1、第二章第二章 蛋白质分子设计蛋白质分子设计 Chapter two Protein Design .引言引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多外的许多重要任务重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用抗体起到防护的作用; ;从生态角度，蛋白质也是非常从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质理想的物质: :生物合成不需要消耗很多能量生物合成不需要消耗很多能量专一性很强专一性很强不产生副作用并且能很快降解不产生副作用并且能很快降解 .蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因蛋白质没有像
2、化学试剂那样被普遍应用，其原因: :(1)(1)蛋白质分子量非常大蛋白质分子量非常大(10 000-1 000 000)(10 000-1 000 000)，不能通过化学方法生产不能通过化学方法生产; ;(2)(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下它条件下( (如在有机溶剂中如在有机溶剂中) )是不稳定的是不稳定的; ;(3)(3)专一性致使其应用范围受到影响。专一性致使其应用范围受到影响。 蛋白质应用受限的原因蛋白质应用受限的原因.蛋白质设计目前存在的问题蛋白质设计目前存在的问题1 1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明与天然的蛋白质
3、比较，缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性显的功能优越性2 2、三级结构的确定性较差、三级结构的确定性较差.计算机模拟计算机模拟突变蛋白质产品突变蛋白质产品功能分析功能分析基因构建基因构建Pr 设计循环第一节第一节 蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理.一、蛋白质分子设计的分类一、蛋白质分子设计的分类 设计的目的主要有两个：设计的目的主要有两个： 一是一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；增加活性，降低副作用，提高专一性等； 二是二
4、是探索蛋白质的折叠机理探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。定性和定量的规律。 .（一）蛋白质分子设计的层次（一）蛋白质分子设计的层次 分为两个层次：分为两个层次： 一是一是在蛋白质三维结构已知基础上的分在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计子设计 ； 二是二是在三维结构未知的情况下，借助一在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工
5、作。子设计工作。 .（二）蛋白质分子设计的分类（二）蛋白质分子设计的分类 1定点突变或化学修饰法定点突变或化学修饰法 2拼接组装设计法拼接组装设计法 3从头设计全新蛋白质从头设计全新蛋白质.二、蛋白质分子设计的原则二、蛋白质分子设计的原则 1活性设计活性设计 2对专一性的设计对专一性的设计 3Scaffold设计设计(框架框架) 4疏水基团与亲水基团需合理分布疏水基团与亲水基团需合理分布 5最优的氨基酸侧链几何排列最优的氨基酸侧链几何排列. 蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理内核假设内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十
6、分保守的区域）核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）PrPr内部都是密堆积内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠合一个水分子或惰性气体），没有重叠所有内部的氢键都是最大满足的所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力. 蛋白质分
7、子设计原理蛋白质分子设计原理金属金属PrPr中配位残基的替换要满足金属配位几何中配位残基的替换要满足金属配位几何。要。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属对于金属PrPr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。链的相互作用。最优的最优的aaaa侧链几何排列侧链几何排列。PrPr侧链构象由空间两个立侧链构象由空间两个立体
8、因素所决定体因素所决定( (一是立体势垒，二是一是立体势垒，二是aaaa的位置的位置) )结构及功能的专一性。结构及功能的专一性。这是这是PrPr设计最困难的问题设计最困难的问题.序列设计序列设计 设计设计螺旋螺旋时，应选择象时，应选择象Leu、Glu等易等易于形成于形成螺旋的残基；螺旋的残基； 设计设计全全结构结构时，应选择时，应选择Val、Ile等易于等易于形成形成折叠片的残基；折叠片的残基； 而在设计而在设计转角转角时常选择时常选择Pro-Asn残基对。残基对。 .溶菌酶结构溶菌酶结构 例如例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计分子的设计 Cutte成功设计了一个具有明
