1、APTAMER适配体1Aptamers (from the Latin aptus - fit, and Greek meros - part)S核酸适配体（Nucleic Acid aptamers）S多肽适配体（Peptide aptamers）2什么是核酸适配体？S核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合的，人工合成的核酸。它可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为2560个核苷酸。它是一系列单链核酸分子，与长度相同的特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞和组织等。3核
2、酸适配体概念的提出S1989年，悉尼奥尔特曼、托马斯切赫因为对RNA的催化作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。4支持RNA为生命起源假说的可能证据：S如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生物；S如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能性RNA的痕迹；S如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生命活动的RNA序列。5生命活动的基础是什么？-Binding!S如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那我们就向证明RNA起源说迈出了一步。S1990年，两个研究组几乎同时用T4 DNA polymerase与几种有机染料做靶分别筛选出了特异性结合的RNA分
3、子，并把这种RNA叫做aptamer。S1992年Ellington和Szostak又用相似的方法筛选出了可以和靶分子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。1Tuerk C, Gold L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249:50510；2 Ellington AD, Szostak JW. 1990. In
4、vitro selection of RNA molecules that bind specificligands. Nature 346:818226自然界中Aptamer存在的证据：RiboswitchesSRiboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expressionS核糖开关是2002年，由耶鲁大学的分子生物学家RonaldBreaher和他的同事在受Andrew等人的研究成果启发下发现并命名的，它是能够与代谢物或其他小分子配体结合，通过构象变化调控目的基因转录或翻译的RNA结构元件。7Aptamer巨
5、大的应用前景SAPTAMERS: AN EMERGING CLASS OF THERAPEUTICS（.Annu. Rev. Med. 2005. 56:55583）SAnalytical Applications of Aptamers(Andrew D. Ellington .Annual Review of Analytical Chemistry (2008). Volume 1, Jul 2008)8核酸适配体的第一个临床应用S2005年12月20日，美国FDA宣布批准哌加他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科疾病新生血管型（湿性）老年黄斑病变（Age-Related Macul
6、ar Degeneration，AMD）患者的视力缓慢丧失。SMacugen是一种选择性血管内皮生产因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）拮抗剂。9核酸适配体的化学本质与识别机理S核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间有较大的接触面积，能与靶
7、物质的紧密结合，具有高亲和力和高特异性。S经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高，kd值多在pmol/L-nmol/L之间。1011Structure of an RNA aptamer specific for biotin. The aptamer surface and backbone are shown in yellow. Biotin (spheres) fits snugly into a cavity of the RNA surface12核酸适配体的筛选策略S核酸适配体的体外筛选是利用SELEX技术（System
