谱呈现带状谱呈现带状典型的紫外典型的紫外-可见吸收光谱图可见吸收光谱图吸收峰吸收峰最大吸收波长最大吸收波长(max).23基本原理价电子价电子电子电子 饱和的单键饱和的单键 电子电子 不饱和的双键、三键不饱和的双键、三键 n电子电子 孤对电子孤对电子分子中分子轨道有分子中分子轨道有成键轨道成键轨道与与反键轨道反键轨道：它们的能级高低为：它们的能级高低为： n * COHnpsH.241.* 跃迁：跃迁： 饱和烃（饱和烃（ C-C，C-H ） 能量很高，能量很高， 200nm4. n*跃迁：跃迁：
10、含杂原子不饱和基团（含杂原子不饱和基团（C N ，C=O ） 能量最小，能量最小， 200400nm基本原理.25影响紫外-可见吸收光谱的因素1 共轭效应共轭效应共轭体系越长，共轭体系越长， 与与*的能量差越小，红移效应和的能量差越小，红移效应和增色效应越明显。增色效应越明显。 2 立体化学效应立体化学效应空间位阻、跨环效应空间位阻、跨环效应3 溶剂的影响溶剂的影响溶剂效应溶剂效应4 体系体系pH的影响的影响Tips：由于溶剂对电子光谱图影响很由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或大，因此，在吸收光谱图上或数据表中数据表中必须注明所用的溶剂必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱
11、作对照与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。必须正确选择溶剂。.26朗伯-比尔定律定量分析的基础当强度为当强度为I0的一定波长的单色入射的一定波长的单色入射光束通过装有均匀待测物的溶液介质光束通过装有均匀待测物的溶液介质时，该光束将被部分吸收时，该光束将被部分吸收Ia，部分反，部分反射射Ir ，余下的则通过待测物的溶液，余下的则通过待测物的溶液It ，即有：即有：I0=Ia + It + Ir.27朗伯-比尔定律如果吸收介质是溶液（测定中一般如果吸收介质是溶液（测定中一般是溶液），
12、式中反射光强度主要与器是溶液），式中反射光强度主要与器皿的性质及溶液的性质有关，在相同皿的性质及溶液的性质有关，在相同的测定条件下，这些因素是固定不变的测定条件下，这些因素是固定不变的，并且反射光强度一般很小。所以的，并且反射光强度一般很小。所以可忽略不记，这样：可忽略不记，这样：I0=Ia+ It.28朗伯-比尔定律透光率透光率透光率表示透过光强度透光率表示透过光强度与入射光强度的比值，用与入射光强度的比值，用T来表示，计来表示，计算式为：算式为：T = It/I0T常用百分比（常用百分比（%）表示。）表示。吸光度吸光度透光率的倒数的对数叫透光率的倒数的对数叫吸光度。用吸光度。用A表示：表示
13、：A = -lgT = lg(I0/It).29朗伯-比尔定律.30当用一束强度为当用一束强度为I0的单色光垂直通过厚度为的单色光垂直通过厚度为b、吸光物质、吸光物质浓度为浓度为c的溶液时，的溶液时，溶液的吸光度正比于溶液的厚度溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物质的浓度和溶液中吸光物质的浓度c的乘积的乘积。朗伯-比尔定律IoItbaA = lg(I0/It) = Kbc.31朗伯-比尔定律吸光系数：吸光系数：当溶液浓度当溶液浓度c的单位为的单位为g/L,溶液液层厚度溶液液层厚度b的单位为的单位为cm时，时，K叫叫“吸光系数吸光系数”，用，用a表示，其单位为表示，其单位为Lg-1cm-
14、1摩尔吸光系数：摩尔吸光系数：当溶液浓度当溶液浓度c的单位为的单位为mol/L，液层厚度，液层厚度b的单位为的单位为cm时，时，K叫叫“摩尔吸光系数摩尔吸光系数”，用用表示，其单位为表示，其单位为Lmol-1cm-1 = aM (M为吸光物质的分子量为吸光物质的分子量).32紫外-可见分光光度计岛津岛津 UV-2450.33 紫外-可见分光光度计.34紫外-可见分光光度计单光束分光光度计单光束分光光度计.35双光束分光光度计双光束分光光度计紫外-可见分光光度计.36紫外-可见分光光度计.37紫外-可见分光光度计.38可拆卸圆形测量池可拆卸圆形测量池两面透光两面透光圆形测量池圆形测量池两面透光两
15、面透光1cm 长方形测量池长方形测量池两面透光两面透光气体测量池气体测量池两面透光两面透光微量测量池微量测量池两面透光两面透光流动测量池流动测量池两面透光两面透光紫外-可见分光光度计.39思考题.40生物分子的紫外-可见吸收光谱糖糖紫外可见光谱在糖的分析中紫外可见光谱在糖的分析中, 主要作定量检测。主要作定量检测。最大吸收波长为最大吸收波长为218 nm, 多糖最大吸收波长为多糖最大吸收波长为206 nm。.41生物分子的紫外-可见吸收光谱脂脂脂脂肪肪230240 nm, 于有机溶剂中（如乙醇、正己烷等）.42类类脂脂维生素维生素A326 nm于乙醇于乙醇CH3CH3CH3CH3CH3CH3C