9、显成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的的核酸酶活性的34肽，该肽可水肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。 其主要活性源于二聚体；而其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA。. 设计步骤设计步骤蛋白质分子设计步骤图蛋白质分子设计步骤图修正设计修正设计获得目标蛋白质获得目标蛋白质序列合成序列合成检测检测结构信息分析结构信息分析建立结构模型建立结构模型设计目标设计目标蛋白质数据库蛋白质数据库.第二节第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋
10、白质结构的分子设计有两类基于天然蛋白质结构的分子设计有两类 ： 一是一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，进行蛋白质修饰或基因定位突变，即即“小改小改”； 二是二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中中改改”。 .一、定位突变 基于天然蛋白质结构的蛋白质分子基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改小改”是指对已知结构的蛋白质进行是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为法，主要可分为蛋白质修饰蛋白质修饰和和基因定位基因定位突变突变两类。两类。 .（一
11、）定位突变的设计目标及解决方法（一）定位突变的设计目标及解决方法 定位突变常见的设计定位突变常见的设计目标目标是提高蛋白质的是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关功能关系的研究等。系的研究等。 .Hartley等于等于1986年完成了一个设计目标及年完成了一个设计目标及解决的办法解决的办法 ： 热稳定性热稳定性 对氧化的稳定性对氧化的稳定性 对重金属的稳定性对重金属的稳定性 pH稳定性稳定性 提高酶学性质提高酶学性质 引入二硫桥，增加内氢键数目，引入二硫桥
12、，增加内氢键数目，改善内疏水堆积改善内疏水堆积 把把CysCys转换为转换为AlaAla或或SerSer，把，把TrpTrp转换为转换为PhePhe或或TyrTyr 替代表面羧基，把替代表面羧基，把MetMet转换为转换为GlnGln、ValVal、IleIle或或LeuLeu 替换表面荷电基团，替换表面荷电基团，HisHis、CysCys以及以及TyrTyr的置换的置换 专一性的改变，增加逆转数，专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度改变酸碱度 .（二）定位突变的种类（二）定位突变的种类 要进行基因定位突变，改变要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成
13、、基因列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。直接修饰法、盒式突变技术等。 根据基因突变的方式，分为以下根据基因突变的方式，分为以下三类三类： 插入插入一个或多个氨基酸残基；一个或多个氨基酸残基； 删除删除一个或多个氨基酸残基；一个或多个氨基酸残基； 替换替换或取代一个或多个氨基酸残基。或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的，多采用体外要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组重组DNA技术或技术或PCR方法。方法。.（三）定位突变的程序（三）定位突变的程序1建立所研究蛋白质的结构模型建立所研究蛋白质的结构模型 可以通过可以通过X射线晶体学、二维核磁共
14、射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。构或其他结构预测方法建立起结构模型。 .2找出对所要求的性质有重要影响找出对所要求的性质有重要影响的位置的位置 在改造中如何恰当地选择在改造中如何恰当地选择突变残基突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。有的三维结构或分子模型。 .3预测突变体的结构预测突变体的结构 根据所选定的氨基酸残基位点及突根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行