8、atic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) ）来完成的，SELEX是指数富集配体系统进化的简称，它的基本原理就是就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20100个碱基左右将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基(aptamer) ，经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。13SELEX筛选流程S首先，确立筛选方法。根据不同的配体选择具有不同特性的适配体并以此确定具体的适配体筛选方法；S其次，建立筛选文库。人工建立一个约含有1015个不同寡核苷酸
9、的随机序列库，随机序列的两端为固定序列，是之后PCR循环中要用的，如果是筛选RNA-aptamer，要在5端引物中加上一段T7启动子，以便识别转录过程中所需要的T7 RNA聚合酶，把靶分子加入到该库中，充分结合后，将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。S然后，通过PCR或RT-PCR等技术进行扩增，生成次一级文库，次一级文库再与配体结合，反复多次循环，随着每一轮筛选条件的不断提高，与靶目标高度特意结合的DNA或RNA分子呈指数增长，而亲和力低的序列逐步被淘汰，直到获得合适的序列。14 筛选流程图15核酸适配体筛选中的分离方法S毛细管电泳S超滤离心膜分离法S硝酸纤维素膜分离法S亲和介质分离用SE
10、LEX技术筛选核酸适配体的过程中，关键步骤之一是对结合靶分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。主要分离方法有：16毛细管电泳S毛细管电泳的原理是基于不同组间荷质比差异导致的电泳迁移率不同而进行分离，在电场中，待分离组分在5075m内径的毛细管中因荷质比差异导致不同的迁移速度而得到分离，当靶分子与其aptamer亲和作用足够强,形成的复合物足够稳定时，在合适的分离和检测条件下，可分别得到游离的寡核苷酸与复合物的电泳峰。17超滤离心膜分离S超滤离心膜有两部分组成，一部分为滤膜滤芯另一部分为套管，进行分离离心时套管套住滤芯，将需要分离的液体加在滤芯上通过高速离心将不与靶标结合的游离寡核苷酸滤掉，
11、将与靶标特异性结合的ssDNA留在超滤离心膜上。超滤滤离心膜在SELEX技术中的应用可以满足分离要求，而且操作简便。18亲和介质分离S一些具有亲和表面的介质也用于适配体的筛选，如琼脂糖、纤维素及具有亲和表面的小珠或小柱等。S如J.Colin Cox等人利用链霉亲和素标记的磁珠完成了溶菌酶适配体的自动化筛选。具体流程为：通过链酶亲和素与生物素的相互作用，将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设定的程序自动完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，Cox等只用了不到两天的时间就完成了12轮的筛选。19核酸适配体的应用S
12、核酸适配体在分析化学中的应用S核酸适配体与疾病诊断和新药研发20核酸适配体在分析化学中的应用S靶物质的分析与检测 该方面应用的基本思路是将各种报告基团，如荧光试剂，定点标记在aptamer核苷酸上，然后在一定条件下，使aptamer与靶物质发生相互作用，再通过对报告基团的信号检测实现对靶物质的定性检测或定量分析。 Tan等将aptamer应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法分子aptamer信标(MAB)。他们将凝血酶aptamer的5和3端分别标记上荧光素和猝灭剂，凝血酶不存在时，aptamer分子呈茎环结构，两端的荧光素与猝灭剂相互靠近发生能量转移而观察不到荧光；在
13、结合凝血酶后aptamer分子构象改变，致使MAB的荧光素与猝灭剂分开从而可以检测到荧光信号，并且随着凝血酶浓度的增加荧光强度增强。21S蛋白质检测 Lindner等发展了一种基于aptamer芯片的蛋白质检测方法，将能特异识别IgE的ssDNA-aptamer和IgE抗体分别固定在芯片上，然后将IgE与其温育，发现aptamer对IgE的特异性和敏感性比IgE抗体更好。该方法对IgE的检测限达到10ng/ml。 Lindner等还通过aptamer芯片系统成功地从混合蛋白质中识别出专一性的蛋白，而且利用凝血酶aptamer证明了在同一芯片上同时检测两种蛋白方法的可行性。总之，寡核苷酸apta
14、mer作为低分子量的分子受体，它在芯片上能专一性地检测蛋白质而且很稳定，以它为阵列来捕获蛋白质将为蛋白质组学研究的发展起到重要作用。22S基于适配体的生物传感器是用适配体作为识别元件来特异性地检测其相应的靶物质。S目前适配体生物传感器（Aptasensors）尚处于起步阶段。Chunyan Yao等将IgE适配体固定在石英晶体微平衡生物传感器阵列，建立了适配体压电石英生物传感器模型，用于特异性检测标准溶液和人血清中的IgE。该方法最低可在标准和人血清溶液中分别检测出2.5-200 ug/L的IgE，整个检测时间只需15 min，而且固定在金膜表面的适配子在反复洗脱后并不影响其灵敏度。23S针对