16、H3CH3CH3CH3番茄红素番茄红素番茄红素在溶剂正己烷中的谱图番茄红素在溶剂正己烷中的谱图番茄红素在溶剂石油醚中的谱图番茄红素在溶剂石油醚中的谱图生物分子的紫外-可见吸收光谱.43 生物分子的紫外-可见吸收光谱蛋白质蛋白质Proteins in solution absorb ultraviolet light with absorbance maxima at 280 and 200 nm. Amino acids with aromatic rings are the primary reason for the absorbance peak at 280 nm. Peptide b
17、onds are primarily responsible for the peak at 200 nm. 酪氨酸酪氨酸 H2NCHCCH2OHO H2NCHCCH2OHOOHH2NCH CCH2OHOHN色氨酸色氨酸 苯丙氨酸苯丙氨酸.44生物分子的紫外-可见吸收光谱核酸核酸嘌呤和嘧啶在嘌呤和嘧啶在250280 nm有强有强的吸收作用，综合起来在的吸收作用，综合起来在260 nm吸收值最大。吸收值最大。Tips：1. 吸收强度：单核苷酸吸收强度：单核苷酸 单链单链DNA 双链双链DNA （增色效应、减色效应）（增色效应、减色效应）2. A260/A2801.82.0，DNA较纯较纯A260
18、/A280 2.0，DNA样品中含有样品中含有RNA.45微生物的紫外-可见吸收光谱600 nm测细菌等微生物的浊度，测细菌等微生物的浊度，用于估计细菌的生长情况。用于估计细菌的生长情况。 比如，比如，得到的得到的OD600的数值如果在的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，的对数生长期，OD6003表明细表明细菌已经饱和等。菌已经饱和等。.46核酸蛋白测定仪Eppendorf BioPhotometer plus .47ELISA原理图原理图 固相的抗原或抗体（固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（酶标记的抗原或抗
19、体（标记物）标记物）酶作用的底物（酶作用的底物（显色剂）显色剂）酶标仪.48酶标仪Tecan Infinite 200 Pro多功能酶标仪ELISA酶酶 底底 物物显色反显色反应应 测定波长测定波长 辣根过氧化物辣根过氧化物酶酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-连胺基连胺基-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 4
20、00500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450420 .49分子荧光光谱分子荧光光谱.50什么是荧光光谱某些物质经紫外某些物质经紫外-可见光照射后，能立即放出能可见光照射后，能立即放出能量较低（亦即波长较长）的光量较低（亦即波长较长）的光光致发光光致发光。当照射停止后，如化合物的发射在当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停秒钟内停止，则称止
21、，则称荧光荧光(fluorescence); 超过此限度即称为超过此限度即称为磷光磷光(phosphorescence)。.51什么是荧光光谱.52基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2荧光发射：荧光发射：当分子处于单重激发态的最低振动能层时，当分子处于单重激发态的最低振动能层时，去活化的一种形式是以去活化的一种形式是以10-910-7s左右的短时间左右的短时间内发射光子返回基态，这一过程称为荧光发射。内发射光子返回基态，这一过程称为荧光发射。.53激发光谱.54发射光谱(荧光光谱).55.56.57.58.59.60荧光量子产率（荧光效率）)()(afFII吸收的光强荧光强
22、度吸收的光量子数发射的光量子数 n1iiFFFkkk .61荧光与有机化合物的结构1. * 是有机化合物产生荧光的主要跃迁是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。类型。2. 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光越容易产生。系，共轭体系越大，荧光越容易产生。产生荧光的条件产生荧光的条件.62荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。荧光与有机化合物的结构.63荧光强度与浓度的关系CKIF .64荧光的淬灭.65荧光能量共振转移（FRET）能量共振转移（能量共振转移（FRET）Fluorescence Resonance Energy Tra