15、变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较始的蛋白质结构比较 .4构建突变体，获得突变体蛋白构建突变体，获得突变体蛋白 依据所设计好的突变，利用化学合依据所设计好的突变，利用化学合成或成或PCR等方法构建突变体。进行基因等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。.5突变体蛋白质的检验突变体蛋白质的检验 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，性、催化活
16、性等， 并与对应的天然蛋白质进行比较，检验并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，突变设计的效果， 同时进一步修正设计方案。同时进一步修正设计方案。.蛋白质中功能蛋白质中功能残基的鉴定残基的鉴定根据结构信息根据结构信息确定残基的突变确定残基的突变突变方法鉴定突变突变方法鉴定突变功能残基功能残基利用蛋白质同源性利用蛋白质同源性鉴定功能残基鉴定功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定（四）蛋白质中功能残基的鉴定.1根据结构信息确定残基的突变根据结构信息确定残基的突变 最有效最直接的方法最有效最直接的方法 Alan Fersht和和GregWinter等测定了酪氨酰等测定了酪氨酰-tRNA合成
17、酶突变体的三维结构，通过分析该合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的酶的Cys35被结构相似的被结构相似的Ser所取代后的结构，所取代后的结构，发现发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。在结合腺苷酸部分的作用。 .2突变方法鉴定突变功能残基突变方法鉴定突变功能残基 随机突变技术随机突变技术 删除分析及连接片段扫描突变删除分析及连接片段扫描突变 .3利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基 高度保守的残基高度保守的残基
18、与同源蛋白的共同功能以及维与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关持结构有关 。 非保守残基非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。性研究。 探测突变蛋白质的探测突变蛋白质的结构整体性质结构整体性质，以鉴定突变，以鉴定突变残基。残基。 .（五）定位突变的应用（五）定位突变的应用 RNase T1的结构改造是分于设计中的一的结构改造是分于设计中的一个成功实例个成功实例 T1核糖核酸酶含有核糖核酸酶含有104个个aa残基，天然酶残基，天然酶有两对二硫键（有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的，日本大阪大学的Niskikawa等人
19、等人在在Tyr24和和Asn84位引入第三个二硫键，位引入第三个二硫键，热稳定性增加。热稳定性增加。 .T4噬菌体溶菌酶噬菌体溶菌酶 图2-3 T4溶菌酶的三维结构（Gassner, et al. 1996）红色强调的为螺旋结构域核心中被蛋氨酸置换的10个残基 T4溶菌酶的三维结构溶菌酶的三维结构红色红色强调的为强调的为螺旋中被置换的残基螺旋中被置换的残基突变引入二突变引入二硫键硫键(Cys54和和Cys97)去除去除Gly或引或引入入Pro (T )Ser38Asp和和Asn144Asp .例：甲基对硫磷水解酶例：甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MP
20、H ）结构和功能的研究结构和功能的研究 有机磷农药的长期广泛使用已经使很多水体及有机磷农药的长期广泛使用已经使很多水体及土壤被严重污染土壤被严重污染,而且直接影响到人们的身体健而且直接影响到人们的身体健康。康。有机磷水解酶有机磷水解酶(Organophosphorus Hydrolase, OPH)的的改造：改造：提高对特定底物的催化效率提高对特定底物的催化效率;扩大底物范围扩大底物范围;增加酶的稳定性增加酶的稳定性 Dong Y J, 2005Dong Y J, 2005 .目的和意义目的和意义 通过对通过对MPHMPH的结晶和三维结构的测定，研究的结晶和三维结构的测定，研究MPHMPH活性
21、中心的结构，并通过定点突变及活性测定活性中心的结构，并通过定点突变及活性测定来验证，确定来验证，确定MPHMPH的结构和功能的关系的结构和功能的关系, ,为为MPHMPH的改的改性和利用提供科学的依据和良好的材料。性和利用提供科学的依据和良好的材料。 OPHOPH是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，药降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对硫磷水解酶的广泛应用。基对硫磷水解酶的广泛应用。.载体污染序列的分析载体污染序列的分析在