15、三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子 优先结合,而带有正电荷的 PDDA 会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集,从而颜色由红变蓝实现比色法测定 水产品等间接摄入方式。Kim 等人筛选出一种核酸适配体通过构型转换形成特定的二级结构用于绑定地下水中三价砷和五价砷，结合常数分别可达 7nmol/L 和 5nmol/L12。Zhou 等人通过核酸适配体和金纳米粒子利用比色法实现对三价砷离子的快速检测，针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子优先结合，而带有正电荷的 PDDA 会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集，从而颜色由红变蓝实现比色法测定(见图 2)，检出限可达 5.3ppb1
16、3。 图 2 核酸适配体用于 As3+的检测示意图 Fig.2.Schematic representationof detection of As3+ using aptamer 汞离子是一种高毒性并分布广泛的污染物，在鱼类及贝类中常常以甲基汞的形式存在。汞通过食物摄入后对人体的危害主要累及中枢神经系统、消化系统及肾脏，此外对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛也有一定的影响。 Chang 等人利用核酸适配体与铅和汞分别形成 G-quartet 结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定(见图 3)14。Choo 等人开发了一种表面增强拉曼光谱微滴传感器，利用核酸适配体修饰的纳米粒子实现了对汞离子的
17、高灵敏快速检测，检测限可达 10pmol/L15。 图 3 核酸适配体同时检测Hg2+和 Pb2+示意图 Fig.3 Schematic representationof simultaneous detection of Hg2+ and Pb2+ using aptamer 钾离子是一种重要的生理指标离子，维持着细胞的正常功能，参与多种新陈代谢过程鍄与糖原和蛋白质合成有密切关系。钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的 G-quadruplex 二级构型并对此结构有一定的稳定作用，因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对钾离子的检测(见图 4)16。 24 水产品等间接摄入方
18、式。Kim等人筛选出一种核酸适配体通过构型转换形成特定的二级结构用于绑定地下水中三价砷和五价砷，结合常数分别可达 7nmol/L 和 5nmol/L12。Zhou 等人通过核酸适配体和金纳米粒子利用比色法实现对三价砷离子的快速检测，针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子优先结合，而带有正电荷的 PDDA 会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集，从而颜色由红变蓝实现比色法测定(见图 2)，检出限可达 5.3ppb13。 图 2 核酸适配体用于 As3+的检测示意图 Fig.2.Schematic representationof detection of As3+ using apta
19、mer 汞离子是一种高毒性并分布广泛的污染物，在鱼类及贝类中常常以甲基汞的形式存在。汞通过食物摄入后对人体的危害主要累及中枢神经系统、消化系统及肾脏，此外对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛也有一定的影响。 Chang 等人利用核酸适配体与铅和汞分别形成 G-quartet 结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定(见图 3)14。Choo 等人开发了一种表面增强拉曼光谱微滴传感器，利用核酸适配体修饰的纳米粒子实现了对汞离子的高灵敏快速检测，检测限可达 10pmol/L15。 图 3 核酸适配体同时检测Hg2+和 Pb2+示意图 Fig.3 Schematic representationof s