23、nsfer相互作用的研究相互作用的研究.66荧光分光光度计.67荧光分光光度计.68荧光分光光度计Hitachi F-7000.69荧光分光光度计.70紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计测量池测量池( (吸收池吸收池) )荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池I0ItI0ItIF,p荧光分光光度计.71荧光光谱的应用.72荧光光谱的应用在生物学研究中，科学家们利用能发光的荧光分子对生物在生物学研究中，科学家们利用能发光的荧光分子对生物体进行标记。将荧光分子通过化学方法体进行标记。将荧光分子通过化学方法“挂在挂在”其他其他“不可不可见见”的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家
24、的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家利用这种标记方法，把原本透明的细胞、细胞器或生物分子利用这种标记方法，把原本透明的细胞、细胞器或生物分子从黑暗的显微镜视场中从黑暗的显微镜视场中“揪出来揪出来”。 量子点量子点（无机纳米粒子）（无机纳米粒子）荧光染料荧光染料（有机小分子）（有机小分子）荧光蛋白荧光蛋白（蛋白质）（蛋白质）.73荧光光谱的应用Midori Green Ethidiumbromide .74荧光光谱的应用SYBR Green I.75荧光光谱的应用.76荧光光谱的应用.77荧光光谱的应用.78荧光光谱的应用下村修等人于下村修等人于1962年在一种学名为年在一种学名为A
25、equorea victoria的水母中发现能发的水母中发现能发光的蛋白光的蛋白绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）。分子质）。分子质量为量为26kDa，由，由238个氨基酸构成。个氨基酸构成。2008年诺贝尔化学奖授予了下村修以及另外两位科学家（美国年诺贝尔化学奖授予了下村修以及另外两位科学家（美国科学家马丁科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健），以表彰他们发沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健），以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。现和发展了绿色荧光蛋白质技术。.79细细胞胞标标记记荧光光谱的应用.80活活体体标标记记荧光光谱的应用.8
26、11.传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性光毒性”，因此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧因此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞，在毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞，在GFP出现之出现之前这完全不可想象。前这完全不可想象。2.荧光蛋白与靶蛋白的连接可直接通过二者表达基因的荧光蛋白与靶蛋白的连接可直接通过二者表达
27、基因的融合，转导至宿主细胞，在宿主细胞中翻译表达出靶蛋融合，转导至宿主细胞，在宿主细胞中翻译表达出靶蛋白与荧光蛋白的复合体。白与荧光蛋白的复合体。绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白荧光光谱的应用.82可以发出各种颜色可以发出各种颜色荧光的荧光蛋白荧光的荧光蛋白荧光光谱的应用.83荧光光谱的应用量子点(quatum dots)Cd/Pb/Zn-S/Se/Te.841.1.量子点的荧光强度比常用的有机荧光材料高几十倍。量子点的荧光强度比常用的有机荧光材料高几十倍。2.2.高稳定性，有机荧光材料会遭遇高稳定性，有机荧光材料会遭遇光漂白光漂白，长时间激发，长时间激发后造成荧光效率的不断降低；量子点则可承受长时间
28、高后造成荧光效率的不断降低；量子点则可承受长时间高强度的激发。强度的激发。3.3.量子点的激发光范围广，而发射光范围窄。量子点的激发光范围广，而发射光范围窄。 （这意味着什么？）（这意味着什么？）量子点量子点荧光光谱的应用当需要同时荧光标记几个不同靶标时，量子点较广的激发范围当需要同时荧光标记几个不同靶标时，量子点较广的激发范围意味着可以在同一激发光波长下同时激发不同的量子点。意味着可以在同一激发光波长下同时激发不同的量子点。而窄范围的发射光范围则使得不同量子点发出的不同颜色的荧而窄范围的发射光范围则使得不同量子点发出的不同颜色的荧光更易鉴别和测量，减少了干扰。光更易鉴别和测量，减少了干扰。个人观点供参考，欢迎讨论！