22、进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如在进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如果含有载体序列，需截去后再进行其他分析。果含有载体序列，需截去后再进行其他分析。http:/www.ncbi.nlm.nih. gov/ VecScreen/VecScreen.html在线分析。在线分析。Match to Vector: Strong Moderate Weak Segment of suspect origin: Segments matching vectorStrong match: 1-113, 3838-4071 bp。真正的目标序列：真正的目标序列：1
23、143,837 bp。 .1 The nucleotide sequence including mpd from Pseudomonas sp. WBC-3 2 Plesiomonas sp. M6的甲基对硫磷水解酶基因的甲基对硫磷水解酶基因 匹配区为匹配区为1341866，Identities=Identities=1720 bp1733 bp( (99) ) CDS: 331aa (398-1393bp) 3 Pseudomonas putida的甲基对硫磷降解蛋白基因的甲基对硫磷降解蛋白基因 匹配区为匹配区为1681393，IdentitiesIdentities= =10251026
24、( (99) ) CDS: 341aa (368-1393bp) 两个基因的两个基因的CDSCDS不一致，分别匹配于不一致，分别匹配于MPHMPH的的398398，368-1393bp368-1393bp同源序列搜索（同源序列搜索（Blastn :114-3837 bp Blastn :114-3837 bp ）123.甲基对硫磷水解酶基因的分析甲基对硫磷水解酶基因的分析结论：结论：MPHMPH基因的基因的CDS: 3981393CDS: 3981393（331aa)331aa)以以13931393位的位的TGATGA结束的可能的结束的可能的ORFORF有八个有八个,MW:34.4kD ATG
25、:368,MW:34.4kD ATG:368，398 bp398 bp典型的启动子序列结构典型的启动子序列结构:TTGCAA-17:TTGCAA-17个氨基酸个氨基酸-TATACT (320-365bp)-TATACT (320-365bp)典型的核糖体结合位点典型的核糖体结合位点:AGGA (381 bp):AGGA (381 bp).MPHMPH与与OPHOPH的序列比对的序列比对二者同源性仅为二者同源性仅为13.6%13.6%，确定，确定MPHMPH是一个有别于是一个有别于OPHOPH的蛋白质。的蛋白质。二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解二者在功能上的相似性不能用蛋白
26、的一级序列的相似性加以解释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中活性中心结构的相似性有关。活性中心结构的相似性有关。 .MPHMPH信号肽的分析预测：神经网算法信号肽的分析预测：神经网算法结论：信号肽（结论：信号肽（1-351-35氨基酸）。氨基酸）。 C值表示切割点的可能性，S值表示具有信号肽的可能性.MPHMPH信号肽的分析预测：马尔可夫算法信号肽的分析预测：马尔可夫算法信号肽的一般结构为：信号肽的一般结构为：正电荷的正电荷的n-regionn-region；疏水的疏水的h-regionh-region；中性极性的中性极性
27、的c-regionc-region。 MPHMPH具有典型的信号肽的三部分结构具有典型的信号肽的三部分结构结论：可能的信号肽为结论：可能的信号肽为1-351-35氨基酸。氨基酸。. su75001:1_UV 0 200 400 600 800100012001400mAU0.05.010.015.020.0ml mlmAUMPHMPH的凝胶过滤柱层析图的凝胶过滤柱层析图 .MPHMPH的的SDS-PAGESDS-PAGE分析分析.Buffer(ug/ml)Buffer(ug/ml)MPH (ug/ml)MPH (ug/ml)NiNi4.1484.1484.3704.370MgMg14.3451
28、4.34515.06015.060MnMn0.0750.0750.4970.497FeFe1.1581.1582.3882.388CoCo0.0500.0500.0400.040CuCu10.81210.8129.2969.296ZnZn0.2010.201272.122272.122MPHMPH中金属种类及含量的测定中金属种类及含量的测定MPHMPH的浓度：的浓度：0.217mg/ml ,0.217mg/ml ,结论：结论：MPHMPH中含锌离子中含锌离子.硒代蛋氨酸硒代蛋氨酸MPHMPH的表达纯化的表达纯化 在诱导表达时添加高浓度的与蛋氨酸有在诱导表达时添加高浓度的与蛋氨酸有共同的合成途径
29、的终产物赖氨酸、苏氨酸、共同的合成途径的终产物赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸，以及与赖氨酸具有相互协同作用异亮氨酸，以及与赖氨酸具有相互协同作用的苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸来抑制正常菌的苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸来抑制正常菌株中蛋氨酸的合成，迫使细菌利用培养基中株中蛋氨酸的合成，迫使细菌利用培养基中外源添加的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸外源添加的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸MPHMPH。由于硒代蛋氨酸不稳定而易发生氧化，因此在纯化时由于硒代蛋氨酸不稳定而易发生氧化，因此在纯化时需要加快速度，并在缓冲液中添加还原剂以保持还原需要加快速度，并在缓冲液中添加还原剂以保持还原性环境，如性环境，如5 mM 5 mM