20、imultaneous detection of Hg2+ and Pb2+ using aptamer 钾离子是一种重要的生理指标离子，维持着细胞的正常功能，参与多种新陈代谢过程鍄与糖原和蛋白质合成有密切关系。钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的 G-quadruplex 二级构型并对此结构有一定的稳定作用，因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对钾离子的检测(见图 4)16。 利用核酸适配体与铅和汞分别形成 G-quartet 结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定 25S钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的 G-quadruplex 二级构型并对此结构 有
21、一定的稳定作用,因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对钾离子的检测 水产品等间接摄入方式。Kim 等人筛选出一种核酸适配体通过构型转换形成特定的二级结构用于绑定地下水中三价砷和五价砷，结合常数分别可达 7nmol/L 和 5nmol/L12。Zhou 等人通过核酸适配体和金纳米粒子利用比色法实现对三价砷离子的快速检测，针对三价砷的核酸适配体在三价砷离子存在的情况下与砷离子优先结合，而带有正电荷的 PDDA 会导致带负电荷的金纳米粒子的聚集，从而颜色由红变蓝实现比色法测定(见图 2)，检出限可达 5.3ppb13。 图 2 核酸适配体用于 As3+的检测示意图 Fig.2.Schem
22、atic representationof detection of As3+ using aptamer 汞离子是一种高毒性并分布广泛的污染物，在鱼类及贝类中常常以甲基汞的形式存在。汞通过食物摄入后对人体的危害主要累及中枢神经系统、消化系统及肾脏，此外对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛也有一定的影响。 Chang 等人利用核酸适配体与铅和汞分别形成 G-quartet 结构和发卡结构的构型实现了对铅和汞的同时测定(见图 3)14。Choo 等人开发了一种表面增强拉曼光谱微滴传感器，利用核酸适配体修饰的纳米粒子实现了对汞离子的高灵敏快速检测，检测限可达 10pmol/L15。 图 3 核酸适配体同时
23、检测Hg2+和 Pb2+示意图 Fig.3 Schematic representationof simultaneous detection of Hg2+ and Pb2+ using aptamer 钾离子是一种重要的生理指标离子，维持着细胞的正常功能，参与多种新陈代谢过程鍄与糖原和蛋白质合成有密切关系。钾离子能够使富含鸟嘌呤的核酸适配体形成特异的 G-quadruplex 二级构型并对此结构有一定的稳定作用，因此可以通过监测核酸适配体二级结构信号的变化实现对钾离子的检测(见图 4)16。 26 图 4 荧光核酸适配体检测K+的示意图 Fig.4 Schematic representa
24、tionof fluorescencedetection of K+ using aptamer 1.2 有机小分子 从 2003 年欧盟报道第一起苏丹红报道后，相继在辣椒及其相关制品、咖喱及棕榈油中发现其他的非法添加色素。这些非法添加色素都具有致癌性、致敏性和遗传毒性17。罗丹明 B 就是一种非法添加色素，虽然还没有针对罗丹明 B 的核酸适配体，但是已经有利用磺酰罗丹明 B 的 DNA 和 RNA 核酸适配体，对磺酰罗丹明 B 进行检测的文献报道18-19。 双酚 A(bisphenol A)是已知的内分泌干扰素。19 世纪 30 年代中期人们就发现了双酚 A 可以发挥雌激素的作用扰乱人体内
25、的代谢过程。2010 年，加拿大成为首个将之列为有毒物质的国家。在欧盟和加拿大，双酚 A 被禁止用于生产婴儿奶瓶。Zheng 等人利用核酸适配体对金纳米离子聚集状态的影响开发了一种灵敏的无修饰一步快速检测双酚 A 的方法，在不存在双酚 A 的情况下，核酸适配体吸附在金纳米粒子表面，使其不受金属离子的聚集作用，当溶液中存在双酚 A，适配体与双酚 A 特异性结合，金纳米粒子失去了核酸适配体的保护在金属离子的作用下发生聚集，颜色由红变蓝，可以通过肉眼判别实现对双酚 A 的检测。该方法的检测限可达 0.1ng/mL(见图 5)20。Kim 小组筛选出双酚 A 的核酸适配体，并开发了一种基于三明治结构核
26、酸适配体的双酚 A 生物传感器。将一段核酸适配体固定在传感器表面用于对双酚 A 的捕获，另一段荧光标记的核酸适配体通过三明治结构连接到传感器表面， 通过荧光信号的强弱实现对双酚 A浓度的检测11。 图 5 利用核酸适配体灵敏快速检测双酚 A 的示意图 Fig.5 Schematic representationof rapid visual detection of bisphenol A by label-free aptasensor 2008 年 9 月,中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件,导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症,其原因是奶粉中含有三聚氰胺(melamine)。三聚氰胺