30、- -巯基乙醇。巯基乙醇。.甲基对硫磷水解酶（甲基对硫磷水解酶（MPHMPH）P P1 1晶型的晶体晶型的晶体.甲基对硫磷水解酶（甲基对硫磷水解酶（MPHMPH）P P4 43 32 21 12 2晶型的晶体晶型的晶体.硒代蛋氨酸硒代蛋氨酸MPHMPH的晶体的晶体.同源二聚体同源二聚体每个亚基含有一个由两个二价金属离子组成的中心。每个亚基含有一个由两个二价金属离子组成的中心。Ala 36 Ala 36 为为MPHMPH的的N N末端第一个氨基酸（不具有末端第一个氨基酸（不具有1-351-35个个氨基酸序列的结构）。氨基酸序列的结构）。甲基对硫磷水解酶（甲基对硫磷水解酶（MPHMPH）三维结构图
31、）三维结构图.aba: The binuclear metal center of the OPH; b: The binuclear metal center of the MPH;MPH与与OPH双核金属中心结构比较双核金属中心结构比较.a: The supposed leaving group subsite of the MPH; b: The leaving group subsite of the OPH;abMPHMPH与与OPHOPH双核金属中心附近氨基酸比较双核金属中心附近氨基酸比较推测：推测：Trp 179Trp 179，Phe 196Phe 196，Phe 119Phe
32、119是是MPHMPH底物结合部底物结合部位的氨基酸位的氨基酸.甲基对硫磷水解酶中三个芳香族甲基对硫磷水解酶中三个芳香族 氨基酸的功能研究氨基酸的功能研究 在在MPHMPH三维结构基础上可以看出三维结构基础上可以看出Trp 179Trp 179，Phe 196Phe 196，Phe Phe 119119的芳香侧链伸向的芳香侧链伸向MPHMPH双核金属中心的上方，处于活性中心的双核金属中心的上方，处于活性中心的入口处，推测为底物结合部位的氨基酸。入口处，推测为底物结合部位的氨基酸。 通过定点突变将以上三个不同位点通过定点突变将以上三个不同位点突变成含有芳香环的类突变成含有芳香环的类似氨基酸及不具
33、芳香环侧链很小的丙氨酸似氨基酸及不具芳香环侧链很小的丙氨酸，从而获得了针对，从而获得了针对Trp Trp 179179，Phe 196Phe 196和和Phe 119Phe 119三个位点的六个突变体三个位点的六个突变体W179FW179F、W179AW179A、F196WF196W、F196AF196A、F119WF119W和和F119AF119A，系统比较了突变体与野生酶的，系统比较了突变体与野生酶的催化动力学特点，以确定三种氨基酸在催化动力学特点，以确定三种氨基酸在MPHMPH的结构和功能中的作的结构和功能中的作用。用。.mpdmpd基因表达载体的构建基因表达载体的构建.W179FW17
34、9F，W179AW179A，F196WF196W和和F196AF196A突变体基因的扩增突变体基因的扩增.MPHMPH及其突变体的表达菌株诱导表达产物的及其突变体的表达菌株诱导表达产物的SDS-PAGESDS-PAGE分析分析.E.coli E.coli BL21(DE3)/pET5a-BL21(DE3)/pET5a-mpdmpd表达产物的表达产物的SDS-PAGESDS-PAGE分析分析.EnzymeSpecific activity（U/mg） Km(uM) Kcat(s-1) Kcat/Km(s-1mM-1) MPH50.5100%37.4100%37.1100%993.3100%W17
35、9F34.568.4%48.4129.6%30.682.5%632.663.7%W179A8.416.6%74.6199.6%7.921.3%106.110.7%F196W64.0126.8%50.0133.7%52.8142.3%1056.8106.4%F196A4.89.6%107.4287.2%5.013.5%46.84.7%F119W29.257.8%28.275.5%20.856.1%738.874.4%F119A32.063.3%41.1109.9%23.863.9%578.358.2MPHMPH及其突变体的比活力及动力学参数及其突变体的比活力及动力学参数 .实验小结实验小结 利用
36、生物信息学手段对利用生物信息学手段对MPHMPH的结构基因的编码序列进行的结构基因的编码序列进行分析，确定分析，确定MPHMPH是一种结构未知的蛋白质，并在对其性质进是一种结构未知的蛋白质，并在对其性质进行分析预测的基础上，通过对行分析预测的基础上，通过对MPHMPH的纯化、结晶获得的纯化、结晶获得P P1 1晶型晶型和和P P4 43 32 21 12 2晶型两种单晶以及硒标记晶型两种单晶以及硒标记MPHMPH的晶体。通过合作利用的晶体。通过合作利用P P4 43 32 21 12 2晶型的晶体解析了晶型的晶体解析了MPHMPH的三维结构证实了的三维结构证实了MPHMPH与与OPHOPH功能
37、功能上的相似性可能与两种蛋白三维结构的相似性有关的推测。上的相似性可能与两种蛋白三维结构的相似性有关的推测。同时，在同时，在MPHMPH三维结构的基础上，三维结构的基础上，推测并通过定点突变及活推测并通过定点突变及活性测定验证了性测定验证了Trp 179Trp 179和和Phe 196Phe 196属于属于MPHMPH活性中心的底物结活性中心的底物结合部位关键氨基酸，合部位关键氨基酸，Phe 119Phe 119在与底物结合中的作用不明显。在与底物结合中的作用不明显。以上对于以上对于MPHMPH的结构和功能的关系的研究为的结构和功能的关系的研究为MPHMPH的改性和利用的改性和利用提供科学的依
38、据。提供科学的依据。.二、蛋白质分子拼接 例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonic antigen），是由七），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的各结构域之间由柔韧性较大的“铰链铰链”片段相片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。有利于它的细胞识别和粘合作用。 .英国剑桥大学的英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作
39、了实验功地在抗体分子上作了实验 (人源化抗体人源化抗体).http:/ engnieer.htm（抗体工程)DON:小麦镰刀菌毒素小麦镰刀菌毒素. GGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGG GGGGSGGG GGGGS GGG VH VH VH VH VH VH VL VL VL VL VL VL.VHVHVHVHVHVHLinker 12aa VVVVVVLinkerLinker 3-12aa 3aaVVVVVHVHVHVH.1pET20b(+)3716bporiAmpf1 originXXhhooI IE Ec co oR RI I Linker XhoSal ISalEc
40、oRIXho双酶切双酶切different length1pET20b(+)/DON-ScFv4464bporiAmpf1 originV VL LL Li in nk ke er rV VH HX Xh ho oI IE Ec co oR RI IS Sa al lI IS Sa al lI I连接连接 技术路线技术路线EcoRI.转 化筛选、检测 蛋白质的诱导生成 表达载体构建 感受态细胞的制备纯 化亲和力初步测定. PCR扩增重链、轻链策略 Linker VH VLP3P4P5P6P7P8P1P2. PCR反应体系及反应条件50 L反应体系如下：10Taq PCR Buffer 5 Ld
41、NTP (2.5 mM) 3 L Forward Primer (20 mM) 1 LReverse Primer (20 mM) 1 LTemple 1 L rTaq 0.3 L Add ddH2O to a final volume of 50 L PCR循环条件为：94 5 min，1个循环；94 45 s，58 30s，72 45 s，31个循环； 72 40 s，25个循环； 72 7 min，1个循环。取PCR产物5 L，1.0的琼脂糖电泳检测。. VH 和VL的PCR扩增结果 7500150001000025001002505007501000200010002505000. 菌
42、落PCR重组子验证 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 200010007505002501002000200010001000750750500500250250100. 改体抗体在大肠杆菌改体抗体在大肠杆菌BL21BL21中的表中的表达及其纯化达及其纯化 1 2 3 4 5 6 7 897.4 KD66.2 KD42.7 KD31 KD. 改体抗体的改体抗体的ELISAELISA初步测定初步测定312456789101112.单链抗体单链抗体 抗体：v是体液免疫应答的主要效应分子。v由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）组成。. 单
43、链抗体（scFv）： 抗体可变区的重链（VH）与轻链（VL）通过一段多个氨基酸残基构成的弹性短肽（Linker）相连，融合表达出来的抗体片断。 .双特异性单链抗体双特异性单链抗体 能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。抗体复合物）称为双特异性单链抗体。 本实验将能够各自产生抗本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗毒素和抗ZEN毒毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与与DON和和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。异性单链抗体。ZEN :