27、事件对中国乳制品行业造成了重大的影响。此后三聚氰胺已成为我国乳及相关制品的必检项目之一。Liang 等人通过核酸适配体修饰的银纳米粒子利用共振散射实现对三聚氰胺的检测(见图 6)21。 图 6 基于核酸适配体修饰的银纳米离子利用光散射检测三聚氰胺 Fig.6.Schematic representationof resonance scattering detection of trace melamine using aptamer-modified 在不存在双酚 A 的情况下,核酸适配体吸附在金纳米粒子表面, 使其不受金属离子的聚集作用,当溶液中存在双酚 A,适配体与双酚 A 特异性结合,
28、金纳米粒子失去了核酸适配体的保护在金属离子的作用下发生聚集,颜色由红变蓝,可以通过肉眼判别实现对双酚 A 的检测。 该方法的检测限可达 0.1ng/mL 27基于核酸适配体的可卡因快速检测芯片及原理图 nanosilver probe 可卡因(cocain)是种很有效的中枢神经兴奋剂。由可卡因引起的反应包括有兴奋、自信、活力增加、心跳加速、 瞳孔扩大、 发烧、 发抖和出汗。 持续摄取可卡因可增加耐药性和药物依赖， 从而导致滥用。 Takeuchi小组利用可卡因核酸适配体与客体之间的特异性结合，制备了可卡因快速检测芯片，实现对可卡因的快速检测(见图 7)22。Landry 小组利用可卡因核酸适配
29、体和染料，通过比色法实现了对可卡因的快速肉眼检测23。 图 7 基于核酸适配体的可卡因快速检测芯片及原理图 Fig.7 Schematic representationof aptamer based chip for cocain rapid detection 1.3 抗生素 抗生素是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染的药物。在饲料中添加抗生素能提高动物和家禽的生长和饲料效益。最近有关在饲料中添加抗生素培育速成鸡的新闻报道，将抗生素推到食品安全聚光灯之下，食品安全中的抗生素已成为当前的热门话题。饲料中的抗生素会在畜禽肉中残留，而成为一种潜在的食品安全问题。欧盟在 2006 年就规定禁
30、止在饲料中添加抗生素，同时简单、快速、灵敏的抗生素检测方法相继被开发被用于检测动物及相关产品中抗生素的含量。近年来，基于核酸适配体检测抗生素的文献报道较多， 分别涉及电化学法、 比色法、 表面等离子共振等方法，涉及的种类有卡那霉素(Kanamycin)24、妥布拉霉素(Tobramycin)25、 四环素(Tetracycline)26、氯霉素(Chloramphenicol)27、 链霉素(Streptomycin)28、新霉素(Neomycin)29、土霉素(Oxytetracycline) 30等。 1.4 真菌毒素 真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。
31、真菌毒素可以通过食物进入人体，引起人体急性中毒、慢性中毒，具有致畸、致癌以及致突变作用等。Kuang 等人开发了一种基于核酸适配体并利用信号关闭模式的电化学检测平台，并实现对赭曲霉毒素 A(Ochratoxin A)的快速灵敏检测。首先将三种单链 DNA 固定在电极表面，其中一种为赭曲霉毒素 A 的核酸适配体，通过核酸适配体与目标物的特异性结合改变了亚甲基蓝在电极表面的电化学性质，利用金纳米粒子对信号放大，实现了对赭曲霉毒素 A 的高灵敏快速检测，检测线可达 30pg/mL31。Yang 小组开发了一种利用未修饰的金纳米粒子实现对赭曲霉毒素 A 的比色法快速检测。在目标物赭曲霉毒素 A 存在的
32、情况下，核酸适配体与赭曲霉毒素 A 形成了 G-quadruplex 结构，而金纳米粒子在 Mg2+的作用下发生聚集导致颜色变化，整个反应过程在 5 分钟内完成，检测线可达 20nmol/L32。利用核酸适配体检测赭曲霉毒素 A 的方法也很多，有电化学法30、电致化学发光法33、比色法34、荧光法35、试剂条法36(见图 8)等。 28核酸适配体与疾病诊断和新药研发S疾病诊断 SELEX在疾病诊断与成像方面显示出巨大的应用潜力，已有荧光标记的抗人凝血素核酸配基用于体内诊断的报道。作为示踪剂寡核苷酸适配子具备了作为导向剂所需的所有特性，其分子可结合放射性核素、毒素等。并递送到靶组织，Hicke等
33、称之为护送适配子(escort aptaraer)它同时具有直接抑制靶蛋白的功能。是非常有潜力的体内显像和治疗药物。29SNon-modified aptamers are cleared rapidly from the bloodstream, with a half-life of minutes to hours, mainly due to nuclease degradation and clearance from the body by the kidneys, a result of the aptamers inherently low molecular weight.
34、SUnmodified aptamer applications currently focus on treating transient conditions such as blood clotting, or treating organs such as the eye where local delivery is possible. SThis rapid clearance can be an advantage in applications such as in vivo diagnostic imaging.30SSchematic representation of t
35、he novel strategy for in vivo cancer imaging using activatable aptamer probe (AAP) based on cell membrane protein-triggered conformation alteration. The AAP consists of three fragments: a cancer-targeted aptamer sequence (A-strand), a poly-T linker (T-strand), and a short DNA sequence (C-strand) com
36、plementary to a part of the A-strand, with a fluorophore and a quencher attached at either terminus. In the absence of a target, the AAP is hairpin structured, resulting in a quenched fluorescence. When the probe is bound to membrane receptors of the target cancer cell, its conformation is altered,
37、thus resulting in an activated fluorescence signal.S湖南大学王柯敏教授，湖南大学王柯敏教授，Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Mar 8;108(10):3900-531SSeveral modifications, such as 2-fluorine-substituted pyrimidines, polyethylene glycol (PEG) linkage, etc. (both of which are used in Macugen, an FDA-approved aptamer) are av
38、ailable to scientists with which to increase the serum half-life of aptamers easily to the day or even week time scale.32SAnother approach to increase the nuclease resistance of aptamers is to develop Spiegelmers, which are composed entirely of an unnatural L-ribonucleic acid backbone. SA spiegelmer
39、 of the same sequence has the same binding properties of the corresponding RNA aptamer, except it binds to the mirror image of its target molecule.33SIn addition to the development of aptamer-based therapeutics, many researchers such as the Ellington lab and independently another company SomaLogic (
40、Boulder, CO) have been developing diagnostic techniques for aptamer based plasma protein profiling called aptamer plasma proteomics. This technology will enable future multi-biomarker protein measurements that can aid diagnostic distinction of disease versus healthy states.34S新药研发 在新药研发方面，aptamer可以鉴
41、定药物靶标，尤其是多道自动工作站的应用更是加速药物靶标高通量筛选和功能鉴定的进程. Aptamer可以作为药物分子或先导分子以及作为生物导弹指导靶向治疗利用SELEX技术筛选获得的针对VEGF的RNA配基(aptamer)，经过美国Eyetech和Pfizer制药公司15年的研制， 已经于2004年12月获得美国FDA批准上市，商品名为Macugen，用于老年性视网膜黄斑营养不良(AMD)的治疗。同时，根据aptamer的反义序列设计的antidote还可作为解毒剂与aptamer联合应用，及时清除体内过量aptamer分子，在心血管疾病，抗病毒药物，肿瘤治疗方面都具有广阔的前景35核酸适配体