44、玉米赤霉烯酮玉米赤霉烯酮DON:小麦镰刀菌毒素小麦镰刀菌毒素.技术路线技术路线 DON和和ZEN抗体基因的提取抗体基因的提取 目的基因片段引物的设计目的基因片段引物的设计 PCR扩增目的片段扩增目的片段 制备感受态细胞制备感受态细胞 酶切目的片段、载体，酶切目的片段、载体，linker连接连接 转化连接产物转化连接产物 酶切验证重组子酶切验证重组子 表达、纯化蛋白表达、纯化蛋白.载体的构建载体的构建1pET-32a(+)5900bpf1 originAmptrxAlacoriXho INco I1重 组 子7500bpDONZENtrxAlacoriAmpf1 oriAnti-ZEN gene
45、Anti-DON gene Xho EcoR Sal Nco 连连 接接 Linker.PCR扩增扩增Anti-DON基因基因 1 2 M20001000 (bp)800 bp750250100500.PCR扩增扩增Anti-ZEN基因基因 M 1 220001000750500250100(bp)750 bp.重组验证重组验证.PCR验证验证以重组质粒为模板，进行以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的基因的PCR分析。分析。.双特异性抗体的表达双特异性抗体的表达. 我们知道我们知道, , 蛋白质的空间结构受其氨基酸序蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制列控制, , 而功能又与结构密切相关
46、。而功能又与结构密切相关。 如果能够找到构造蛋白质结构的方法如果能够找到构造蛋白质结构的方法, , 我们我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质, , 这这就是蛋白质全新设计问题。就是蛋白质全新设计问题。第三节 全新蛋白质设计. 蛋白质从头设计概念蛋白质从头设计概念 从头设计能够根据生物分子的活性位点特征从头设计能够根据生物分子的活性位点特征产生产生一系列的结构片段一系列的结构片段，通过连接这些结构片段通过连接这些结构片段可以构成一个可以构成一个全新分子全新分子；或者在结合腔内对一个；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。已知的结构骨架进
47、行化合物的衍生化。 从头设计方法可以生成全新的分子结构。从头设计方法可以生成全新的分子结构。.全新蛋白质设计包括全新蛋白质设计包括 一、全新蛋白质设计方法一、全新蛋白质设计方法 二、蛋白质结构的从头设计二、蛋白质结构的从头设计. 全新蛋白质设计过程全新蛋白质设计过程设计目标设计目标序列生成序列生成结构预测结构预测合成合成构建模型构建模型检测检测.（一）全新蛋白质设计程序模拟模拟 分析分析 设计设计 实验实验 一、全新蛋白质设计方法一、全新蛋白质设计方法 PDA循环循环（Protein Design Automation） .（二）全新蛋白质设计目标的选择 依据设计的目的可以分为依据设计的目的可
48、以分为 ： 从头从头结构结构设计设计 从头从头功能功能设计设计 .从头结构设计从头结构设计 中心问题：中心问题： 稳定及独特的三维结构稳定及独特的三维结构 序列；序列； 基本障碍：基本障碍： 线性聚合构象熵；线性聚合构象熵； 解决方法解决方法：（1）使相互作用的强度）使相互作用的强度 与数目达到最大；与数目达到最大； （2）共价交叉连接。）共价交叉连接。.从头设计方法包含的步骤从头设计方法包含的步骤1 1、活性位点分析：活性位点分析：对结合位点的具体的化学信对结合位点的具体的化学信息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空间相互关系都必须充分考虑。间相互关
49、系都必须充分考虑。 2 2、配体分子构建：、配体分子构建：采用不同的片段选择和分子采用不同的片段选择和分子构建方法，产生相应的分子结构。构建方法，产生相应的分子结构。 3 3、评价：、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为合成实验的对象。也可以将之做良的结果作为合成实验的对象。也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的优化。新一轮计算的起点进行进一步的优化。.二级模块单元的自组装二级模块单元的自组装 最简单、最直接的策略最简单、最直接的策略合成单一合成单一二级结构单元二级结
50、构单元 优点优点 无论是从设计或合成看，是简单的；无论是从设计或合成看，是简单的； 容易合成。容易合成。 缺点缺点 涉及蛋白质的稳定性；结构的简单重复。涉及蛋白质的稳定性；结构的简单重复。.二、蛋白质结构的从头设计 （一）蛋白质结构的从头设计原则（一）蛋白质结构的从头设计原则 1二级结构的设计原则二级结构的设计原则 螺旋螺旋 折叠片折叠片 转角转角 2超二级结构和三级结构的设计原则超二级结构和三级结构的设计原则.螺旋螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：端：aa+N端：端：aa-N帽帽C帽帽.折叠片折叠片 (HPHPH或或PHPHP，5-10aa).转角转角（ Pro、Gly中断中