42、与抗体的比较与传统抗体相比，核酸适配体具有其无法比拟的性能和优势:S寡核苷酸序列库的筛选是通过化学方法合成的，不依赖于生物体，可以大量的快速的在体外合成；S可以针对不同的目标靶进行筛选，包括生物毒性大分子以及只具有半抗原的分子，且目标范围比较广；S核酸适配体具有和抗体相当甚至更高的亲和性以及较高的热稳定性，变性的适配体也很容易再生；S核酸适配体的纯度高，批间差异比抗体要小；S适配体末端易于连接一些活性基团，容易被固定在基质上，末端指示基团的修饰比抗体容易的多。36S核酸适配体与目标物的结合是依靠四种基本核苷酸组成的结构，与由二十种基本氨基酸残基组成的抗体蛋白质相比，其可能的结合形式远不如后者丰
43、富。这可能会限制高亲和力或特异性核酸适配体的获得。但是，需要指出的是，某些化合物与核酸适配体的亲和力比其已知的单克隆抗体的亲和力高，双酚A就是一个典型例子。 37S作为只有几十个核苷酸残基组成的聚合物，核酸适配体的构象受环境条件影响较大，pH值、离子强度、干扰离子等的变化都有可能影响核酸适配体与目标物的亲和力。另外，实际样品中可能存在的核酸酶也可能影响到适配体结构的稳定性。因此，核酸适配体在实际应用中的适应性是一个急需解决的问题。S另外，小分子核酸适配体的常规筛选策略是将小分子固定在固相载体上，利用SELEX技术筛选与固定化小分子有较高亲和力的寡核苷酸。但是，这种连接可能会掩盖或破坏小分子的结
44、构特征或电荷分布，从而使这些寡核苷酸与游离小分子的亲和力可能并不高53。解决这一问题的思路之一是尝试研究能够对游离化合物进行适配体筛选的方法。 38核酸适配体的前景展望S核酸适体（Aptamer）是一类新型的识别分子。与单克隆抗体相比，其分子量较低(15-50碱基)，没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、结构改造以及标记，化学稳定性好，能可逆的变性与复性，可在常温下保存和运输。这些优点使适体有望取代和超过抗体，在生命分析中起重要的作用。S但是目前核酸适配体的分析应用仍处于方法学的探索阶段，大部分集中于几个特定靶分子(如凝血酶、ATP等)的分析。核酸适配体的筛选是一个复杂、冗长的过程，影响因素
45、很多，成功率不高。筛选出的核酸适配体链较长，还需进行结构优化、结合机理研究等表征后才能更好的被应用。39 基于目前的现状和机遇，我们可以从以下四个方面开展核 酸适体的研究工作：S首先根据研究和实际应用的需要，筛选重要的生物活性分子的适体，从而发展系列的针对特定分子的分析方法。S研究所筛选适体的结构特性，优化、改造适体的结构，从而进一步缩小适体的分子大小、提高生物稳定性、增加在复杂生物体系中特异性。S注重核酸适配体与其他分析技术的结合以扩展分析范围或提高分析效果，如荧光技术、毛细管电泳、亲和色谱等；S此外，也要针对应用的需要，构建更为方便、使用的核酸适配体筛选方法。40Peptide aptam
46、ersSPeptide aptamers are proteins that are designed to interfere with other protein interactions inside cells. SThey consist of a variable peptide loop attached at both ends to a protamersein scaffold. SThis double structural constraint greatly increases the binding affinity of the peptide aptamer t
47、o levels comparable to an antibodys (nanomolar range).41SThe variable loop length is typically composed of ten to twenty amino acids, and the scaffold may be any protein which has good solubility and compacity properties. SCurrently, the bacterial protein Thioredoxin-A is the most used scaffold prot
48、ein, the variable loop being inserted within the reducing active site, which is a -Cys-Gly-Pro-Cys- loop in the wild protein, the two Cysteines lateral chains being able to form a disulfide bridge.42参考文献S1Tuerk C，Gold L.Science，1990，249：505-5l0S2李晓佩，杨良嵘，黄昆等.核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展.化工学报，2013,64(1):233-
49、242S3Ellington A D，Szostak J WIn vitro selection of RNA molecules that bind specific ligandsJNature，1990，346:818-822S4Burgstauer P，Girod A，Blirld MDmg Discovery T0day，2002，7(24)：122l-1228S5王巍，贾凌云.适配体筛选方法研究进展.分析化学评述与进展，2009,37(3):454-46043S6Li J W，Fang X H，Tan W HBiochemBiophy.ResCommun.2002,292:3l-4
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